專利名稱：高靈敏度的免疫檢測方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測體液樣品中細胞因子的時間分辨熒光免疫檢測(TR-FIA)方法，特別是涉及利用熒光銪絡合物高靈敏度檢測體液樣品中細胞因子的檢測方法。
背景技術：
正常人血漿等體液中存在的游離細胞因子或趨化因子的濃度接近或低于常規ELISA測定的檢測界限。例如，據報道通過應用檢測界限為6皮摩爾(pM)的傳統ELISA測定，從正常人血漿中檢測不到IL-8(Leonard等(文獻1))。為了正確測定體液樣品中趨化因子的濃度，增大測定靈敏度以及減低來源于體液樣品的非特異性背景就成為主要課題。
近年來，開發了利用銪絡合物的時間分辨熒光免疫檢測方法，并正用于臨床上(Kropf等(文獻2))。游離的、形成了絡合物的銪離子(Eu3+)的放射波長為615nm，不會受到激發波長(340nm)或某種蛋白質造成的短壽命背景熒光(350nm～600nm)的影響，所以很合適。基于該原理的1種分析方法是商業化的DELFIA(解離-增強型鑭系熒光免疫檢測；Pharmacia)，例如可用于TNFα和IL-6的測定。但是，應用DELFIA時不能成功地正確測定這些細胞因子在血漿中的濃度(Ogata等(文獻3))。
最近，松本等研究小組開發了4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-鄰-三苯基(BHHCT)-Eu3+絡合物作為標記化合物。該絡合物可與蛋白質直接結合，通過時間分辨型熒光測定可以進行高靈敏度分析(Yuan等(′97)(文獻4)和Yuan等(′98)(文獻5))。BHHCT具有β-二酮結構，與Eu3+結合的穩定系數高達1010M-1。所生成的Eu3+絡合物的壽命超過400微秒(μs)，吸收和發射波長的最大值為330nm和615nm，顯示了極良好的性質。說明該絡合物可用于檢測人血漿中腫瘤標志物甲胎蛋白(Yuan等(′98)(文獻5))和免疫球蛋白E(IgE)(Yuan等(′97)(文獻4))的檢測。但是，還不知道應用上述Eu3+絡合物檢測體液樣品中細胞因子的例子。
基質細胞來源的因子-1(SDF-1)是屬于趨化因子家族的細胞因子，它是1993年從骨髓基質細胞系初次克隆出來(Tashiro等(文獻6))。SDF-1是CXCR4受體的主要配體(Bleul等(文獻7)和Oberlin等(文獻8))。已知該受體作為I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)亞群的CD4共受體(coreceptor)起作用。最近的研究表明，SDF-1基團的多態性與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)進展的延遲相關。(例如，Winkler等(文獻9)和Martin等(文獻10))。但是，其作用機制有多種闡釋，尚未確立。
還有文獻指出SDF-1在造血、心血管和神經系統的胚胎形成中起著重要作用(例如，Zou等(文獻11)和Tachibana等(文獻12))。另一方面，現狀是SDF-1在成人組織中的生物學功能還有許多尚未闡明。
如上所述，開發一種正確定量、監測體液樣品中SDF-1的技術，將對加深理解SDF-1起到極為重要的作用。不言而喻，對其它趨化因子和細胞因子也一樣，體液樣品的正確測定方法將會為學術和臨床作出貢獻。基于這樣的觀點，期望有以更高靈敏度檢測細胞因子的測定方法。
發明公開本發明的目的是解決上述課題，并提供高靈敏度且能簡便檢測體液樣品中細胞因子的方法。
根據本發明，它提供用于檢測體液樣品中細胞因子的時間分辨熒光免疫檢測(TR-FIA)方法，該方法包括在固相上形成依次結合了(a)具有固相結合部分和能與細胞因子結合的區域的第一抗體，(b)該細胞因子，(c)具有能與該細胞因子結合的區域和生物素結合部分的第二抗體，(d)具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的結合物，(e)鑭系金屬離子的復合物的步驟；以及測定與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的熒光的步驟；這里，該熒光結構部分可用通式(I)表示-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n-1-X (I)(式中，R為能與蛋白質形成共價鍵的官能團殘基，Ar為具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數，X為氟原子或通式(II)表示的基團)-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R- (II)
本發明的一實施方案中，上述鑭系金屬離子為銪。
本發明的一實施方案中，上述熒光結構部分可用通式(III)表示。
-R-Ar-(C(C＝O)-CH2-C-(＝O)-CnF2n+1)2(III)(式中，R、Ar及n與上面相同)本發明的一實施方案中，上述熒光結構部分為4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-鄰-三苯基。
本發明的一實施方案中，上述結合物中，相對于每1分子鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，存在10～60單位上述熒光結構部分。
本發明的一實施方案中，上述測定熒光的步驟在不解離在固相上形成的復合物的情況下進行。
本發明的另一實施方案中，上述測定熒光的步驟是在解離在固相上形成的復合物后進行。
本發明的一實施方案中，上述細胞因子為趨化因子家族的細胞因子。
本發明的一實施方案中，上述細胞因子可以是CXC趨化因子。
本發明的一實施方案中，上述細胞因子為基質細胞來源的因子-1(SDF-1)。
或者，本發明的一實施方案中，上述細胞因子可以作為血循環中的可溶性因子存在，并且是微量即具有生物活性的細胞因子。
或者，本發明的一實施方案中，上述細胞因子可以是粒細胞-巨噬細胞-單集落刺激因子(GM-CSF)或白細胞介素2(IL-2)。
本發明的一實施方案中，上述體液樣品為血漿或全血。
本發明的一實施方案中，還包括在上述形成復合物的步驟之前，用樣品稀釋緩沖液稀釋上述體液樣品的步驟；該樣品稀釋緩沖液是pH7.3～8.3的0.01～0.1M Tris-HCl，并含有0.1～0.3％牛血清白蛋白，0.05～0.2％疊氮鈉，以及0.5～1.5％的氯化鈉。
本發明的一實施方案中，還包括在上述形成復合物的步驟之前，在上述細胞因子的非變性溫度條件下，對上述體液樣品進行加熱處理的步驟。
本發明的一實施方案中，還包括在測定熒光的步驟之前，用洗滌緩沖液洗滌在上述固相上形成的復合物的步驟；該復合物洗滌緩沖液是pH8.5～9.5的0.01～0.1M Tris-HCl，并含有0.01～0.1％的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯。
本發明的一實施方案中，上述固相是有50～200ng/cm2IgG吸附能力的微量滴度板。
另外，根據本發明，還提供用于檢測體液樣品中細胞因子的時間分辨熒光免疫檢測(TR-FIA)方法的試劑盒，該試劑盒包括具有固相結合部分和能與細胞因子結合的區域的第一抗體，具有能與該細胞因子結合的區域和生物素結合部分的第二抗體，具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的結合物，以及鑭系金屬離子；這里，該熒光結構部分可用通式(I)表示-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X(I)(式中，R為能與蛋白質形成共價鍵的官能團殘基，Ar為具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數，X為氟原子或通式(II)表示的基團)-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R- (II)附圖的簡單說明

