鐵皮石斛內生真菌及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種鐵皮石斛內生真菌，它是從蘭科石斛屬植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）植物活體中采用內生真菌分離純化技術分離獲得的，經微生物分類學鑒定為Pestalotiopsis sp. DO14。該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2015180。本發明還通過與鐵皮石斛組培苗共培養，促進鐵皮石斛組培苗的莖加粗、加長與莖、葉的顏色加深，促使莖中多糖含量的提高、莖中醇溶性成分與葉中黃酮類成分的改變，是與鐵皮石斛生長與代謝產物密切相關的重要微生物，具有促使鐵皮石斛生長和代謝成分變化的應用潛力。CCTCC M2031
【專利說明】
鐵皮石斛內生真菌及其應用
技術領域
[0001]本發明涉及微生物技術領域，特別涉及鐵皮石斛內生真菌及其應用。
【背景技術】
[0002]鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(蘭科石斛屬植物)，是我國名貴中藥材，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺明目、抗癌防老等功效，位列“中華九大仙草”之首。2010年版《中華人民共和國藥典》將鐵皮石斛從石斛類藥材中劃出，單獨收錄。隨著鐵皮石斛栽培技術的突破，產業得到了快速的發展，全國鐵皮石斛現有種植面積突破4萬畝，產值突破50億元，成為我國產銷量最大、發展最快的中藥材之一。提高栽培藥材的品質和保持質量穩定性成為了當前鐵皮石斛產業可持續發展的重點，而明確其品質形成的作用機制是關鍵。
[0003]鐵皮石斛作為蘭科植物有其生長的特殊性，在自然生境中部分或全部依靠與其共生的菌根真菌為其提供營養才能促使種子萌發及后繼的生長發育。近年來，另一個重要群體一非菌根內生真菌因其多種生態作用得到了越來越多的關注。大量的研究發現植物內生真菌作為微生物生態的一個重要組成部分，不僅能促進宿主生長、提高宿主對生物脅迫或非生物脅迫的抗性，還引起宿主次生代謝產物的變化，甚至能夠誘導和促進藥用植物有效成分的合成或積累，一些藥用植物內生真菌還能產生與宿主相同或相似的生物活性物質。與根關聯的非菌根內生真菌逐漸被人們認識和發現。一些證據證明與葉和根部相關的內生真菌對宿主植物的有利作用被低估。然而藥用蘭科植物，尤其是石斛屬植物內生真菌研究缺乏，近年來石斛屬植物與其真菌的關系研究也多集中在石斛菌根真菌的作用方面，僅有極少數關于石斛屬非菌根內生真菌的報道，仍有大量的石斛屬植物內生真菌以及它們對宿主植物的影響作用有待于探究。
[0004]我們在研究中發現不同種質的鐵皮石斛具有極其豐富的內生真菌資源，將從鐵皮石斛葉、莖、根中分離得到的內生真菌逐一與鐵皮石斛無菌組培苗共培養，從中篩選出了對鐵皮石斛生長、代謝成分變化有明顯作用的優良菌株。這項工作為鐵皮石斛內生真菌對宿主植物的影響研究提供實驗基礎和科學依據，為鐵皮石斛品質改良開辟新的途徑。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種新的鐵皮石斛內生真菌，并提出其用途，即能夠通過與鐵皮石斛組培苗共培養，促進鐵皮石斛組培苗的莖加粗、加長與莖、葉的顏色加深，促使莖中多糖含量的提高、莖中醇溶性成分與葉中黃酮類成分的改變，在于有效地促進鐵皮石斛苗的生長，提高活性代謝成分的含量，為鐵皮石斛內生真菌對宿主植物的影響研究提供實驗基礎和科學依據，為鐵皮石斛品質改良開辟新的途徑。
[0006]本發明提供了一種鐵皮石斛內生真菌，命名為Pestalot1psissp.D014。本發明所述的鐵皮石斛內生真菌是從蘭科石斛屬植物鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimuraet Migo)植物活體中采用內生真菌分離純化技術分離獲得的，經微生物分類學鑒定為Pestalot1psissp.D014。該菌株已保藏，保藏日期為2015年03月31日，保藏號為CCTCC M2015180，保藏單位為中國典型培養物保藏中心，地址:中國武漢，武漢大學，郵編:430072。
