專利名稱：一種高通量篩選反向蛋白質芯片、制備方法及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種適用于高通量篩選的蛋白質芯片、其制備方法及利用所述芯片的檢測方法。
背景技術：
蛋白質芯片是繼基因芯片之后，作為基因芯片的補充發展起來的一種生物芯片技術。蛋白質是生命活動的執行者和體現者。在轉錄時，一個基因可能以多種mRNA形式剪接，并且同一蛋白質可能以多種形式進行翻譯后的修飾，一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目可以超過基因組的數目。因此，蛋白質表達譜比mRNA表達譜更能真實地反映生物體的功能機制。蛋白質芯片提供了在同一時相分析整個蛋白質組的可能。
現有蛋白質芯片的制作，首先是按照預先設計的方式將大量不同的蛋白質點陣于固相載體上，形成蛋白質的陣列，即蛋白質芯片，然后往芯片上加入帶有特殊標記的蛋白質分子，通過兩者的結合進行蛋白質的功能分析、檢測和用于藥物篩選。
生命科學研究的微量化、自動化技術、組合化學以及新的檢測方法為新藥發現賦予了新的概念--高通量藥物篩選。目前，高通量藥物篩選是發現新藥的重要途徑。一個新的藥物作用靶點發現后，建立一個穩定、敏感、可信的高通量篩選模型，然后對大量未知樣品進行針對該靶點的篩選，是高通量藥物篩選的主旨。
目前，蛋白質芯片應用于藥物篩選的方法主要是，將大量功能蛋白質點陣于片基上，然后均勻覆蓋待測樣品，觀察其與某種蛋白質的作用。這種方法的局限性在于一次只能篩選一種樣品，同時不能對大量未知樣品針對一個藥物作用靶點蛋白進行篩選，從某種意義上說，這種方法是蛋白質芯片對蛋白質功能研究的一個補充，所以說這種方法還不是完全意義上的高通量藥物篩選蛋白質芯片。
本發明所述反向蛋白質芯片應用于高通量藥物篩選，將進一步提高藥物篩選的效率，會大幅度降低成本，這種技術會為高通量藥物篩選注入新的活力。

發明內容
為了解決現有蛋白質芯片技術在高通量藥物篩選中的局限，本發明提供一種針對一個藥物作用靶點可以對多個樣品同時進行篩選的反向蛋白質芯片。
本發明的另一目的在于提供一種簡單、低成本、易于實施的用于高通量新藥篩選的反向蛋白質芯片的制備方法。
本發明所述反向蛋白質芯片由固相載體和作為藥物作用靶點的蛋白質，其中所述作為藥物作用靶點的蛋白質預先固定在固相載體的表面。
利用本發明所述反向蛋白質芯片的制備和檢測包括如下步驟1)在固相載體表面均勻固定一層作為藥物作用靶點的蛋白質薄層；2)在允許待測樣品與藥物靶點相互作用的條件下，將待測未知樣品點陣于蛋白質層上，使待測樣品通過與作為靶點的蛋白質的相互作用而被結合；3)洗去未與蛋白質結合的樣品后，再均勻覆蓋用于與藥物作用靶點的蛋白質相結合的經標記的配體物或底物；4)檢測所述固相載體上是否存在不帶有上述標記的暗點或區域，作為有待進一步復篩的陽性樣品。
本發明所述的反向蛋白質芯片中，所述被均勻固定在固相載體上的蛋白質可以選自任一已知可以作為藥物作用靶點的蛋白質，例如膜受體、核受體和酶，如G蛋白偶聯受體、雌激素受體LOX-1膜蛋白受體等。
在本發明的一個具體實施方案中，所述反向蛋白質芯片上采用氧化型低密度脂蛋白受體LOX-1，用于篩選LOX-1受體拮抗劑。在本發明又一具體實施方案中，所述反向蛋白質芯片上采用雌激素受體ER，用于篩選雌激素受體拮抗劑。本發明另一具體實施方案中，所述反向蛋白質芯片上采用彈性蛋白酶，用于篩選彈性蛋白酶抑制劑。
本領域普通技術人員知曉，能夠利用本發明所述反向蛋白質芯片，通過點陣于其上預先固定有藥物作用靶蛋白質的芯片進行高通量篩選的樣品，包括但不限于，化合物、天然產物(包括動物、植物、礦物、微生物及其他原材料)和中藥提取物。