圖1a是表示SDF-1校正曲線的圖。應用實施例2所述的TR-FIA法測定標準SDF-1。數據是3次測定的平均值。
圖1b是與圖1a相同的校正曲線，是特別在低濃度范圍內測定的。圖中的直線，Y＝1.3X+1.2(×10000a.u.)，r＝0.995。數據是3次測定的平均值。
圖1c是為了監測SDF-1的生物學活性，按照實施例3所述的方案測定EL-4細胞表面的CXCR4表達的結果圖。通過與沒有人SDF-1β時進行培養的對照相比較，計算出平均熒光強度(MFI)的減少％。數據是1輪實驗進行3次后選擇的中間值。
圖1d表示為了評價TR-FIA對SDF-1的特異性，測定各種趨化因子的結果圖。數據是測定3次的平均值。
圖2是針對SDF-1的，TR-FIA與DELFIA進行比較的圖。圖2的左側是以人SDF-1β為標準溶液，用與實施例2中使用的相同組合的捕捉抗體和檢測抗體，用DELFIA和TR-FIA體系進行測定的結果。圖2的右側表示用兩種體系檢測血漿樣品中內源性SDF-1濃度的結果。圖2右側所示的樣品中未添加標準SDF-1。圖2右側的數據和表1的數據是對不同樣品進行測定的結果。數據是3次測定的平均值。
圖3a是表示抗凝劑和蛋白酶抑制劑對用TR-FIA測定SDF-1的影響。用EDTA(1mg/ml)，肝素(30IU/ml)，檸檬酸鹽(0.38％檸檬酸鈉)及具有抑肽酶(1μg/ml)的EDTA(1mg/ml)中的任一種處理血漿樣品。黑柱和斜線柱是對兩個不同樣品進行測定的結果。數據是3次測定的平均值。
圖3b表示血漿樣品的預加熱對用TR-FIA測定SDF-1的影響。測定前55℃預先溫育血漿樣品30分鐘，或不加熱直接進行測定。24份體液樣品來自健康的日本志愿者。數據是2次測定的平均值。
圖3c表示血漿樣品的稀釋對用TR-FIA測定SDF-1的影響。用緩沖液4稀釋各樣品。5份體液樣品來自健康的日本志愿者。數據是3次測的平均值。
圖4a表示作為SDF-1的對照的，用ELISA定量IL-8時血細胞的影響。將IL-8添加到血漿樣品后，混合細胞沉積物或血漿。37℃溫育15分鐘后，對血漿中的可溶性IL-8進行定量。白方塊是未與細胞沉積物或血漿混合的標準樣品，黑圓圖表示與血漿混合的樣品，白圓圈表示與細胞沉積物混合的樣品。數據是4次測定的平均值。
圖4b是作為SDF-1的對照的，用ELISA對MCP-1進行定量時血細胞的影響。向血漿樣品中添加MCP-1后，與細胞沉積物或血漿混合。37℃溫育15分鐘后對血漿中的可溶性MCP-1進行定量。符號與圖4a相同。數據是測定4個復本的均值。
圖4c表示在SDF-1的TR-FIA定量中血細胞的影響。向血漿樣品中添加SDF-1后，與細胞沉積物或血漿混合。37℃溫育15分鐘后，對血漿中的可溶性SDF-1進行定量。符號與圖4a相同。數據是測定4個復本的均值。
圖5表示36個健康日本志愿者的人血漿中SDF-1的水平。測定前，于55℃對所有的血漿樣品進行30分鐘熱處理。數據是2輪不同測定的各3次測定的平均值。
圖6表示人血漿樣品中Protein G-Sepharose引起的IgG耗竭的影響。將從7個健康日本志愿者獲取的血漿樣品與Protein G-Sepharose在冰上一起溫育30分鐘，離心分離，測定上清中的SDF-1量。斜線柱和黑柱分別表示非加熱樣品和加熱(55℃30分鐘)樣品。
圖7表示GM-CSF的校正曲線。用TR-FIA方法測定標準GM-CSF。數據是3次測定的平均值。
圖8是IL-2的校正曲線。用TR-FIA法測定標準IL-2。數據是3次測定的平均值。
實施本發明的最佳方式以下，對本發明進行更詳細的說明。
本發明的方法基于時間分辨熒光免疫檢測(TR-FIA)方法。
“時間分辨熒光免疫檢測”是應用如本發明中鑭系金屬離子絡合物的能放射長壽命熒光的熒光化合物，通過免疫學反應標記測定對象物，在較短壽命的背景熒光消失后，對來自標記物的熒光信號進行時間分辨型測定的測定方法。
本發明的方法尤其適于高靈敏度檢測體液樣品中的細胞因子。“體液樣品”是指從動物，優選從哺乳動物，尤其是從人體采集的液態物質。代表例有血液(即全血)及其分級物血漿和血清，以及腦脊髓液、膽汁、羊水、胸水、腹水、呼吸道內分泌液、骨髓液、乳汁、淚液、鼻腔分泌物、心內膜液、關節內包液、唾液、精液、尿等。動物來源的培養細胞的上清液等也包括在體液樣品中。本發明的方法在應用全血、血漿、血清或腦脊髓液時，尤其是應用全血或血漿時效果顯著。稱為體液樣品時，通常包括生物體液自身和用生物體液適宜的載體進行稀釋等處理后的液態樣品兩者。
“細胞因子”是指在生物體細胞間負責信息傳遞的蛋白質性化學物質。對于每種細胞因子來講，靶細胞表面上表達其特征的受體，通過與受體結合而顯示細胞增殖、分化等生理活性。統稱為“造血因子”的一組誘導血細胞分化和增殖的細胞因子包括包含粒細胞-巨噬細胞-單集落刺激因子(GM-CSF)的集落刺激因子(CSF)、干細胞因子、促紅細胞生成素、促血小板生成素等。調控淋巴細胞的白細胞介素包括IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18等。統稱為“生長因子”的一組細胞因子包括TGF-β家族、EGF家族、FGF家族、IGF家族、NGF家族、血小板來源的生長因子(PDGF)、肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)等。統稱為“腫瘤壞死因子”的一組細胞因子包括TNF-α、TNF-β等。統稱為“干擾素”的一組細胞因子包括INF-α、INF-β、INF-γ等。其它已知的細胞因子有內皮素、膠質細胞株來源的神經營養因子(GDNF)等。細胞因子中，使任一種功能上成熟的血細胞具有化學趨避性的一組細胞因子稱作趨化因子。按照其N末端所保存的半胱氨酸的位置，將趨化因子分為CC、CXC、C、CXXXC4類。
本發明的方法中的檢測對象可以是上述趨化因子中的任一種。再者，屬于上述細胞因子一組的新發現的成員，或者不屬于上述細胞因子一組的新發現的細胞因子也是本發明方法中的檢測對象。尤其是，本發明的方法適用于在血循環中以可溶性性因子存在、微量即具有生物學活性、與多種疾病相關的細胞因子。
本發明方法中檢測對象的例子有屬于上述趨化因子家族的細胞因子，尤其是CXC趨化因子，但不一定限于這些分類。本發明中最優選的檢測對象的例子為SDF-1。
本發明的方法中，為了選擇性捕捉、標記體液樣品中所期望的細胞因子，在固相上形成包含該細胞因子的復合物。具體而言，含有細胞因子的復合物是由以下成分在適宜的固相上形成的(a)具有固相結合部分和能與細胞因子結合區域的第一抗體；(b)細胞因子；(c)具有能與細胞因子結合的區域和生物素結合部分的第二抗體；(d)具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的結合物；以及(e)鑭系金屬離子。
以下，對各成分進行說明。
首先，作為“固相”可應用任意形狀和材質的固體物質，只要是能進行抗體的結合且不妨礙上述復合物的形成以及后述的熒光測定即可。為了便于測定方法的實施，代表性的可應用多孔型微量滴度板，也可應用填充了珠子的柱子(珠子的材質為葡聚糖、瓊脂糖等，但并不限于此)等其它形狀的物質。本發明中尤適宜應用具有中等程度的蛋白質吸附能力的微量滴度板。這里的“中等程度”的吸附能力是指當免疫球蛋白G(IgG)作為標準蛋白質被吸附時，代表性的吸附約50～約200ng/cm2，優選約15～約150ng/cm2，更優選約90～約120ng/cm2的吸附能力。微量滴度板的材質優選聚苯乙烯，但不限定于此。
