一種具有放射增敏作用的化合物及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種具有放射增敏作用的化合物及其應用，該化合物對p53野生型與p53突變型的腫瘤細胞均具有增殖抑制作用，并能夠降低兩種細胞的TG2基因表達，而p53基因表達無明顯變化。將該化合物與IR聯合處理，兩細胞均顯示明顯的細胞凋亡升高和明顯的周期阻滯，放射敏感性顯著提高，TG2基因表達顯著降低。故而，該化合物對p53野生型與p53突變型的腫瘤細胞均具有顯著的放射增敏作用，將其作為放射增敏劑活性成分應用于腫瘤的放射治療中，尤其是應用于p53信號通路過度激活且電離輻射誘導后p53信號通路激活增強的腫瘤的放射治療中，有望大幅提高腫瘤的放療效果。
【專利說明】
一種具有放射増敏作用的化合物及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫學和制藥領域，具體涉及一種具有放射增敏作用的化合物及其 應用。
【背景技術】
[0002] 癌癥是遍及全球的一個主要的健康問題。肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發生率為 腫瘤發病率的12.4%，死亡率高達17.8%。在中國，由于容易導致肺癌發生的吸煙行為一直 未能得到有效控制，再加上近年來的環境惡化因素，肺癌發病和死亡更是呈現逐年上升趨 勢。
[0003] 放射治療是癌癥的常規治療手段之一，對于肺癌來說也是如此。雖然目前放療技 術不斷的發展，但是腫瘤放療失敗的幾率仍然較高，其主要原因在于腫瘤細胞輻射耐受的 存在。因此，放射敏感性是放療療效的關鍵，尋找合適的放射增敏的基因靶點及相應藥物是 研究熱點。
[0004] 作為放射增敏的基因靶點，P53基因與放射敏感性研究一直以來都是研究的熱點， 多項研究表明，放射敏感性與P53基因有著密切關系。p53信號通路對于在放射治療中的放 射線誘導的腫瘤細胞DNA損傷和修復及凋亡發揮非常重要的作用。p53基因在機體組織細胞 的生長、發育與分化等過程中起重要作用，其主要生物學功能是DNA修復、阻滯細胞周期、抑 制血管生成、誘導細胞凋亡。多數研究認為野生型P53基因在控制細胞周期停滯、DNA修復或 細胞凋亡方面起了重要的作用，故只有野生型P53基因才具有放射增敏作用，能在放射線誘 導下引起細胞凋亡;P53基因突變后，則喪失了正常的功能，腫瘤放射治療后凋亡過程受到 抑制，表現出對放射治療的抗拒性，故突變型P53基因不會放射增敏（Nature，1993,362 (6423) :847-849)。而根據臨床檢測顯示，超過60%的肺癌患者的p53基因具有不同程度的 突變。因此，尋找基于放射增敏的基因靶點P53基因的合適的放射增敏藥物已經顯得至關重 要，尤其是，尋找一種對于野生型P53基因和突變性p53基因均具有顯著放射增敏作用的放 射增敏劑，對于腫瘤尤其是肺癌的放射治療有著重要的意義。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種具有放射增敏作用的化合物及其應用，該化合物對 P53野生型與p53突變型的腫瘤細胞均具有顯著的放射增敏作用，將其作為放射增敏劑活性 成分應用于腫瘤的放射治療中，有望大幅提高腫瘤的放療效果。
[0006] 本發明的第一方面，提供了一種具有放射增敏作用的化合物，其結構式如下式（I) 所示：
[0008] 本發明的第二方面，提供了所述化合物在制備治療腫瘤的放射增敏劑中的用途。
[0009] 在本發明的上述用途的一些實施方案中，優選地，所述腫瘤為耐放射腫瘤。
[0010] 在本發明的上述用途的一些實施方案中，優選地，所述腫瘤為肺癌。
[0011] 在本發明的上述用途的一些實施方案中，優選地，所述化合物在對肺癌細胞無細 胞毒性的〈20% IC50藥物濃度下具有放射增敏作用。
[0012] 在本發明的上述用途的一些實施方案中，優選地，所述腫瘤為P53信號通路過度激 活且電離輻射誘導后P53信號通路激活增強的肺癌。
[0013] 就本發明的上述用途，在腫瘤的放射治療的過程中，在放射療法的同時或之前，所 述放射增敏劑處理腫瘤區域。
[0014] 在本發明的上述用途的一些實施方案中，優選地，所述處理為放射增敏劑的瘤內 注射。
[0015] 在本發明的上述用途的一些實施方案中，優選地，所述放射使用來自線性加速器 的X射線束或電子束來進行。
[0016] 在本發明的上述用途的一些實施方案中，所述化合物或其藥學上可接受的鹽與藥 學上可接受的載體組成腫瘤放射增敏的藥用組合物。
[0017]本發明中，以肺癌為例，對于穩定轉染的P53野生型肺腺癌細胞H1299/WT與p53突 變型肺腺癌細胞H1299/175,以本發明的結構式如下式(I)所示的具有放射增敏作用的化合 物作為放射增敏劑，采用MTT比色法檢測所述放射增敏劑對于兩種細胞系的增殖抑制作用， 采用集落存活分析法檢測不同放射劑量照射后兩者細胞的存活分數，用單擊多靶點模型和 線性二次函數模型(LQ模型)擬合細胞輻射劑量存活曲線分別求出放射生物參數D0、Dq、N、 SF2和α、β及放射增敏比SER;通過流式細胞術檢測兩種細胞系各組的細胞凋亡和細胞周期 的改變;熒光RT-PCR檢測各處理組中ρ53基因、TG2表達，western blot檢測周期及凋亡相關 蛋白表達的改變，采用ELISA技術檢測細胞核、細胞漿、線粒體中的Cyt-C的含量。