本領域普通技術人員知曉，用于本發明所述反向蛋白質芯片檢測的標記物，應當為能夠與所選靶點蛋白質具有特異性結合反應的配體、DNA和酶底物，只要所述標記物不影響待測物與所述蛋白質之間的相互作用。
本領域普通技術人員知曉如何選擇適于本發明所述反向蛋白質芯片的所述固相載體。具體的，能夠用于本發明的固相載體包括但不限于表面帶有活化基團的玻璃片、醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、尼龍膜、硅片、鋼片等。事實上，本領域普通技術人員知曉，不影響所選靶蛋白質與待測樣品結合以及標記物對靶蛋白質標記的任一固相載體均適于本發明。
本發明所述反向蛋白質芯片突破了目前蛋白質芯片進行藥物篩選不能上通量的局限，實現了一種藥物高通量篩選分子或細胞模型對大量待篩樣品在生物芯片上的處理。
與現有技術相比，本發明的優越性在于第一，將高通量新藥篩選嫁接于蛋白質芯片上，可以大大提高新藥篩選的通量，一張蛋白質芯片可以容納至少10個384孔板的容量；第二，本方法耗材少、成本低，一方面極大地減少了建立高通量篩選模型所需蛋白質的用量，同時也節省了待測樣品的用量，每個點樣品量僅納升級；第三，本發明蛋白質芯片適合于任何受體-配體、受體-DNA和酶-底物相互作用的藥物篩選系統。


圖1藥物高通量篩選蛋白質芯片的制備原理示意圖。
圖2用藥物高通量篩選蛋白質芯片進行膜受體-配體模型的高通量篩選。
以下結合附圖和實施例，以舉例方式進一步說明本發明所述反向蛋白質芯片及利用所述芯片的檢測方法。
實施例1以膜受體為靶點的高通量藥物篩選蛋白質芯片以及利用所述芯片對凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)拮抗劑的篩選已知，LOX-1是一種主要由內皮細胞表達的膜受體，氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)是其天然配體。以LOX-1-oxLDL相互作用建立分子模型，高通量篩選LOX-1受體拮抗劑。具體制被檢測過程如下1.載體玻片的表面清潔處理與活化先將載玻片放入1∶10稀釋了的去污劑溫水中，以超聲處理5min，然后用蒸餾水多次沖洗，再以100％甲醇沖洗，洗凈的玻片放于烘箱內烘干。將玻片浸入第一層包被液APTS(氨基丙基三甲氧基硅烷，aminopropyltrimethoxysilane)中浸泡10min，再以95％乙醇洗滌，放入空氣中干燥，然后于真空烘箱內80℃烘烤2小時。
氨基化后的玻片浸入第二種包被液BS3中(雙磺琥珀酰亞胺基辛二酸酯，bis-sulfosuccinimidyl suberate)，室溫下浸泡20min，然后在無塵烘箱內37℃干燥15min。
這樣制好的活化玻片與蛋白連接(共價結合)后，以蒸餾水沖洗6h，蛋白連接仍保持良好。可在干燥條件下保存6周。
2.蛋白質芯片的制備
將制備的膜受體蛋白LOX-1(0.5mg/ml)，均勻鋪于活化玻片表面，使之均勻吸附于活化玻片上。為了避免受體蛋白失活，此過程在冰上進行，然后4℃晾干，用PBS沖洗3次，晾干后將待測樣品(化合物、天然產物、中藥提取物等)點陣于如上制備的包被LOX-1的玻片上。
點樣完成后，將玻片置于濕度30-40％的芯片雜交盒，室溫反應。20min后以PBS沖洗玻片3次，每次1min。晾干后加入適量熒光標記的配體，覆以蓋玻片使之均勻分布后，置于濕度30-40％、封閉芯片雜交盒，15min后以PBS沖洗玻片3次，每次1min。