成分(a)“第一抗體”是以與上述固相結合的狀態存在，且通過抗原-抗體反應能與所期望的細胞因子結合的抗體。根據這種概念，將第一抗體稱做“捕捉抗體”。本說明書中的“抗體”包含多克隆抗體、單克隆抗體、Fab、(Fab)2、嵌合抗體等任意類型的免疫球蛋白(Ig)和免疫球蛋白來源的分子。術語“抗體”用意廣泛，只要與免疫球蛋白同樣能與細胞因子結合，以該細胞因子作配體的受體也包含在內。優選的抗體例子是多克隆抗體或單克隆抗體。針對各種細胞因子的抗體均有市售，例如可購自R&D System Inc.(Minnesota，US)、Dako Immunoglobulinsals(丹麥)、PharMingen(California，US)、Southern Biotechnology Associates(Alabama，US)等公司。或者可以利用免疫動物、雜交瘤技術等常規方法制備針對所期望的細胞因子的抗體。
結合到固相的方法可按照常規的方法進行，例如將第一抗體直接涂布到微量滴度板上。第一抗體中的“固相結合部分”代表性的指其一部分吸附到固相上的、抗體的Fc區域，但并不限于此。例如也可應用能分別與固相和抗體的一部分結合的雙功能性的連接分子。
成分(b)，即存在于體液樣品中的所期望的細胞因子，代表性的是通過與第一抗體結合而固定到固相上。細胞因子不必以游離狀態與第一抗體接觸，例如可與后述的第二抗體結合后與第一抗體結合。這樣品發明中復合物的形成不限于各成分結合的次序。
本發明者們發現當把含有所期望細胞因子的體液樣品暴露給能與該細胞因子結合的抗體時，用適當的緩沖液將之稀釋成適宜的濃度對于高靈敏度檢測細胞因子是很重要的。用緩沖液稀釋體液樣品的稀釋倍數，當用(體液樣品∶緩沖液)的體積表示時，代表性的約1∶1～約1∶30，優選約1∶2.5～約1∶20，更優選約1∶5～約1∶15的范圍。稀釋倍數的最適值要根據體液樣品的種類和細胞因子的種類而變動，還要依賴于樣品稀釋緩沖液的組成。
適宜的樣品稀釋緩沖液為由三(羥甲基)氨基甲烷(略作“Tris”)和無機酸構成的弱堿性緩沖液，代表性的為Tris-HCl。其pH，代表性的為約7.0～約8.0，優選約7.3～約8.3，更優選約7.5～約8.1。代表性的濃度為約0.005～約0.2摩爾(M)，優選約0.01～約0.1M，更優選約0.025～約0.075M。
樣品稀釋緩沖液還包含適量的血漿蛋白質成分和鹽類。血漿蛋白質成分代表性的為血清白蛋白，優選牛血清白蛋白(BSA)。其濃度代表性的為約0.05～約0.5％左右，優選約0.1～約0.3％，更優選約0.15～約0.25％。鹽類代表性的為疊氮鈉(NaN3)和氯化鈉(NaCl)。NaN3的濃度代表性的為約0.02～約0.4％，優選約0.05～約0.2％，更優選約0.05％～約0.15％。NaCl的濃度代表性的為約0.2～約3％，優選約0.5～約1.5％，更優選約0.6～約0.12％。
不用說樣品稀釋緩沖液的組成不限定于上述條件，也允許該領域的技術人員進行便宜的各種改變。例如，可用其它堿金屬或堿土金屬對應的鹽置換上述鈉鹽的一部分或全部。樣品稀釋緩沖液的pH和各成分的濃度等的最佳值可根據檢測對象細胞因子的種類而不同，還依賴于體液樣品的稀釋倍率。該領域的技術人員可在通常條件設定方法的范圍內使之最優化。
成分(c)“第二抗體”具有能與細胞因子結合的區域，并與第一抗體一起以夾心形式捕捉所期望的細胞因子。第一抗體與第二抗體最好是互不干涉，識別同一細胞因子不同部位(即不同表位)的抗肽抗體。因此，與所期望的細胞因子的結合能力相關，第一抗體和第二抗體的適當組合是很重要的。例如，可用全長細胞因子，或用已知或預測包含多個表位的細胞因子的片段免疫適當的動物，從獲得的多種多克隆抗體中選擇適當的組合。或者從識別表位不同的多個單克隆抗體中選擇適當的組合。這樣的選擇不是特別難進行，例如可通過制備細胞因子的標準溶液，對需檢測的抗體組合用常規ELISA進行預實驗。
第二抗體還具有生物素結合部分，并可通過熒光測定檢測細胞因子。根據這這種概念，又把第二抗體叫做“檢測抗體”。生物素是一種維生素，又叫做維生素H或輔酶R，并可與肽等的氨基形成酰胺鍵。第二抗體可通過應用常規方法，對檢測對象細胞因子的抗體進行生物素化和純化來進行制備。第二抗體中的“生物素結合部分”是指生物素自身和結合了生物素的抗體的一部分(代表性的為Fc區域)。必要時可應用能與生物素和抗體的一部分結合的雙功能性連接分子連接這兩部分。
這里，“第二抗體”不必為單一分子，可表示任意結構單位，只要能履行必要的功能(即，通過抗原-抗體反應或配體-受體結合反應可結合細胞因子的功能，以及攜持生物素的功能)即可。上述“第一抗體”也同樣。例如，本發明中可應用抗所期望細胞因子的抗體和能與該抗細胞因子抗體結合的生物素化抗IgG抗體的組合。此時，抗細胞因子抗體與生物素化抗IgG抗體的組合統稱為“第二抗體”。生物素化抗IgG抗體具有普遍適用性，所以很方便。另外，當針對所期望細胞因子的抗體因某種原因對生物素化反應有抵觸性時，組合應用生物素化抗IgG抗體則可以奏效。另一方面，從簡化測定程序、且使細胞因子的檢測靈敏度最大化的觀點出發，優選應用單一分子作為第二抗體。
成分(d)的“結合物”是具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的任意結構單位，代表性的是鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白與熒光結構部分直接或間接通過共價鍵連接起來的分子。眾所周知，鏈霉抗生物素蛋白通常是由放線菌產生的分子量約6萬的蛋白質，具有很強地與生物素結合的性質。但是，本發明中的“鏈霉抗生物素蛋白”對微生物來源不作限定，只要它基本上維持與生物素結合的能力，可包含其它微生物來源的相應蛋白質及其修飾物。眾所周知，通常抗生物素蛋白是卵白中包含的分子量約7萬的蛋白質，也具有很強地與生物素結合的性質。本發明中的“抗生物素蛋白”不限于天然的卵白蛋白質，只要能基本上維持與生物素結合的能力，也包含其修飾物。
由上述原則可知，本發明的方法也可通過應用具有能與細胞因子結合的區域和鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白結合部分的抗體替代成分(c)，以及通過應用具有生物素和能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的結合物替代成分(d)來完成。
成分(d)的結合物中能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分是指相應的熒光化合物與鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白間直接或間接形成共價鍵，通過這樣的反應而得到的部分結構。熒光結構部分可用下面的通式(I)表示。
-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X(I)(式中，R為能與蛋白質形成共價鍵的官能團殘基，Ar是具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數，X為氟原子或通式(II)表示的基團)