[0018] 結果顯示：所述放射增敏劑對于p53野生型肺癌H1299/WT細胞和p53突變型肺癌 H1299/175細胞均具有增殖抑制作用，能夠降低兩細胞的TG2基因表達，而p53基因表達無明 顯變化。所述放射增敏劑與IR聯合處理，兩細胞均顯示明顯的細胞凋亡升高和明顯的周期 阻滯，放射敏感性顯著提高，TG2基因表達顯著降低，細胞色素 C表達均明顯上升;不同的是， P53野生型肺癌H1299/WT細胞阻滯在G0+G1期，p53基因表達上升，細胞核內細胞色素 C下降， P21，BAX，磷酸化CASPASE-3蛋白表達明顯上升，CyclinB表達沒有明顯變化，CyclinD，bcl-2 表達降低；而P53突變型肺癌H1299/175細胞阻滯在G2+M期，p53基因表達無改變，線粒體內 細胞色素 C下降，P21，BAX，CyclinD表達無明顯變化，CyclinB，bcl-2表達明顯降低，磷酸化 CASPASE-3蛋白表達升高。
[0019] 從而，可以推測出野生型與突變型的增敏機制有所不同，野生型細胞TG2表達抑 制，激活了p53通路，增加 P21蛋白表達，從而影響細胞周期，通過ΒΑΧ蛋白的表達使Cyt-C從 細胞核釋放之胞漿，引起細胞凋亡；突變型細胞TG2表達抑制，通過抑制bcl-2使得細胞阻滯 在G2+M期，并促使線粒體內Cyt-C釋放至胞漿，啟動凋亡通路，引起細胞凋亡。但是，無論是 對于P53野生型肺癌H1299/WT細胞還是p53突變型肺癌H1299/175細胞，本發明的結構式如 (I)所示的具有放射增敏作用的化合物均能有效抑制TG2蛋白的表達，顯著提高放射敏感 性，具有非常明顯的放射增敏效果。由此可見，本發明所述放射增敏劑不但可以應用于制備 聯合放射治療肺癌的放射增敏藥物，而且，將本發明所述放射增敏劑應用于制備聯合放射 治療腫瘤的放射增敏藥物也具有普遍適用性，尤其是當腫瘤為P53信號通路過度激活且電 離輻射誘導后P53信號通路激活增強的腫瘤時尤為適用。
【附圖說明】
[0020]圖1A是本發明所合成的具有放射增敏作用的化合物的HPLC譜圖。
[0021 ]圖1B是本發明所合成的具有放射增敏作用的化合物的HNMR譜圖。
[0022]圖2是根據MTT比色法測定數據繪制的放射增敏劑(RSA)作用下HI 299/WT細胞抑制 曲線和H1299/175細胞抑制曲線。縱坐標為抑制率，橫坐標為放射增敏劑濃度的對數。
[0023]圖3A是H1299/WT細胞和H1299/175細胞經放射處理（IR)的存活曲線(實線）以及相 應的單擊多靶點擬合曲線(虛線）。
[0024]圖3B是H1299/WT細胞分別經放射處理（IR)和聯合處理（RSA+IR)的存活曲線（實 線)和以及相應的單擊多靶點擬合曲線(虛線）。
[0025]圖3C是H1299/175細胞分別經放射治療（IR)和聯合治療(RSA+IR)的存活曲線（實 線)和以及相應的單擊多靶點擬合曲線(虛線）。
[0026]圖4-1A、圖4-1B、圖4-1C和圖4-1D分別是流式細胞術檢測經由對照組(C)、放射增 敏劑組(RSA)、放射處理組（IR)和聯合處理組(RSA+IR)處理的H1299/WT細胞凋亡圖。其中， 各圖中橫軸表示的是Annexin V的染色分布，縱軸顯示的是細胞的PI染色分布。
[0027] 圖4-2A、圖4-2B、圖4-2C和圖4-2D分別是流式細胞術檢測經由對照組(C)、放射增 敏劑組(RSA)、放射處理組（IR)和聯合處理組(RSA+IR)處理的H1299/175細胞凋亡圖。其中， 各圖中橫軸表示的是Annexin V的染色分布，縱軸顯示的是細胞的PI染色分布。
[0028]圖5-1A、圖5-1B、圖5-1C和圖5-1D分別是流式細胞術檢測經由對照組(C)、放射增 敏劑組(RSA)、放射處理組（IR)和聯合處理組(RSA+IR)處理的H1299/WT細胞周期圖。其中， 各圖中橫坐標代表DNA含量(DNA Content)，縱坐標代表細胞數(Cell Number)。
[0029] 圖5-2A、圖5-2B、圖5-2C和圖5-2D分別是流式細胞術檢測經由對照組(C)、放射增 敏劑組(RSA)、放射處理組（IR)和聯合處理組(RSA+IR)處理的H1299/175細胞周期圖。其中， 各圖中橫坐標代表DNA含量(DNA Content)，縱坐標代表細胞數(Cell Number)。
[0030] 圖6是熒光定量RT-PCR檢測經放射處理（IR)和聯合處理(RSA+IR)后H1299/WT細胞 和H1299/175細胞中TG2表達的結果圖。