點樣區域四個角及中心分別點有兩個陽性對照，為未標記熒光的LOX-1特異性配體，oxLDL。
3.檢測將如上述加入待測樣品的蛋白質芯片在芯片掃描儀(Scaner-3，中科院光電所)以激發520nm，發射560nm波長檢測熒光強度。
一旦陽性待測樣品與LOX-1結合后，競爭了LOX-1與其熒光標記的特異配體oxLDL結合的位點，則掃描結果顯示為暗點，而背景顯示熒光亮度。
如圖2所示，四周及中心陽性對照物與LOX-1結合，競爭了熒光標記配體的與其結合，顯示為暗點，未結合待測樣品被洗去后顯示為強的綠色熒光背景。
4.結果分析運用Photoshop分析軟件，每一張蛋白芯片設有數個陽性對照，以陽性對照暗點的灰度值為標準，分析樣品暗點的灰度值。
陽性抑制率％＝(陽性藥OD值/陰性對照OD值)*100％樣品抑制率％＝(樣品OD值/陰性對照OD值)*100％以陽性藥抑制率為閾值為標準確定復篩樣品。
實施例2以雌激素受體為靶點的高通量篩選蛋白質芯片以及利用所述芯片對雌激素受體拮抗劑的高通量藥物篩選。
雌激素受體(ER)是核受體的一種，當雌激素受體α(ERα)配體結合區(LBD)或DNA結合區(DBD)與其特異性配體或DNA結合后，引起熱休克蛋白(HSP)結構改變，使其不能與共激活因子結合，抑制基因轉錄。
1.載體表面的清潔處理與活化同實施例1。
2.蛋白質芯片的制備將純化的ERα(0.5mg/ml)，均勻鋪于活化玻片表面，使之均勻吸附于活化玻片上，為了避免受體蛋白失活，此過程在冰上進行，然后4℃晾干，用PBS沖洗3次，晾干后將待測樣品點陣于包被ERα的玻片上。
點樣完成后，將玻片置于濕度30-40％的芯片雜交盒，室溫反應。20min后以PBS沖洗玻片3次，每次1min。晾干后加入適量FAM(N-3-fluoranthylmaleimide，Sigma)標記的DNA，包含雌激素反應元件(ERE)的雙鏈寡核苷酸，覆以蓋玻片使之均勻分布后置于濕度30-40％、封閉芯片雜交盒，15min后以PBS沖洗玻片3次，每次1min。芯片陽性對照為未標記的ERE。
3.檢測將經上述處理的反向蛋白質芯片在芯片掃描儀以激發488nm，發射508nm波長檢測熒光強度。因為陽性待測樣品與ERα結合后，競爭了其DBD位點，所以掃描結果顯示為暗點，而背景顯示藍色熒光亮度。
4.結果分析運用Photoshop分析軟件，每一張蛋白芯片設有數個陽性對照，以陽性對照暗點的灰度值為標準，分析樣品暗點的灰度值。
陽性抑制率％＝(陽性藥OD值/陰性對照OD值)*100％樣品抑制率％＝(樣品OD值/陰性對照OD值)*100％以陽性藥抑制率為閾值為標準確定復篩樣品。
實施例3以彈性蛋白酶為靶點的高通量篩選蛋白質芯片以及利用所述芯片進行彈性蛋白酶抑制劑的高通量藥物篩選。
1.載體玻片的表面清潔處理及活化先將載玻片放入10％的NaOH中，95％乙醇清洗，烘干。以1％的瓊脂糖溶液3ml鋪板，待其凝固后浸泡于蒸餾水中，每2小時換水一次，6小時以后取出置37℃恒溫孵育箱中孵育，烘干后取出。
2.彈性蛋白酶芯片的制備將經如上處理的玻片，表面均勻鋪一層彈性蛋白酶(0.5mg/ml)溶液，置于芯片雜交盒中，加水保濕，置4℃冰箱中使彈性蛋白酶自然吸附(5小時)，吸附后取出，pH7.4的Tris-HCl溶液沖洗3次，晾干，使用芯片點樣儀將待測樣品(中科院電工所)點陣于玻片上，置于芯片雜交盒中反應，15min后用PH7.4的Tris-HCl溶液沖洗3次。
晾干后在玻片上均勻鋪彈性蛋白酶底物-彈性蛋白，重新置于芯片雜交盒中，加水保濕，置37℃恒溫孵育箱中孵育，每2小時加水一次，8小時后取出，觀察結果。