-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R(II)上述通式中，規定殘基R的“能與蛋白質形成共價鍵的官能團”是指能與蛋白質中氨基酸殘基具有的任意反應性基團(代表性的如氨基、羧基和羥基)反應并能形成共價鍵的任何有機官能團。這樣的官能團的例子包括下面所示的基團-N＝C＝S，-N＝C＝O， -N2X，-N3， -SO3CF3，-NH2， -SO2X，-SO3H，-SH，-X，-CX3， (其中，X選自鹵素原子、-OSO2CH3、-OSO2F、-OSO2CF3、-OSO2C4F9或-OSO2PhCH3-p(Ph為苯基)，RA選自烷基、鏈烯基、芳香基、或芳烷基，RB選自亞烷基、亞烯基、亞芳基或亞芳烷基，p為0～5，q為2～10)上述通式中，規定Ar的“具有共軛雙鍵體系的烴基”是指至少有3個共軛的雙鍵的烴基，代表性的是至少有1個苯環的2價或3價芳香族烴基。對烴基的碳原子數上限沒有特殊限制，代表性的在約50個以內，優選在約30個以內。這里，1個以上的碳可被雜原子(例如氧或硫原子)所取代。烴基Ar的例子包括下列基團。
(m為1～6的整數) 優選烴基Ar為3價，熒光結構部分可用通式(III)表示。
-R-Ar-(C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1)2(III)這里，較優選的Ar例子是在4，4′位與2個β-二酮基結合的O-三苯基。同樣優選的Ar的其它例子是將2個β-二酮放置在與O-三苯基中的β-二酮位置近似或基本上同一空間距離的3價芳香族烴基。
上述通式中，n為1以上的整數，代表性的為1～6，優選2～4。
本發明中特別優選的熒光結構部分是4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-鄰-三苯基。它是從相應的熒光化合物4，4′-二(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-氯磺酰基-鄰-三苯基(略作“BHHCT”)獲得的。BHHCT的結構式如下所示 提供上述熒光結構部分的所期望的熒光化合物，可利用常規的有機合成反應而合成。代表性的是按照包括以下2個步驟的工序合成(第一步)在適當的溶劑中以及堿性催化劑(例如甲基鈉鹽)存在的條件下，使乙酰基化的芳香族化合物與過氟羧酸酯進行Claisen縮合反應，生成乙酰基的CH3被過氟羧酸酯化了的β-二酮化合物。
(第二步)將能與蛋白質形成共價鍵的官能團導入β-二酮化合物中。例如，通過應用氯磺酸進行氯磺化反應而使芳香環的氫被置換為氯磺酰基(ClSO3-)。必要時在各步后進行重結晶、沉淀等純化。
所得熒光性化合物依賴于在上述第二步中導入的官能團種類，在適當的條件下可與蛋白質進行反應，從而提供目的熒光結構部分。例如，氯磺酰基與蛋白質中的氨基在堿性反應條件下很容易地形成酰胺。
本發明中，成分(d)的結合物可通過用熒光化合物直接標記鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白而制備。或者通過首先結合鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白與其它蛋白質(例如牛血清白蛋白)后，再對之進行標記而制備。鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白與其它蛋白的結合可按常規方法進行，如應用戊二醛進行交聯反應。
用熒光化合物標記蛋白質的反應，代表性的是將蛋白質溶解到已調節至適于反應的pH(例如，進行氯磺化時，pH約為9左右)的緩沖液中后，在該緩沖液中以期望的摩爾比量添加溶解到適宜溶劑(例如乙醇或二甲基甲酰胺)的熒光化合物來進行。可通過調節相對于蛋白質的熒光化合物的摩爾比以及通過調節含有熒光化合物的溶液的濃度，控制每1個蛋白質分子結合的熒光化合物的比率(亦稱為“結合比”)。該結合比相當于本發明的結合物中每1分子鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的熒光結構部分的單位數。結合比代表性的為5-100單位，優選10～60單位。結合比過低的話，得不到足夠高的細胞因子檢測的靈敏度。另一方面，結合比過高也不會提高檢測靈敏度。
本發明方法中，通過成分(e)鑭系金屬離子與上述熒光結構部分絡合，在固相上形成復合物。鑭系金屬離子的例子包括銪(Eu)、釤(Sm)、鋱(Tb)和鏑(Dy)。其中，優選銪。通常鑭系金屬離子預先與成分(d)的結合物絡合，在此狀態下用于復合物的形成。也就是說，通常在上述鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和生物素形成結合的時間點，熒光結構部分已形成了挾持Eu3+的絡合物。但并不妨礙與此相反的程序。
本發明人等發現將上述在固相上形成的復合物進行熒光測定之前，用適宜的緩沖液進行充分洗滌，對于高靈敏度的細胞因子的檢測是重要的。這里所講的適當的復合物洗滌緩沖液是由Tris和無機酸構成的堿性緩沖液，代表性的是Tris-HCl。其pH，代表性的為約8.2～約9.8，優選約8.5～約9.5，更優選約8.7～約9.4。其濃度，代表性的是約0.005～約0.2M，優選約0.01～約0.1M，更優選約0.025～約0.075M。
復合物洗滌緩沖液還含有適量的、具有蛋白質促溶能力的非離子表面活性劑。該非離子表面活性劑，代表性的為聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯，優選商品名為“Tween(注冊商標)20”的市售聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(分子量約1200)。也可優選應用與Tween(注冊商標)20基本上具有同一性質(例如羥基值為約95～約115，皂化值為約35～約55，HLB為約15～約18(親水性-疏水性平衡))的其它非離子表面活性劑。非離子表面活性劑的濃度代表性的為約0.005～約0.2％，優選約0.01～約0.1％，更優選約0.025～約0.075％。
不言而喻，復合物洗滌緩沖液的組成并不限定于上述條件，允許該領域的技術人員進行便宜的各種改變。PH和各成分的濃度等的最佳值可根據作為檢測對象的細胞因子的種類而不同。這種最優化可由該領域的技術人員在通常條件設定方法的范圍內進行。
以下，概括說明本發明方法中在固相上形成復合物的代表性程序的例子。
1)將用適宜的涂布用緩沖液稀釋的第一抗體的溶液施用到固相上(例如96孔微量滴度板的孔)，通過孵育，將一抗固定到固相。作為涂布緩沖液，例如可應用含有適量NaCl的磷酸緩沖液。孵育的條件，代表性的是約2～6℃左右20小時以上。
2)接著用洗滌緩沖液洗滌數次涂布了第一抗體的固相表面。作為洗滌緩沖液，例如可應用弱堿性的Tris-HCl，必要時可添加適量的具有蛋白質促溶能力的非離子表面活性劑。洗滌后將涂布了的固相保存于-20℃，直到需要進行測定之前。
3)如上所述，優選預先用稀釋緩沖液對含有檢測對象細胞因子的體液樣品進行適當稀釋。將該體液樣品以及根據需要將該細胞因子的標準溶液施用到已涂布了的固相上進行孵育。孵育的條件，代表性的是約35～39℃左右約40分鐘～約2小時左右。孵育后與上述同樣，用洗滌緩沖液數次洗滌固相表面。
4)其后，將用適當的緩沖液稀釋的第二抗體溶液施用到固相上。這里，優選應用與上述樣品稀釋緩沖液相同的溶液。孵育條件與體液樣品的上述孵育條件相同。孵育后與上面同樣，用洗滌緩沖液數次洗滌固相表面。
5)將結合物與鑭系金屬離子的鹽溶液混合，形成熒光性絡合部分。用適當的溶劑稀釋絡合的結合物后，施用到固相上進行孵育。孵育條件與體液樣品和二抗的上述各孵育條件相同。孵育后，如上所述，用適當的復合物洗滌緩沖液洗滌在固相上形成的復合物。
將由上述步驟得到的含有鑭系絡合物的復合物供給到固相或液相的時間分辨型熒光測定。該熒光測定的裝置可從市場上購買。測定條件是，代表性的是延遲時間為約0.2～約0.3毫秒(ms)，窗口時間為約0.2～約0.6ms，閃爍速度(flash rate)為約0.5～約1.5ms，激發波長為337.1nm(氮激光的波長)，測定波長為615nm。