[0031] 圖7是H1299/WT細胞和H1299/175細胞分別經放射處理（IR)和聯合處理(RSA+IR) 后采用免疫印跡(western blot)檢測蛋白Bax，bcl-2，P21，磷酸化CASPASE-3，CyclinB， CyclinD表達的結果。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合附圖和具體實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。應理解，這些實 施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。
[0033] 下列實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條 件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市場購得 的常規產品。
[0034] 一、材料說明
[0035] 二甲基亞砜(01^0)、1^]\〇-1640培養基及胎牛血清購自6180)公司。0.25%胰蛋白 酶和0.02%二乙烯四乙酸二鈉(EDTA)購買自GIBC0公司。細胞周期ABC試劑盒為美國BD公司 (Becton,Dickinson and Company)產品（貨號340242)，Annexin V FITC/PI細胞凋亡檢測 試劑盒為BD公司產品。mRNA及蛋白提取試劑盒為QIAGEN公司AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit(貨號：80004)。抗體均購自美國ABCAM公司。細胞核蛋白、胞漿蛋白及線粒體蛋白 分離試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司。Cyt-C-ELISA為R&D systems Inc .Minneapolis產品。
[0036] 人肺腺癌細胞株H1299/WT和H1299/175由美國加州大學洛杉磯分校的陳旭峰教授 惠贈，其制備方法如下：
[0037] H1299細胞在6孔細胞培養板鋪板后，第二天用Invitrogen公司的 Lipofectamine2000試劑轉染相應質粒DNAJ2小時后用含有500ug/mL的G418的細胞培養液 進行篩選。兩周后，篩選成活的細胞用Western blot驗證p53蛋白的表達。
[0038] H1299細胞（人肺腺癌細胞株H1299)購自美國ATCC細胞庫（American Type of Cell Culture)。
[0039] 制備人肺腺癌細胞株H1299/WT的質粒為含野生性p53gene的質粒pcDNA3.1-wt-p53(其制備方法具體請見：Xufeng Chen,Jeffrey YC Wong,Patty Wong,Eric Radany.Low Dose Valproic Acid Enhances Radiosensitivity of Prostate Cancer through Acetylated p53-Dependent Modulation of Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis .Mol Cancer Res · 201 lApr; 9(4): 448-461)，是通過將野生型p53的片段PCR擴增 后，在BamHI和EcoR V位點插入pcDNA3.1-C(invitrogen)獲得的，其中，編碼野生型p53的質 粒為pCMV-Ne〇-Bam_p53wt質粒（可購得，addgene公司編號為#16434質粒，見https : // www.addgene.org/16434/)〇
[0040] 制備人肺腺癌細胞株H1 299/175的質粒為編碼突變型175位點p53的質粒 pcDNA3 · l_p53_R175H，其是米用了 Invitrogen公司的Mutagenesis Kit在質粒pcDNA3 · 1-wt-p53的基礎上通過點突變PCR構建完成，其制備方法具體請見:Zhen Li，Yin Sun，Xufeng Chen, Jill Squires,Behdokhd Nowroozizadeh,Chaozhao Liang,Jiaoti Huang.p53Mutation Directs AURKA Overexpression via miR_25and FBXW7in Prostatic Small Cell Neuroendocrine Carcinoma.Mol Cancer Res.2015March；13(3): 584-591〇
[00411質粒中野生性p53及突變型175位點p53的基因序列均經過基因測序驗證。空載體 質粒pcDNA3 · 1源自 Invitrogen公司。
[0042] 二、具有放射增敏作用的化合物的合成與鑒定
[0043] 具有放射增敏作用的化合物（以下記為RSA)，其結構式如下式(I)所示：
[0045]該化合物由本申請發明人進行結構設計，并委托上海宜方生物科技有限公司合 成，將本發明所公開的式（I)所示的結構式提供給該公司，可以購得該化合物。以下給出了 如式(I)所示的化合物的其中一條合成路線：