[0007]本發明所述的鐵皮石斛內生真菌的固體培養特征為:在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上26 °C培養，菌落白色絮狀。
[0008]本發明所述的鐵皮石斛內生真菌顯微特征為:分生孢子具有5個細胞，中間細胞著色，頂孢和尾孢均為三角形。
[0009]本發明所述的鐵皮石斛內生真菌的ITS和5.8S rDNA堿基序列如SEQ ID N0.1所示為:
CCTCTGTACGCGGAGGGACATTATAGAGTTTTCTAAACTCCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCG
GCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCT
TATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA
GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCAT
GCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCT
GAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTAATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCC
AGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAAo
[0010]本發明還提供了鐵皮石斛內生真菌的應用。
[0011]本發明所述的鐵皮石斛內生真菌，與鐵皮石斛組培苗共培養，促進鐵皮石斛組培苗生長，促使鐵皮石斛組培苗中代謝成分改變，其實施步驟如下:
菌種活化—與組培苗共培養—共培養組培苗生長狀況觀察—組培苗莖、葉中主要代謝成分提取—組培苗莖、葉中主要代謝成分分析；
其中菌種活化采用平板固體培養基，培養基為PDA;內生真菌與組培苗共培養培養基為香蕉培養基(大量50 mL/L，微量10 mL/L，有機10 mL/L，鐵鹽10mL/L，NAA I mL/L，瓊脂4.2g/L，白糖30g/L，香蕉150/L，花寶1.0 g/L，pH=7.09)。培養時間:菌種平板培養活化7_14天，內生真菌與組培苗共培養I個月。培養溫度:菌種活化為26 ± I °C，共培養為25 ± TC。共培養光照時間為8?12小時/天，光強為1000?20001X。組培苗莖中多糖含量測定:參照《2010版中國藥典一部》中的苯酚-硫酸比色法。
[0012]莖中醇溶性成分提取:精密稱定1.0g莖粉末，置250mL圓底燒瓶中，精密加入10mL甲醇，80°C水浴回流lh，過濾，濾液旋干，甲醇溶解并定容至2mL，0.45ym微孔濾膜過濾，SP得。
[0013]葉中黃酮類成分提取:精密稱定0.4g葉粉末，置50mL具塞三角瓶中，精密加入20mL80%甲醇，密塞，20°C超聲30π?η，0.45μπι微孔濾膜過濾，即得。利用HPLC指紋圖譜技術分析組培苗莖中醇溶性成分與葉中黃酮類成分。
[0014]本發明所述的鐵皮石斛內生真菌，通過與鐵皮石斛組培苗共培養，促進鐵皮石斛組培苗的莖加粗、加長與莖、葉的顏色加深，促使莖中多糖含量的提高、莖中醇溶性成分與葉中黃酮類成分的改變，具有較大的應用前景。
【附圖說明】
[0015]圖1本發明所述鐵皮石斛內生真菌在PDA平板培養基上的形態圖；
圖2本發明所述鐵皮石斛內生真菌的顯微鏡(1000Χ)觀察圖； 圖3本發明所述鐵皮石斛接菌組培苗與無菌組培苗形態特征比較圖；
圖4本發明所述鐵皮石斛接菌組培苗與無菌組培苗莖中多糖含量比較圖；
圖5本發明所述鐵皮石斛接菌組培苗與無菌組培苗葉中黃酮類成分對比指紋圖譜；
圖6本發明所述鐵皮石斛接菌組培苗與無菌組培苗葉莖中醇溶性成分對比指紋圖譜。
【具體實施方式】
[0016]下面結合附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求所限定的范圍。