進行固相熒光測定時，可將具有上述復合物的固相直接供給到熒光測定條件。進行液相熒光測定時，要通過用適當的解離溶液處理復合物，使含有熒光性絡合部分的結構單位游離到溶液中，再將該溶液提供給熒光測定條件。代表性的解離溶液是含有三烷基膦氧化物和陰離子表面活性劑的弱堿性水溶液。作為解離溶液的例子，可應用含有三(正辛基)膦氧化物(TOPO)和十二烷基硫酸鈉(SDS)的碳酸氫鈉(NaHCO3)水溶液。應用這樣的解離溶液，通過與具有上述復合物的固相例如在約45～55℃左右孵育約40分～約2小時，切斷上述鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和生物素的結合，使含有熒光絡合物部分的結合物游離到溶液中。
根據上述液相熒光測定，因為固相與熒光測定無關，所以其優點是固相種類及材質的選擇范圍更廣。另一方面，與固相熒光測定相比，液相熒光測定需要額外的步驟，所以程序復雜。再者，與固相熒光測定相比，因在用解離溶液處理的過程中容易受雜質的影響，液相熒光測定的靈敏度有一些降低。但是，可以認為固相和液相熒光測定各自所能達到的最大靈敏度，可以通過與測定相關的各種條件的組合來進行變動。
根據本發明，它還提供用于實施上述時間分辨熒光測定(TR-FIA)的試劑盒。通常，該試劑盒至少包括上述成分(a)、(c)、(d)和(e)作為構成物件。也就是說，將具有固相結合部分和能與細胞因子結合的區域的第一抗體，具有能與細胞因子結合的區域和生物素結合部分的第二抗體，具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白和能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的結合物，和鑭系金屬一起提供給測定者，使檢測體液樣品中的細胞因子的測定可以實施。必要時試劑盒還可包括測定對象細胞因子的標準品，上述各種緩沖液(特別是樣品稀釋緩沖液和復合物洗滌緩沖液)等。通常試劑盒的構成物件各自以適宜的方式貯存在容器內，與使用說明書或指示書一起作為一整體進行包裝。
根據本發明，使得正確且高靈敏度檢測體液樣品中的細胞因子，尤其是包含SDF-1的趨化因子的新方法可以應用。當用與下述實施例2基本上相同的條件進行檢測時，本發明方法中細胞因子的檢測界限代表性的為約100pg/ml以下，優選為約50pg/ml以下，更優選為約30pg/ml以下。同樣在與實施例2基本上相同的條件下進行檢測時，細胞因子測定的變動系數(CV)代表性的為約低于10％，優選約低于8％，更優選約低于7％。另外，當在與實施例6基本上相同的條件下進行檢測時，該細胞因子由血漿樣品的回收率代表性的為約70％以上，優選約80％以上，更優選90％以上。此外，于不同日期內在同一條件下重復測定4次同一個體來源的血漿樣品中細胞因子時，其測定值的變動優選在約10～約20％的范圍內。
如下述實施例所示，尤其對于SDF-1，與ELISA和DELFIA等傳統方法相比，本發明中通過利用熒光化合物BHHCT來源的Eu3+絡合物，可使血漿樣品中的檢測靈敏度改善2～3個數量級。正確把握SDF-1在體內的行為并闡明其生理功能，對深入理解HIV-1感染、開拓AIDS治療的新展望是極其重要的。很明顯本發明能對細胞因子的分子生物學的發展及應用作出極為有意義的貢獻。
此外，如下述實施例所示，根據本發明，通過應用熒光化合物BHHCT來源的Eu3+絡合物，可以與SDF-1同樣的高靈敏度測定趨化因子家族以外的細胞因子，例如在血循環中以可溶性因子存在、微量即保持生物活性、不僅與多種病理相關且已用于治療的細胞因子，且再現性良好。
實施例以下，結合實施例更具體地說明本發明。但這些實施例并不限定本發明。
實施例中使用的材料、裝置及測定條件如下抗體用包含人SDF-1β的殘基33～45(RFFESHIARANVK)的多克隆抗體原肽(Research Genetics，Alabama，U.S.)免疫兔子，以誘導抗SDF-1的抗血清。用親合柱純化抗血精，然后應用。針對人SDF-1β的山羊多克隆抗體購自R&D System Inc.(Minnesota，U.S.)。針對人粒細胞-巨噬細胞-單集落刺激因子(GM-CSF)的人單克隆抗體購自PharMingen(California，U.S.)。針對人白細胞介素2(IL-2)的單克隆抗體購自PharMingen(California，U.S.)。
趨化因子人RANTES、人MIP-1α和β、人MDC和人fractalkine購自DIACLONE Research(法國)。人IL-8購自ENDOGEN(Massachusetts，U.S.)。用市售的ELISA試劑盒來測定加入到血漿中的小鼠IL-8和小鼠MCP-1。小鼠IL-8購自Amersham Pharmacia Biotech(瑞典)，小鼠MCP-1購自PharMingen(California，U.S.)。小鼠SDF-1α、小鼠SDF-1β、人SDF-1α和人SDF-1β均由Genetics Institute(Massachusetts，U.S.)贈送。人GM-CSF購自PharMingen(Califomia，U.S.)。人IL-2購自PharMingen(California，U.S.)。
裝置及測定條件應用Wallac(法國)和Amersham PharmaciaBiotech的1420型ARVO多標記計數儀進行時間分辨型熒光測定。測定條件如下延遲時間0.20毫秒(ms)，窗口時間0.40ms，閃爍速度1.00ms。為了得到最靈敏的TR-FIA測定體系，測定了5種購自Nunc(丹麥)的微量滴度板。其中，polysorp板在標準人SDF-1β的測定中產生最敏銳的熒光信號。靈敏度的次序如下White C96 polysorp＞White C96 maxisorp＞White C8maxisorp＞Black F16maxisorp。以下實驗常用White C96maxisorp微量滴度板。(實施例1TR-FIA的預研究)最初試圖找出測定SDF-1的、基于ELISA的免疫檢測體系適用的固相結合捕捉抗體與檢測抗體的良好組合。為了這一目的，對多克隆兔抗SDF-一抗體和多克隆山羊抗SDF-一抗體共5種進行了各種組合。有3種組合可進行標準SDF-1的特異性檢測。但是ELISA測定時，SDF-1的檢測界限沒有超越約10～20ng/ml的范圍。通常，血漿中存在的SDF-1的水平遠遠低于該檢測界限。因此可以確定用ELISA測定事實上不能進行血漿樣品中SDF-1的檢測。
應用在上面找到的最佳多克隆抗體的組合，對通常的TR-FIA條件進行了如下改變后，進行SDF-1的檢測。(實施例2標準SDF-1的TR-FIA)為TR-FIA制備4種測定緩沖液。涂布96孔微量滴度板的緩沖液1(含有0.14M NaCl的0.15M磷酸緩沖液(PBS))；洗滌板的緩沖液2(含0.05％Tween 20的0.05M Tris-HCl，pH7.8)；洗滌緩沖液3(0.05MTris-HCl，pH7.8)；稀釋蛋白質溶液的緩沖液4(含有0.2％BSA，0.1％NaN3和0.9％NaCl的0.05M Tris-HCl，pH7.8)。
BHHCT的合成按照Yuan等(′98)(文獻5)所述的方法實施。鏈霉抗生物素蛋白-牛血清白蛋白(SA-BSA)結合物的制備，及用BHHCT對結合物的標記按照Yuan等(′97)(文獻4)所述的方法進行。將標記的結合物溶液于-20℃保存，使用前即刻用下述的緩沖液(緩沖液4)稀釋100倍。
應用兔抗人SDF-1β多克隆抗體或山羊抗人SDF-1β多克隆抗體作為捕捉抗體。它們各產生相似的結果。將用緩沖液1稀釋到10μg/ml的捕捉抗體溶液(各60μl)加到96孔微量滴度板的孔中，4℃保溫24小時。然后用緩沖液2將孔洗2次，用緩沖液3洗1次。這樣的用抗SDF-一抗體涂布的板子在-20℃至少可保存1個月。