[0047] 根據上述合成路線的一種制備方法，包括以下步驟：
[0048] (1)將6.16g(40mmol)的3,4-二羥基苯甲酸(化合物2)溶于200mL的DMF溶劑中，在 冰浴下向其中加入8.05g(42mmol)EDCI(l-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽）、 5.67g(42mmol)HoBt(l-羥基苯并三唑）和4.25g(42mmol)的三乙胺，在室溫下攪拌30分鐘。 在室溫下向其中加入9.48g(40mmol)的L-酪氨酸叔丁酯(化合物1)并且攪拌過夜。向反應混 合物中加水并用乙酸乙酯萃取兩次。合并有機層后，用水和飽和氯化鈉溶液洗滌，并用硫酸 鎂干燥。過濾掉干燥劑，并將濾液減壓濃縮后，使用硅膠層析柱(洗脫溶劑：乙酸乙酯/正己 烷= 1/4-1/1)提純，得到(3,4_二羥基苯甲酰)-L-酪氨酸叔丁酯(化合物3)。
[0049 ] (2)將15.11 g (40.8mmo 1)的（3，4-二羥基苯甲酰)-L-酪氨酸叔丁酯(化合物3)溶于 80mL的DCM溶劑中，再向其中加入80mL的TFA溶劑，室溫攪拌12小時后，減壓除去溶劑，將粗 產物經乙酸乙酯/正己烷柱層析后重結晶純化，得到9.01g(3,4-二羥基苯甲酰)-L-酪氨酸 叔丁酯(化合物3)。
[0050] 將9.01g(28.4mmol)的（3,4-二羥基苯甲酰）-1^-酪氨酸叔丁酯（化合物3)溶于 200mL的DMF(二氯甲烷）溶劑中，在冰浴下向其中加入5.73g(29.8mmol)EDCI、4.03g (29.8mmol)HoBt和3.01g(29.8mmol)的三乙胺，在室溫下攪拌30分鐘。在室溫下向其中加入 5.09g (28.4mmo 1)的（3-溴-4，5-二氫-5-異噁唑）-甲胺(化合物5)并且攪拌過夜。向反應混 合物中加水并用乙酸乙酯萃取兩次。合并有機層，用水和飽和氯化鈉溶液洗滌，并用硫酸鎂 干燥。過濾掉干燥劑，并將濾液減壓濃縮后，使用硅膠層析柱(洗脫溶劑：乙酸乙酯/正己烷 =1 /8-1 /4)提純，得到如式（I)所示的目的產物(化合物4) (10.42g，77% )。
[0051 ]對所合成的目的產物進行高效液相色譜(HPLC)和核磁共振氫譜(HNMR)檢測，以確 定其結構式和純度。高效液相色譜譜圖如圖1A所示，核磁共振氫譜譜圖如圖1B所示。
[0052]通過對圖1A的數據進行分析，所合成的化合物的HPLC譜（實線z)中的四個峰的數 據如下表1所示：
[0053]表1:HPLC譜圖分析數據
[0055]根據譜圖以及分析數據，可以確定所合成的化合物的純度為95.05%，符合使用要 求。
[0056] 通過對圖1B的數據進行分析，可以確定所合成的化合物的分子式為:C2〇H2〇BrN3〇6， 精確分子量(Exact Mass):477 ·0535，分子量(Molecular Weight):478· 2933，化學名稱為： N-((2S)-1-((3-brom〇-4,5-dihudroisoxazol-5-yl)methy)amino)-3-(4-hydroxyphenyl)-l_oxopropan-2-yl)-3，4_dihydroxybenzamide，結構式如上式⑴所不。 [0057] 三、人肺腺癌細胞H1299/WT和H1299/175細胞培養
[0058] 將細胞置于含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養液中，在37°C、5 %C02飽和濕度孵育 箱中培養，用〇. 25 %胰蛋白酶和0.02 %二乙烯四乙酸二鈉(EDTA)消化傳代，取對數生長期 細胞作為后續實驗用細胞。
[0059]四、放射增敏藥物配制
[0060]將上述具有放射增敏作用的化合物(RSA)溶解于DMS0配制成濃度為lmol/L的母 液，保存備用。實驗時用DMS0稀釋至所需濃度。
[0061 ] 五、MTT比色法測定抑制率
[0062] 分別取對數生長期的H1299/WT細胞和H1299/175細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并 吹打為細胞懸液，計數細胞后調整懸液的細胞濃度為2.5 X 104/ml。分別接種H1299/WT細胞 和H1299/175細胞于96孔細胞培養板，每孔終體積為200μ1(細胞數為5000/孔）。
[0063] 將96孔板移入37°(：、5^^02飽和濕度孵育箱中培養24小時貼壁后，棄去培養液，換 成含有梯度濃度的上述具有放射增敏作用的化合物(RSA)的培養液。對照組為含有細胞的 等體積培養液(RSA濃度為0)，每一濃度設8個復孔，置于37 °C、5 % C02飽和濕度孵育箱中繼 續培養48h，采用MTT法檢測其各自的吸光度，計算各組抑制率，繪制曲線。細胞抑制曲線圖 如圖2所示。