[0017]本發明的鐵皮石斛內生真菌是從浙江省樂清市雁蕩山鐵皮石斛葉、莖、根中均能得到的菌株。本發明的鐵皮石斛內生真菌按以下步驟分離獲得:將采集的新鮮健康的鐵皮石斛莖、葉與根在自來水下沖洗干凈，用無菌濾紙吸干表面水分，將根和莖切成3cm長的小段，葉片切成3cmX3cm的小塊，進行75%乙醇I min—2.5%次氯酸鈉3 min—75%乙醇30 s三步表面消毒處理。消毒后，材料表面用無菌水沖洗3次再用無菌濾紙吸干，用消毒后的剪刀分別將根和莖剪成小段(1.0 cm)、葉片剪成小塊(0.5 cmX0.5 cm)，置于含有50 mg/L青霉素的PDA(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L)培養基上26±2°C培養。每天觀察樣品真菌生長的情況。5-7天后有菌絲長出，挑取菌絲尖端轉移到新的TOA培養基上純化培養，并按形態合并，最終得到本發明的鐵皮石斛內生真菌菌株。
[0018]在無菌條件下用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌的固體TOA培養基平板，于26土TC活化培養14，鐵皮石斛內生真菌在PDA平板培養基上的形態特征及顯微特征如圖1、圖2所示。
[0019]準備鐵皮石斛無菌組培苗，用打孔器將覆蓋培養基表面的菌絲打成大小相同的菌片(直徑為0.5cm)，接種在距離鐵皮石斛無菌組培苗1.5cm處，25 °C每天光照12h條件下培養I個月，期間對組培苗生長情況進行觀察。與鐵皮石斛內生真菌共培養I個月的鐵皮石斛組培苗以及鐵皮石斛未接菌組培苗的形態特征如圖3所示。
[0020]為檢測鐵皮石斛內生真菌接種后的效果，可從鐵皮石斛內生真菌與組培苗共培養的組培瓶中，取出鐵皮石斛組培苗，將其進行清洗，烘干，再進行鐵皮石斛組培苗莖的多糖含量測定、莖中醇溶性成分指紋圖譜與葉中黃酮類成分指紋圖譜檢測。與鐵皮石斛內生真菌共培養I個月的鐵皮石斛組培苗以及鐵皮石斛未接菌組培苗莖中多糖含量比較如圖4所示，莖中醇溶性成分、葉中醇溶性成分比較如圖5、6所示。
[0021]多糖含量測定、莖中醇溶性成分指紋圖譜與葉中黃酮類成分指紋圖譜檢測結果表明，接種后，鐵皮石斛小苗與內生真菌形成了共生關系，不僅促進了鐵皮石斛小苗的生長速度，同時也使鐵皮石斛植株植體內多糖和醇溶性成分大幅度提高，有效地提高了鐵皮石斛的品質。
【主權項】
1.一種鐵皮石斛內生真菌，其特征在于，它的命名為擬盤多毛孢屬Pestalot1psissp.D014，其保藏登記號為CCTCC M 2015180。2.如權利要求1所述的鐵皮石斛內生真菌，其特征在于，它的ITS和5.8SrDNA堿基序列如SEQ ID N0.1所示為: CCTCTGTACGCGGAGGGACATTATAGAGTTTTCTAAACTCCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTAATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAAo3.如權利要求1或2所述的鐵皮石斛內生真菌，其特征在于，它的顯微形態為:分生孢子具有5個細胞，中間細胞著色，頂孢和尾孢均為三角形。4.如權利要求1或2所述的鐵皮石斛內生真菌，其特征在于，它的固體培養為TOA培養基上26 °C培養，菌落白色絮狀。5.根據權利要求1-4中任何一項所述的鐵皮石斛內生真菌在促使鐵皮石斛組培苗生長和代謝成分變化中的應用。6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，鐵皮石斛內生真菌與鐵皮石斛無菌組培苗共培養包括下列步驟: (1)取鐵皮石斛內生真菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌的固體PDA培養基平板，于26 ± I °(:活化培養14天； (2)準備好鐵皮石斛無菌組培苗，待菌絲長滿平板，用打孔器將覆蓋培養基表面的菌絲打成大小相同的菌片，接種在距離鐵皮石斛無菌組培苗1.5cm處，25°C每天光照12h條件下培養I個月，期間對組培苗生長情況進行觀察； (3)從鐵皮石斛內生真菌與組培苗共培養的組培瓶中，取鐵皮石斛組培苗，將其進行清洗，進行鐵皮石斛組培苗莖的多糖含量測定、莖中醇溶性成分指紋圖譜與葉中黃酮類成分指紋圖譜檢測。
【文檔編號】A01P21/00GK105886405SQ201510288283
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年6月1日
【發明人】吳令上, 斯金平, 董洪秀, 韓婷, 朱波
【申請人】浙江農林大學