將SDF-1標準溶液(50μl)吸到涂布的上述板中，37℃孵育1小時。用緩沖液2和3洗滌板子后，將50μl用緩沖液4稀釋1000倍的生物素化的山羊抗人SDF-1β多克隆抗體(用常規方法使上述R&D System的山羊抗體生物素化)加到孔中，37℃孵育1小時。孵育后，用緩沖液2洗2次板，然后用緩沖液3洗1次，然后加入50μl用BHHCT-Eu3+標記的BSA-SA溶液(50μl)，37℃孵育1小時。用含有0.05％Tween 20的0.05MTris-HCl(pH9.1)將板洗4次。應用1420型ARVO多標記計數儀對該培養板進行固相熒光測定。
通過上述TR-FIA得到的水性溶液中的SDF-1的校正曲線如圖1a和圖1b所示。應用TR-FIA時，SDF-1的檢測界限可通過以下計算式(Kropf等(文獻2))計算。
3×[S0]×SB/(S0-B)這里，[S0]為標準溶液的最低濃度SB為空白的標準偏差S0為最低濃度標準溶液的熒光信號強度B 為空白的熒光信號強度通過上式計算出TR-FIA的檢測界限為30pg/ml。這比上述參考例中的ELISA的檢測界限(約10-20ng/ml)低3個數量級。由于每孔應用50μl溶液，所以用TR-FIA檢測出的SDF-1蛋白質的最小量為1.5pg/孔。
在測定的重現性這一點上TR-FIA也有所改善。標準樣品在0.1ng/ml～1204ng/ml的濃度范圍內時，應用TR-FIA檢測SDF-1的變動系數(CV)＜7％。與此相對，上述參考例中，在10ng/ml～1000ng/ml的濃度范圍內，應用ELISA時的CV值超過10％；在0.1ng/ml～1024ng/ml的濃度范圍內，應用DELFIA(參照下述比較例)時的CV值也超過10％。
除了上述固相熒光測定外，對液相熒光測定也進行了研究。即，通過用酸性螯合的表示活性劑溶液(含有10μM TOPO和0.05％SDS的0.1MNaHCO3水溶液)處理按上述程序在固相上形成的熒光性復合物(抗SDF-1多克隆抗體-SDF-1-生物素化抗SDF-1多克隆抗體-BHHCT-Eu3+標記的BSA-SA)，使標記的BSA-SA結合物從固相上游離出來。用1420型ARVO多標記記數儀測定溶液中的結合物的熒光強度。此時的SDF-1檢測靈敏度約為100pg/ml，不如上述固相測定那么高。(實施例3人SDF-1β對CXCR4的下調)為了確認用實施例2中的TR-FIA測定SDF-1的測定值與標準SDF-1蛋白質生物活性的相關性，用EL-4細胞體外測定通過與SDF-1結合而誘導的SDF-1受體(CXCR4)的下調。
在人SDF-1β(1，10，20，40，100和1000ng/ml)存在或不存在的條件下，在補充了10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改進Eagle′s培養基(D′MEM)中培養EL-4細胞。37℃培養6小時后，用Fc-人SDF-1α嵌合蛋白和FITC結合山羊F(ab′)2抗人IgG(Southern BiotechnologyAssociates，Alabama，U.S.)對細胞表面上的CXCR4進行染色。用熒光細胞計數儀(FACSCalibur，BECTON DICKINSON，California，U.S.)進行熒光強度測定。通過計算CXCR4染色的平均熒光強度(MFI)減少％來評價CXCR4的下調。結果如圖1c所示。
圖1c顯示，與人SDF-1β一起培養的EL-4細胞中CXCR4的表達以用量依賴性方式下調。所得結果與以前的報道(HesseIgesser等(文獻13)和Amara等(文獻14))一致性良好，即SDF-1α和β分別以5～10nM和2.3～3.6nM的Kd值與CXCR4結合。(實施例4TR-FIA對SDF-1測定的特異性)為了確認TR-FIA對SDF-1的特異性，對以下各種趨化因子進行與實施例2同樣的TR-FIA測定CC趨化因子(小鼠MCP-1、人MIP-1α和β、人RANTES，人MDC)、CXC趨化因子(人IL-8、小鼠SDF-1α和小鼠SDF-1β、人SDF-1α和人SDF-1β)以及CXXXC趨化因子(人Fractalkine)。結果如圖1d所示。除SDF-1之外其它任何趨化因子均未看到熒光強度的顯著性升高。因此可以確定上述TR-FIA可高特異性檢測SDF-1。人和小鼠的SDF-1α和SDF-1β間存在交差反應性。(實施例5血漿樣品的制備)以下各實施例中使用的血漿樣品是用EDTA(1mg/ml血液)作抗凝劑，從36名18～30歲健康的志愿者(日本人)血液制備的。具體而言，在用0.1M EDTA涂層了的注射器中按每1ml采取血液為7μl填充含0.5MEDTA的PBS。將血采集到這樣的注射器中，室溫保存5分鐘，然后3000rpm離心10分鐘，得到血漿。-80℃保存血漿樣品，分析前立即用緩沖液4稀釋10倍，除非有其它指示。測定前不要反復凍融。(實施例6用血漿樣品進行的TR-FIA)應用SDF-1標準溶液和上述血漿樣品(來自5個個體)進行實施例2中所述的TR-FIA。與由標準溶液的測定求出的校正曲線(圖2左側所示黑圓線圖)進行對比，計算出血漿樣品中的SDF-1濃度。為了確認測定的準確性，再向各血漿樣品中加入0.4或0.8ng/ml的標準SDF-1進行測定，算出回收率。
添加標準SDF-1后所測定的血漿樣品的熒光強度如圖2右側(“TR-FIA”欄)所示。添加標準SDF-1前后血漿樣品的SDF-1濃度及回收率示于下述的表1中。結果表明與對標準溶液進行測定時相同，應用TR-FIA，從血漿樣品中也可檢測出SDF-1并且回收率極高。(比較例DELFIA對SDF-1的檢測)如無其它特殊情況，以下DELFTA的測定操作按制造者(AmershamPharinacia Biotech，以下稱作“APB公司”)的指示進行。洗滌時全部應用PBS/0.05％Tween 20。
將用PBS稀釋到10μg/ml的兔抗人SDF-1β抗體或山羊抗人SDF-1β抗體溶液(各60μl)吸附到透明的maxisorp板(Nunc，丹麥)中，4℃孵育24小時后，洗滌1次。接著用180μl DELFIA測定緩沖液(APB公司)于室溫至少處理30分鐘，以封閉非特異性結合。
洗板3次后，每孔加入50μl用DELFIA測定緩沖液稀釋的標準SDF-1或10倍稀釋的血漿，然后于4℃至少孵育6小時。將板洗3次后，添加100μl在測定緩沖液中稀釋到20ng/ml的Eu標記鏈霉抗生物素蛋白(APB公司)，然后室溫孵育30分鐘。洗板6次后，添加DELFIA增感溶液(APB公司)，從與固相結合的Eu標記抗體解離出Eu3+。將微量板緩慢振蕩5分鐘后，用時間分離型熒光儀(ARVO 1420)進行熒光測定。
由標準溶液測定所得校正曲線如圖2左側所示(黑方塊線圖)。按實施例2所述的計算公式算出的檢測界限為130pg/ml。應用DELFIA能檢測出標準溶液中的SDF-1，但靈敏度比TR-FIA低。但是，對血漿樣品(來自4個個體)進行測定時，均檢測不到內源性SDF-1。而且，向各血漿樣品中添加1.0ng/ml的標準SDF-1并進行測定時，其回收率約為20％以下，遠低于TR-FIA。
對添加標準SDF-1后的血漿樣品進行測定的熒光強度示于圖2的右側(“DELFIA”欄)。添加標準SDF-1前后的血漿樣品的SDF-1濃度和回收率示于表1中(圖2和圖1的數據中顯示的血漿樣品均進行了55℃、30分鐘的預熱)。
表1添加到人血漿中的SDF-1的回收率添加的標準 SDF-1的測定值預測的總SDF-1回收率SDF-1(ng/ml)(ng/ml) (ng/ml) (％)(a)TR-FIA0 1.08-1.0 2.102.08 1020 1.53-1.0 2.482.53 950 1.68-1.0 2.692.68 1010 1.87-1.0 2.832.87 960 2.14-1.0 3.113.14 97(b)DELFIA0 ＜D.L.