[0064]細胞抑制曲線圖2顯示:該具有放射增敏作用的化合物(RSA)對肺癌細胞具有抑制 作用，對H1277/WT、H1299/175細胞均具有一定的抑制，在各濃度組下兩者抑制率均無統計 學差異（P>〇.〇5)。通過曲線計算在RSA濃度為3.91ymol/L下H1277/WT細胞的抑制率為 (15.33±1.46)%，!11299/175細胞的抑制率為（14.31±1.90)%。
[0065]四、放射敏感性實驗
[0066]藥物作用后，對細胞生長抑制率在20 %以內時，藥物對細胞的毒性作用可相對忽 略，因此選擇上述化合物作用48小時抑制細胞增殖20%以內的濃度如3.91ymol/L進行克隆 形成試驗：
[0067] 分別取對數生長期的H1299/WT細胞和H1299/175細胞，消化成單細胞懸液，按梯度 倍數稀釋成1〇2~1〇4細胞/孔，根據不同的照射劑量將不同數量的細胞分別接種于6孔細胞 培養板中，X線照射劑量點分別為〇、1、2、4、6、8、10Gy，每個劑量點設3個復孔。在37°C、5 % C02飽和濕度的孵箱中培養24h貼壁后進行分組處理，分組為：單純放療組(記為IR)和藥物 聯合放療組(記為RSA+IR)。藥物聯合放療組加入濃度為3.91ymol/L的RSA藥物，單純放療組 加入不含藥物的等量培養液，培養24h后照射，照射后繼續培養24h，然后更換無藥培養基， 靜置于培養箱中繼續培養8天，甲醇固定后Gi emsa染色，計數各孔細胞數多50個細胞的集落 數。計算集落形成率(PE)和細胞存活率(surviving fraction，SF)。
[0068] 集落形成率(PE)=集落數/接種細胞數X 100% ;
[0069] 細胞生存分數(SF)=各照射劑量PE/未照射PEX 100%。
[0070]根據計算的細胞存活率繪制各組細胞的存活曲線，分別如圖3A、圖3B、圖3C中的實 線所示。采用單擊多靶點模型和線性二次函數模型（LQ模型）擬合細胞輻射劑量存活曲線 (擬合的存活曲線如圖3A、圖3B、圖3C中的虛線所示），計算各組放射生物參數:終斜率Do值、 準閾劑量Dq值、外推值N、SF2值和α、β，以及使用藥物后的放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER)。放射增敏比（SER)=單純照射的SF2值/照射加藥的SF2值。
[0071] 對H1299/WT和H1299/175細胞同時進行實驗，結果見表2:
[0072]表2:各組的放射生物參數
[0074]由表2可以觀察其放射敏感性的差異及具有放射增敏作用的化合物(RSA)對不同 細胞的增敏效果差異。對于H1299/WT和H1299/175細胞，相對于單純照射組，加藥照射組中 放射生物參數Dq、D0、N、SF2、β值均減小，α值均增大，顯示均能提高放射敏感性;SF2減小均 具有統計學差異(P〈〇 . 05);加藥處理H1299/175細胞的放射增敏比SER為1.55，加藥處理 H1299/WT細胞的放射增敏比SER為1.65,但加藥H1299/WT和H1299/175兩細胞的增敏比SER 無統計學差異(P>〇.〇5)。
[0075]五、細胞周期改變及凋亡實驗
[0076] 分別取對數生長期的H1299/WT細胞和H1299/175細胞，消化成單細胞懸液，按2X 1〇5細胞/孔接種于6孔細胞培養板中，在37°C、5%C02飽和濕度的孵箱中培養24h貼壁后進行 分組處理，分組為：對照組（C)、單純加藥組(RSA)、單純放療組（IR)、以及藥物聯合放療組 (RSA+IR)，每組每種細胞檢測指標3復孔。RSA的藥物干預濃度為3.91ymol/L，對照組及單純 放療組均加入1640培養液，給予照射的實驗組的照射劑量是4Gy。處理結束后各組更換不含 藥物培養液(藥物加入組需要經RSA孵育24h后再更換），在37°C、5%⑶ 2飽和濕度的孵箱中 繼續培養48h，收集細胞。采用BD公司ABC試劑盒，行流式細胞術檢測細胞周期；按BD公司 Annexin V FITC/PI試劑盒，行流式細胞術檢測細胞凋亡。
[0077] 細胞周期及凋亡顯示，實驗24h后，各組細胞均出現了不同程度的細胞凋亡現象。 顯微鏡觀察聯合組兩細胞H0ST33258染色后，核染色強度明顯，顯示凋亡現象明顯。
[0078] 流式細胞術檢測H1299/WT細胞凋亡結果：與對照組(Control)、放療組（IR)及藥物 組(RSA)相比，藥物聯合放療組(RSA+IR)凋亡(Apoptosis)顯著上升，該區別具有統計學差 異(P〈0.05)。
[0079] 流式細胞術檢測H1299/175細胞凋亡結果：與對照組(Control)、放療組（IR)及藥 物組(RSA)相比，藥物聯合放療組(RSA+IR)凋亡(Apoptosis)顯著上升，該區別具有統計學 差異(P〈0.05)。
[0080] 以上具體數據請見表3、圖4-1A、圖4-1B、圖4-1C、圖4-1D和圖4-2A、圖4-2B、圖4-2C、圖4-2D。
[00811 流式細胞術檢測H1299/WT細胞周期結果：與對照組(Control)、放療組（IR)及藥物 組(RSA)相比，藥物聯合放療組(RSA+IR)在G0+G1期阻滯明顯，該區別具有統計學差異(p〈 0.05).