3.檢測彈性蛋白酶與底物反應后呈黃色，而當所點樣品抑制彈性蛋白酶活性時，點樣處應不顯色，使用顯微照相機攝像，PhotoShop分析，點樣處為暗點，蛋白芯片背景為黃色。
4.結果分析運用Photoshop分析軟件，每一張蛋白芯片設有數個陽性對照，以陽性對照暗點的灰度值為標準，分析樣品暗點的灰度值。
陽性抑制率％＝(陽性藥OD值/陰性對照OD值)*100％
樣品抑制率％＝(樣品OD值/陰性對照OD值)*100％以陽性藥抑制率為閾值為標準確定復篩樣品。
權利要求
1.一種用于高通量篩選的反向蛋白質芯片，其由固相載體和作為藥物作用靶點的蛋白質組成，其中所述作為藥物作用靶點的蛋白質預先固定在固相載體的表面。
2.權利要求1所述的反向蛋白質芯片，其作為靶點的蛋白質以薄層形式均勻固定于固相載體表面。
3.權利要求1所述的反向蛋白質芯片，其中所述作為靶點的蛋白選自膜受體蛋白、核受體蛋白和酶。
4.根據權利1所述的反向蛋白質芯片，其中固相載體選自表面帶有活化基團的玻璃片、醋酸纖維薄膜、硝酸纖維薄膜、硅片、尼龍膜、鋼片。
5.一種利用權利要求1所述反向蛋白質芯片進行高通量檢測的方法，包括步驟1)在固相載體表面均勻固定一層作為藥物作用靶點的蛋白質薄層；2)在允許待測樣品與藥物靶點相互作用的條件下，將待測未知樣品點陣于蛋白質層上，使待測樣品通過與作為靶點的蛋白質的相互作用而被結合；3)洗去未與蛋白質結合的樣品后，再均勻覆蓋用于與藥物作用靶點的蛋白質相結合的經標記的配體物或底物；4)檢測所述固相載體上是否存在不帶有上述標記的暗點或區域，作為有待進一步復篩的陽性樣品。
6.根據權利要求5所述的方法，其中將待測樣品點陣形式分布于預先固定有作為藥物靶點的蛋白質的固相載體表面。
7.權利要求5所述的方法，其中將經標記的特異性配體均勻覆蓋于吸附有蛋白和樣品的固相載體上。
8.權利要求5所述的方法，其中經標記的配體選自蛋白質，DNA和酶底物。
9.權利要求8所述的方法，其中所述的標記物選自熒光指示劑、同位素、生物素。
10.一種制備權利要求1所屬高通量篩選用反向蛋白質芯片的制備方法，包括以下步驟1)常規清潔處理固體載片，然后表面酰基化處理而使其具有吸附蛋白活性；2)將受體蛋白(或酶)均勻固定于活化后的固體載片表面；3)將待測樣品點陣于固定受體蛋白的載片，置于濕度30％-40％封閉芯片雜交盒，溫度和反應時間由具體蛋白反應條件而定，洗去未與受體蛋白結合的樣品；4)加入熒光標記的特異性配體(或DNA，或酶底物)，覆以蓋玻片使之均勻分布于固體載片，置于濕度30％-40％封閉芯片雜交盒，溫度和反應時間由具體受體-配體(或受體-DNA，或酶-底物)反應條件而定，洗去未與受體蛋白結合的熒光標記配體(或DNA，或底物)。
全文摘要
本發明涉及一種適用于高通量藥物篩選的蛋白質芯片，及其制備技術及其檢測方法。具體的，本發明的高通量篩選反向蛋白質芯片是將藥物作用靶點相關的蛋白質以薄層形式均勻固定于固相載體表面，然后在蛋白層上以點陣形式分布待篩選樣品，將選自熒光、同位素以及其他可檢測物質的標記物標記的受體蛋白特異性配體與固相載體表面受體蛋白進行結合，檢測結果顯示背景為結合配基均勻信號，待測樣品與受體蛋白有特異性結合后，陽性結果為反向的暗點。采用本發明所述反向蛋白質芯片技術能夠實現一個藥物作用靶點對化合物、天然產物、中藥提取物在生物芯片上的大量快速篩選。
文檔編號G01N33/50GK1719253SQ20041006355
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月9日 優先權日2004年7月9日
發明者杜冠華, 張天泰, 周勇 申請人:中國醫學科學院藥物研究所