1.0 0.20＞1.0 ＜200 ＜D.L.
1.0 0.16＞1.0 ＜160 ＜D.L.
1.0 0.17＞1.0 ＜170 ＜D.L.
1.0 0.20＞1.0 ＜20<D.L低于檢測界限(130pg/ml)>(實施例7抗凝劑和蛋白酶抑制劑的影響)據報道，抗凝劑和蛋白酶抑制劑影響人血漿樣品中細胞因子的檢測(Thavasu等(文獻15))。為了研究TR-FIA對SDF-1的測定是否也受這些因素的影響進行了以下實驗。
向血漿樣品中添加乙二胺四乙酸(EDTA)(1.0mg/ml)、肝素(30IU/ml)、檸檬酸鈉(0.38％)或乙二胺四乙酸(EDTA)(1.0mg/ml)和蛋白酶抑制劑抑肽酶(1μg/ml)。應用與實施例2同樣的TR-FIA測定各添加樣品中的SDF-1。結果如圖3a所示。可以確實抗凝劑和蛋白酶抑制劑對用TR-FIA進行的血漿SDF-1的測定有顯著性影響。(實施例8血漿樣品預熱的影響)為了確保應用TR-FIA進行SDF-1測定在臨床應用中的安全性，有必要將存在于血液樣品中的HIV病毒滅活。于是研究了血漿樣品的預加熱對TR-FIA的影響。
首先，為了試驗SDF-1蛋白的熱穩定性，將SDF-1標準溶液分別置于0℃30分鐘，37℃30分鐘，55℃30分鐘，70℃30分鐘，100℃1分鐘，然后進行測定。觀察到在70℃30分鐘和100℃1分鐘的條件下檢測量降低，考慮是由于SDF-1的熱變性造成。另一方面，37℃或55℃加熱30分鐘時，可得到與不加熱樣品幾乎相同的校正曲線，不影響SDF-1的檢測量。
在以上結果的基礎上，測定前對24份血漿樣品(參照實施例5)于55℃進行30分鐘的預孵育或者不加熱，應用與實施例2同樣的TR-FIA對SDF-1進行測定。(預加熱在用緩沖液4稀釋血漿樣品前進行)。結果如圖3b所示。55℃30分鐘的預加熱可增大平均約20％的熒光強度。
該結果提示血漿樣品的SDF-1中至少有一部分以多聚體形式存在，和/或以與可熱解離或分解等的結合因子結合的形式存在。也許在這樣的多聚體和/或結合狀態下，SDF-1表位與抗體的結合受到抑制。(實施例9血漿樣品稀釋的影響)有關測定血漿樣品中IL-8和MCP-1的以往的研究(Thavasu等(文獻15)和Kajikawa等(文獻16))表明過低評價了非稀釋樣品的測定中趨化因子的存在量。所以，研究了血漿樣品的稀釋對應用TR-FIA測定SDF-1的影響。
用緩沖液4將5份不同個體的血漿樣品稀釋到1∶1～1∶20的各種比例，應用與實施例2同樣的TR-FIA測定SDF-1。結果如圖3c所示。當稀釋倍數由1倍增加到10倍時，可以看到幾乎一致性的檢測靈敏度的提高。另一方面，當稀釋倍率在10～20倍時，檢測靈敏度未增加。因此10倍稀釋(即1份血漿樣品用10份緩沖液4稀釋)可被評價為最有效的條件。(實施例10血漿樣品中添加血細胞時的影響)據報道，向全血中添加IL-8和MCP-1，這些趨化因子可被血細胞吸附(Amara等(文獻14)，Darbonne等(文獻17)和Neote等(文獻18))。于是，研究了是否能觀察到血細胞對SDF-1有同樣的吸收。
將250μl全血在微量離心機上離心，使細胞沉淀，取125μl上清組分的血漿。按預先設定的終濃度向125μl血漿中添加IL-8、MCP-1或SDF-1。然后將添加了這些趨化因子的血漿與125μl體積的細胞沉積物或125μl血漿混合，然后37℃孵育15分鐘。接著，將混合了細胞沉積物的樣品離心使細胞沉淀并分離。用ELISA對樣品中的可溶性IL-8和MCP-1進行定量，用TR-FIA對其中的SDF-1進行定量。結果如圖4a～圖4c所示。
IL-8和MCP-1添加量的大部分被血細胞吸收(圖4a和4b)。而與血細胞孵育后SDF-1的減少量低于10％(圖4c)。此外，在其它實驗中，將SDF-1直接添加到全血，孵育后分離血細胞，用TR-FIA進行定量時，與將SDF-1添加到血漿中的對照間沒有顯著性差異(數據未給出)。由以上可以確定SDF-1幾乎不被血細胞吸收。(實施例11血漿樣品的TR-FIA多次測定)對36份不同個體的血漿樣品進行55℃30分鐘的預加熱(參照實施例7)后，用與實施例2相同的TR-FIA測定SDF-1。結果如圖5c所示。人血漿中的SDF-1水平的平均值和標準偏差為0.85±0.26ng/ml。
在相同條件下，在不同日子對同一個體(3名)來源的血漿樣品重復測定4次，測定值的變動為10～20％的范圍。這表明TR-FIA對血漿SDF-1測定的可信度十分高。(實施例12血漿樣品中SDF-1和IgG的會合)據報道，與IL-8和MCP-1相關的，妨礙血漿樣品的免疫檢測的其它主要原因是與循環系統中的自身抗體結合或會合的可能性(Leonard等(文獻1)和Thavasu等(文獻15))。如下所述對SDF-1與血漿中IgG的會合進行評價。
將7個個體來源的血漿樣品不加熱或加熱處理(55℃30分鐘)后，與Protein G-Sepharose一起在冰上放置30分鐘，耗竭IgG。將樣品離心，取其上清組分。應用TR-FIA測定該上清中的SDF-1。與Protein G-Sepharose處理前的血漿樣品的測定值進行對比，求出熒光強度的減少度。結果如圖6所示。
圖6中斜線柱和黑柱分別表示非加熱樣品和加熱處理的樣品。可以看出，與加熱樣品相比，未加熱樣品易受Protein G-Sepharose處理的影響。通過耗竭非加熱樣品的IgG，TR-FIA可測定的SDF-1水平減少23～37％(平均30％)。而加熱處理的樣品相對應的減少度為6～22％(平均15％)。因此實施例8中顯示的預加熱的效果(圖3b)可以用以下的假說進行解釋。即，血漿樣品中一部分SDF-1與IgG會合存在，通過加熱解離，轉變成TR-FIA可以測定的可溶性形式。
其它實驗中，Protein G-Sepharose處理后，未觀察到加到血漿樣品中的標準SDF-1的顯著性減少(未列出數據)。因此，否定了SDF-1自身被Protein G-Sepharose吸附的可能性，及血漿樣品中的抗SDF-1 IgG以外的抗體或蛋白質被Protein G-Sepharose吸附，而SDF-1被它們吸附的可能性。
由以上結果可以理解用TR-FIA測定出的人血漿中SDF-1水平與血液中實際存在的生理性SDF-1的水平極其接近。(實施例13GM-CSF的TR-FIA)除應用抗人GM-CSF單克隆抗體作捕捉抗體和應用生物素化抗人GM-CSF單克隆抗體(按常規方法對上述PharMingen人抗體進行生物素化)外，與實施例2同樣將GM-CSF標準溶液(50μl)供給固相熒光測定，制作標準GM-CSF的校正曲線。結果如圖7所示。再用與實施例5同樣的方法由健康日本人志愿者的血液制備血漿樣品，按實施例9所述，用緩沖液4稀釋，并與標準溶液同樣用TR-FIA測定GM-CSF。結果表明，對GM-CSF也可進行高靈敏度的測定，并且得到了重現性良好的結果。(實施例14對IL-2的TR-FIA)除應用抗人IL-2單克隆抗體作捕捉抗體和應用生物素化抗人IL-2單克隆抗體(按常規方法使上述PharMingen人抗體生物素化)之外，與實施例2同樣，將IL-2的標準溶液(50μl)供給固相熒光測定，制作標準IL-2的校正曲線。結果如圖8所示。再用與實施例5同樣的方法由健康日本志愿者制備血漿樣品，按實施例9所述，用緩沖液4稀釋，并與標準溶液同樣通過TR-FIA測定IL-2。結果表明，對IL-2也可以進行高靈敏度的測定，并且可以得到重現性良好的結果。