[0082] 流式細胞術檢測H1299/175細胞周期結果：與對照組(Control)、放療組（IR)及藥 物組(RSA)相比，藥物聯合放療組(RSA+IR)在G2+M期阻滯明顯，該區別具有統計學差異(p〈 0.05)〇
[0083] 以上具體數據請見表3、圖5-1A、圖5-1B、圖5-1C、圖5-1D和圖5-2A、圖5-2B、圖5-2C、圖5-2D。
[0084] 表3:不同處理組H1299/WT，H1299/175細胞凋亡及周期檢測結果
[0086] *表示與對照組(Control)、放療組（IR)及藥物組(RSA)比較均具有統計學差異。
[0087] 六、基因表達改變蛋白
[0088] 分別取對數生長期的H1299/WT細胞和H1299/175細胞，消化成單細胞懸液，按2X 107細胞/皿接種于15cm培養皿中，在37°C、5 %⑶:^飽和濕度的孵箱中培養24h貼壁后進行分 組處理，分組為:單純放療組(記為IR)和藥物聯合放療組(記為RSA+IR)。每組每種細胞檢測 指標3皿重復。藥物聯合放療組加入濃度為3.91ymol/L的RSA藥物，單純放療組加入不含藥 物的等量培養液，給予照射的實驗組的照射劑量是4Gy。處理結束后各組更換不含藥物培養 液(藥物加入組需要經RSA孵育24h后再更換），在37°C、5 %⑶2飽和濕度的孵箱中繼續培養 48h，收集細胞。
[0089] 米用AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit提取細胞的mRNA及總蛋白備用，mRNA通 過TAKALA逆轉錄試劑盒轉錄成cDNA，定量500ng/ul，通過實時熒光SYBR Green PCR法檢測 TG2表達，計算基因相對拷貝數=2-ACt，基因表達改變通過Fold change = 2_Δ ( ACt)， (Δ Ct = Ct(target)-Ct(gapdh), A ( Δ Ct) = Δ C t(treated)- Δ Ct)計算。
[0090] 以β-Actin為內參，采用western blot檢測周期及凋亡相關蛋白Bax，bcl_2，P21， 磷酸化 CASPASE-3，Cycl inB，Cycl inD 表達。
[0091] 熒光定量RT-PCR結果顯示：
[0092]具有放射增敏作用的化合物(RSA)處理兩細胞后48h，TG2均降低，p53基因表達均 無明顯變化；
[0093] 兩細胞IR組，48h后均顯示TG2表達上升，但上升不顯著，無統計學差異(p>0.05)， 兩細胞的P53基因均表達有所上升；
[0094]聯合組中，兩細胞的TG2基因表達均顯示顯著下降，聯合組與自身單放療及單藥物 組比下降明顯，具有統計學差異(P〈〇.05);野生型細胞的P53基因表達上升，突變型細胞的 P53基因表達無改變。
[0095] 其中，TG2表達結果如圖6所示：對于H1299/WT細胞和H1299/175細胞，相對于IR組 (標記為C)，藥物聯合IR組(標記為T)采用本發明的具有放射增敏作用的化合物(RSA)處理 細胞后48h，均檢測到TG2基因表達顯著降低，兩組的FC(fold change)值(標記為FC)均大于 2。可見，本發明的具有放射增敏作用的化合物(RSA)聯合IR處理H1299/WT細胞和H1299/175 細胞均能有效下調TG2表達。
[0096] Western blot檢測功能蛋白結果見圖7,具體說明如下：
[0097] 對于野生型p53基因的H1299/WT細胞，與單IR組相比，經RSA聯合IR(RSA+IR)處理 后，P21蛋白表達明顯增加、促凋亡ΒΑΧ蛋白表達、磷酸化CASPASE-3蛋白表達均明顯上升， CyclinB表達沒有明顯變化，CyclinD、抑制凋亡bcl-2蛋白表達降低。
[0098] 對于突變型p53基因的H1299/175細胞，與單IR組相比，經RSA聯合IR后，P21、BAX、 Cycl inD均顯示微量表達，表達無明顯變化，CyclinB、bcl-2表達明顯降低，磷酸化CASPASE-3蛋白表達升尚。
[0099]七、ELISA法檢測細胞核、線粒體及細胞漿中細胞色素 C實驗 [0100] 分別取對數生長期的H1299/W細胞和H1299/175細胞，消化成單細胞懸液，按IX 107細胞/皿接種于15cm培養皿中，在37°C、5 %⑶:^飽和濕度的孵箱中培養24h貼壁后進行分 組處理，分組為:單純放療組(記為IR)和藥物聯合放療組(記為RSA+IR)。每組每種細胞檢測 指標3皿重復。藥物聯合放療組加入濃度為3.91ymol/L的RSA藥物，單純放療組加入不含藥 物的等量培養液，給予照射的實驗組的照射劑量是4Gy。處理結束后各組更換不含藥物培養 液(藥物加入組需要經RSA孵育24h后再更換），在37°C、5 %⑶2飽和濕度的孵箱中繼續培養 48h，按試劑盒說明書收集其細胞的細胞核、線粒體、細胞漿的蛋白，采用R&Dsystems Inc .Minneapolis公司的Cyt-C-ELISA試劑盒檢測。
[0101] ELSIA檢測細胞核、細胞漿及線粒體中Cyt-C的結果如表4所示。從表4可見，通過 RSA聯合IR組，細胞漿中顯示細胞色素 C表達明顯上升，兩細胞在聯合組分別為78.4 土 7.3碰，71.8±4.31^，與自身細胞行11?組比均具有統計學差異（？〈0.05)。野生型？53的的 H1299/WT細胞中呈現細胞核內Cyt-C降低，線粒體中Cyt-C表達無明顯改變，突變型p53的 H1299/175細胞中呈現線粒體Cyt-C表達降低，細胞核無明顯改變。
[0102]表4.細胞色素 C在各細胞器中的表達
[0104] *與自身的IR組比較有統計學差異(p〈0.05)
[0105] 綜合以上的實驗數據，可以發現：
[0106] 對于p53野生型肺癌H1299/WT細胞和p53突變型肺癌H1299/175細胞，本發明的結 構式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下記為RSA)均具有抑制作用，能夠誘導 細胞凋亡及細胞周期的改變。
[0107] 并且，上述RSA聯合IR處理后，能夠使p53野生型肺癌H1299/WT細胞和p53突變型肺 癌H1299/175細胞的〇卩、〇〇、13?2、0值均減小，€1值均增大，且3?2減小具有統計學差異(？〈 0.05)，經本發明的RSA處理后H1299/175、H1299/WT的放射增敏比SER分別為1.55和1.65。這 說明：本發明的結構式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下記為RSA)，既能顯 著提高P53野生型肺癌H1299/WT細胞的放射敏感性，又能明顯提高p53突變型肺癌H1299/ 175細胞的放射敏感性。將其應用于制備聯合放射治療肺癌的放射增敏藥物具有普遍適用 性。
[0108] 為了分析本發明的結構式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下記為 RSA)對于p53野生型肺癌H1299/WT細胞和p53突變型肺癌H1299/175細胞的放射增敏作用機 制，對于不同處理組的H1299/WT細胞和H1299/175細胞進行細胞凋亡及周期檢測、熒光RT-PCR檢測、Western blot檢測以及細胞色素 C的ELISA法檢測。
[0109] 結果顯示:經本發明RSA聯合IR處理p53野生型肺癌H1299/WT細胞和p53突變型肺 癌H1299/175細胞后，均顯示明顯的細胞凋亡升高和明顯的周期阻滯，與單IR組比均具有顯 著統計學差異。進一步分析發現:周期阻滯有所不同，P53突變型肺癌H1299/175細胞阻滯在 G2+M期，而p53野生型肺癌H1299/WT細胞阻滯在G0+G1期，與自身對照比均存在統計學差異。
[0110] 本發明的結構式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下記為RSA)單獨 作用于P53野生型肺癌H1299/WT細胞和p53突變型肺癌H1299/175細胞，能夠降低兩細胞的 TG2基因表達，而p53基因表達無明顯變化。本發明的結構式如式(I)所示的具有放射增敏作 用的化合物（以下記為RSA)聯合IR處理后，p53野生型肺癌H1299/WT細胞TG2基因表達顯著 降低，P53基因表達上升;p53突變型肺癌H1299/175細胞TG2基因表達顯著降低，p53基因表 達無改變。可見，本發明的結構式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下記為 RSA)能夠抑制TG2的表達。
[0111] 并且，通過RSA聯合IR，兩細胞的細胞漿中細胞色素 C表達均明顯上升，可見，本發 明的結構式如式（I)所示的具有放射增敏作用的化合物（以下記為RSA)抑制TG2的表達，能 促使細胞經IR處理后細胞色素 C從細胞核和線粒體內釋放進入細胞漿，從而發揮凋亡作用。 具體來說，對于野生型P53的H1299/WT細胞，RSA抑制TG2的表達，促使細胞經IR處理后細胞 色素 C從細胞核內釋放進入細胞漿;對于突變型p53的H1299/175細胞，RSA抑制TG2的表達， 促使細胞經IR處理后細胞色素 C從線粒體內釋放進入細胞漿。