產業上的實用性本發明提供能極其靈敏且簡便地檢測體液樣品中細胞因子，尤其是包括SDF-1的趨化因子的時間分辨熒光免疫檢測(TR-FIA)方法，以及用于該方法的試劑盒。該方法及試劑盒適用于作為可溶性因子存在于血液循環中的，微量即具有生物學活性并與多種病理相關的細胞因子。
(參考文獻列表)1.Leonard，E.J.等，(1996)METHOD 10150-1572.Kropf，J.等，(1991)Aanl.Biochem.197258-2653.Ogata，A.等，(1992)J.Immunol.Methods 14815-224.Yuan，J.等，(1997)Anal.Biochem.254(2)283-2875.Yuan，J.等，(1998)Anal.Chem.70(3)596-6016.Tashiro，K.等，(1993)Science 26600-6037.Bleul，C.C.等，(1996)Nature 382635-6388.Oberlin，E.等，(1996)Nature 382829-8339.Winkler，C.等，(1998)Science 279389-39310.Martin，M.P.等，(1998)Science 2.Zou，Y-R.等，(1998)Nature 393595-59912.Tachibana，K.等，(1998)Nature 393591-59413.Hesselgesser，J.等，(1998)J.Immunol.160877-88314.Amara，A.等，(1997)J.Exp.Med.，186139-14615.Thavasu，P.W.等，(1992)J.Immunol.Methods 153115-12416.Kajikawa，O.等，(1996)J.Immunol.Methods 19719-2917.Darbonne，W.C.等，(1991)J.Clin.Invest..Neote，K.(1994)Blood 8444-5權利要求
1.檢測體液樣品中細胞因子的時間分辨熒光免疫檢測(TR-FIA)方法，該方法包括在固相上形成依次結合了(a)具有固相結合部分和能與細胞因子結合的區域的第一抗體，(b)該細胞因子，(c)具有能與該細胞因子結合的區域和生物素結合部分的第二抗體，(d)具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的結合物，以及(e)鑭系金屬離子的復合物的步驟；以及測定與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的熒光的步驟；這里，該熒光結構部分可用通式(I)表示-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X (I)-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R- (II)式中，R為能與蛋白質形成共價鍵的官能團殘基，Ar為具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數，X為氟原子或通式(II)表示的基團。
2.權利要求1所述的方法，其中，上述鑭系金屬離子為銪。
3.權利要求1所述的方法，其中，上述熒光結構部分可用通式(III)表示；-R-Ar-(C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1)2(III)式中，R、Ar及n與權利要求1中的定義相同。
4.權利要求1所述的方法，其中，上述熒光結構部分為4，4′-二(1″，1″，1″，2″2″3″3″-七氟-4″，6″-己二酮-6″-基)-磺酰基-鄰-三苯基。
5.權利要求1所述的方法，其中，上述結合物中，相對于每1分子的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，存在10～60單位上述熒光結構部分。
6.權利要求1所述的方法，其中，上述測定熒光的步驟在不解離在上述固相上形成的復合物情況下進行。
7.權利要求1所述的方法，其中，上述測定熒光的步驟在解離上述固相上形成的復合物后進行。
8.權利要求1所述的方法，其中，上述細胞因子為屬于趨化因子家族的細胞因子。
9.權利要求8所述的方法，其中，上述細胞因子為CXC趨化因子。
10.權利要求9所述的方法，其中，上述細胞因子為基質細胞來源的因子-1(SDF-1)。
11.權利要求1所述的方法，其中，上述體液樣品為血漿或全血。
12.權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括在上述形成復合物的步驟之前，用樣品稀釋緩沖液稀釋上述體液樣品的步驟；該樣品稀釋緩沖液是含有0.1～0.3％牛血清白蛋白，0.05～0.2％疊氮鈉，以及0.5～1.5％的氯化鈉的pH7.3～8.3的0.01～0.1M Tris-HCl。
13.權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括在上述形成復合物的步驟之前，在上述細胞因子的非變性溫度條件下加熱處理上述體液樣品的步驟。
14.權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括在上述測定熒光的步驟之前，用洗滌緩沖液洗滌在上述固相上形成的復合物的步驟；該復合物洗滌緩沖液是含有0.01～0.1％的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯的pH 8.5～9.5的0.01～0.1M Tris-HCl。
15.權利要求1所述的方法，其中，上述固相為具有50～200ng/cm2IgG吸附能力的微量滴度板。
16.用于檢測體液樣品中細胞因子的時間分辨熒光免疫檢測(TR-FIA)方法的試劑盒，該試劑盒包括具有固相結合部分和能與細胞因子結合的區域的第一抗體，具有能與該細胞因子結合的區域和生物素結合部分的第二抗體，具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的結合物，以及鑭系金屬離子；這里，該熒光結構部分可用通式(I)表示-R-Ar-C(＝O)-CH2-C(＝O)-CnF2n+1-X(I)-C(＝O)-CH2-C(＝O)-Ar-R-(II)式中，R為能與蛋白質形成共價鍵的官能團殘基，Ar為具有共軛雙鍵體系的烴基，n為1以上的整數，X為氟原子或通式(II)表示的基團。
全文摘要
本發明提供高靈敏度檢測體液樣品中細胞因子的方法。該方法是時間分辨熒光免疫檢測(TR－FIA)方法，包括捕捉細胞因子，在固相上形成含有與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的復合物的步驟，以及測定熒光結構部分的熒光的步驟。該復合物由依次結合(a)具有固相結合部分和能與細胞因子結合的區域的第一抗體，(b)細胞因子，(c)具有能與細胞因子結合的區域和生物素結合部分的第二抗體，(d)具有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白、能與鑭系金屬離子絡合的熒光結構部分的結合物，以及(e)鑭系金屬離子而形成。熒光結構部分可用通式(I)表示。
文檔編號G01N33/58GK1402834SQ00816405
公開日2003年3月12日 申請日期2000年9月28日 優先權日1999年9月29日
發明者田代啟, 本庶佑, 池川雅哉, 松本和子 申請人:科學技術振興事業團