[0112] 組織型谷氨酰胺轉氨酶（tissue transgiutaminase TG2)，基因定位于20號染色 體的ql2帶上，全長約32.5kb。它的蛋白質分子量為80kD(千道爾頓），有687個氨基酸殘基， 每個單體含有4個獨特的結構域。TG2是谷氨酰胺轉氨酶家族中的一個獨特成員，存在于細 胞的多個部位，包括胞漿、胞核、線粒體、細胞膜表面以及細胞外基質。它不僅具有Ca 2+依賴 的催化蛋白交聯的活性及GTP依賴的G蛋白的功能，還具有蛋白二硫鍵異構酶活性和蛋白激 酶的功能。TG2參與許多腫瘤細胞的凋亡過程。許多研究結果都支持TG2的促凋亡作用，凋亡 細胞內通常都有高水平的TG2表達，抑制TG2的表達會顯著降低細胞死亡數量。然而TG2表達 和凋亡并不是完全一致的。最近又有直接證據表明，升高的TG2通過阻止凋亡來延長細胞的 存活。這些研究結果提示TG2不僅具有促凋亡作用，而且還有抗凋亡作用，這種似乎矛盾的 作用取決于細胞類型、所受刺激類型及TG2在細胞內的定位和酶活性類型。
[0113] 結合Western blot結果分析可能的機制：
[0114] 野生型p53基因的H1299/WT細胞經RSA聯合IR處理后，抑制TG2表達，激活了 p53通 路，P21蛋白激活從而抑制Cyc 1 inD表達，ΒΑΧ的表達升高，細胞核內細胞色素 C釋放到細胞 質。細胞色素 C在胞質中與Apaf-Ι以及ΑΤΡ組成凋亡小體，進而激活caspase-9，始動激活以 caspase-3和caspase-7為效應分子的caspase信號鏈，促進凋亡的發生。放射增敏是通過 P53依賴凋亡途徑。
[0115] 與野生型細胞不同的是，突變型的p53基因的H1299/175細胞更容易發生輻射誘導 的有絲分裂殤折，經RSA聯合IR后，雖然在p53突變的腫瘤細胞中受p53負性調控的CyclinBl 表達上升，但由于RSA對于TG2表達的抑制，仍然使得細胞中G2/M期監測點的調控蛋白 CyclinBl表達顯著降低，從而G2/M期監測點功能恢復，使其進入不了有絲分裂，或導致輻射 后受損的DNA修復不完全而進入有絲分裂期發生有絲分裂殤折性的凋亡。降低BCL-2的表 達，促使其線粒體細胞色素 C釋放進入細胞漿，與Apaf-Ι以及ATP組成凋亡小體，進而激活 caspase-9，始動激活以caspase-3和caspase-7為效應分子的caspase信號鏈，促進凋亡的 發生。放射增敏可能依賴線粒體途徑。
[0116] 可見，對于p53野生型肺癌H1299/WT細胞和p53突變型肺癌H1299/175細胞，本發明 所述放射增敏劑均抑制了TG2蛋白的表達，經過IR聯合處理后，激活了不同的凋亡信號通 路，P53野生型通過p53依賴凋亡途徑，p53突變型通過線粒體途徑參與調解腫瘤細胞的凋 亡，從而引起在不同細胞周期阻滯，但都具有非常明顯的放射增敏效果。因此，將本發明所 述放射增敏劑應用于制備聯合放射治療腫瘤的放射增敏藥物具有普遍適用性，尤其是當腫 瘤為P53信號通路過度激活且電離輻射誘導后p53信號通路激活增強的腫瘤時尤為適用。
【主權項】
1. 一種具有放射增敏作用的化合物，其結構式如下式(I)所示：2. 如權利要求1所述的化合物在制備治療腫瘤的放射增敏劑中的用途。3. 如權利要求2所述的用途，其特征在于，在腫瘤的放射治療的過程中，在放射療法的 同時或之前，所述放射增敏劑處理腫瘤區域。4. 如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為耐放射腫瘤。5. 如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為肺癌。6. 如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述化合物在對肺癌細胞無細胞毒性的〈 20 % IC50藥物濃度下具有放射增敏作用。7. 如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述腫瘤為p53信號通路過度激活且電離輻 射誘導后P53信號通路激活增強的肺癌。8. 根據權利要求3所述的用途，其特征在于，所述處理為放射增敏劑的瘤內注射。9. 根據權利要求3所述的用途，其特征在于，所述放射使用來自線性加速器的X射線束 或電子束來進行。10. 根據權利要求2-9任一所述的用途，其特征在于，如權利要求1所述化合物或其藥學 上可接受的鹽與藥學上可接受的載體組成腫瘤放射增敏的藥用組合物。
【文檔編號】C07D261/04GK106045932SQ201610396839
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】陳明, 馮建國
【申請人】浙江省腫瘤醫院