一株極細鏈格孢菌及其在生物除草中的應用
【專利摘要】本申請公開了一株極細鏈格孢菌及其在生物除草中的應用，該菌株的分類命名為極細鏈格孢菌，Alternaria tenuissima，完整命名為極細鏈格孢菌HZ?1，已于2016年01月11日保藏在中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.11992。本發明提供的極細鏈格孢菌(Alternaria tenuissima)在青稞、蠶豆、豌豆田中，用于豬殃殃、藜、冬葵等闊葉雜草的生物除草，其能有效地控制和防治闊葉雜草。CGMCC No.11
【專利說明】
一株極細鏈格孢菌及其在生物除草中的應用
技術領域
[0001 ]本申請屬于生態學領域，具體地說，涉及一株極細鏈格孢菌及其在生物除草中的 應用。
【背景技術】
[0002] 草害是導致作物減產的最主要因素之一，每年導致全球農業950億美元損失。當 今，農田雜草控制還是以化學除草劑為主體。隨著化學除草劑的廣泛使用，帶來的負面影響 也日益明顯。隨著農業現代化水平的提高，全球范圍內的除草劑使用量將繼續增加。大量施 用化學除草劑不僅帶來了環境污染危機，而且導致下茬作物減產甚至土地退化。全世界已 有100余種化學除草劑在30余個國家被禁用或取消登記。另外，全球已發現188種雜草的324 個生物型對19類化學除草劑產生了抗藥性，使得藥效降低、用藥量增加、成本提高，也更加 重了污染。后果是導致除草劑品種的單一化，也增強了市場對研制廣譜、高效、低毒、對非靶 標生物和哺乳動物安全的生物除草劑和發展生物除草技術的需求。利用自然界生物中具有 活性的微生物及其代謝產物，發展生物除草劑來替代或部分替代化學除草劑，是解決這一 矛盾的重要途徑。相對于每個新型化學除草劑高達1億美元的研制成本，研制生物除草劑的 成本要低數十倍甚至上百倍。
[0003] 自20世紀80年代以來，全世界已經成功開發的生物除草劑產品有20余個品種，目 前市場上可用的生物除草劑大約有11個。其中Biochon、StumpOut、Camperico、雙丙氨膦鈉 和Myco-TechPaste已經成為國際化的產品。雖然生物除草劑產品在雜草防除技術中的比重 還很低，但利用微生物及其代謝產物作為除草劑已經成為該領域產業化的發展方向。根據 世界環境與發展大會要求，全世界生物農藥的產量要占農藥總產量的60 %。但是，就生物除 草而言，雖然目前遠未達到這一目標，但努力發展生物除草技術已逐漸成為全球的共識。

【發明內容】

[0004] 有鑒于此，本申請針對上述問題，提供了一株極細鏈格孢菌及其在生物除草中的 應用。
[0005] 為了解決上述技術問題，本申請公開了一株極細鏈格孢菌，其分類命名為極細鏈 格孢菌，Alternaria tenuissima，該菌株于2016年01月11日保藏于中國北京市朝陽區北辰 西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC Νο·11992〇
[0006] 本申請還公開了一種上述的極細鏈格孢菌的發酵濾液的制備方法，包括以下步 驟:在培養7d后的菌落邊緣取菌絲塊打成直徑為5mm菌餅，接種到200mLPDB培養液中，每瓶 接5塊，25°C 180r HiirT1培養5d，培養液真空抽濾，濾液再用0.45μπι微孔濾膜過濾，得發酵濾 液。
[0007] 本申請還公開了一種上述的極細鏈格孢菌在生物除草的應用。
[0008] 進一步地，將該菌株的發酵濾液噴施于青稞、蠶豆或豌豆作物上，植株表現安全。
[0009]進一步地，發酵濾液具體是通過以下方法制備得到:在培養7d后的菌落邊緣取菌 絲塊打成直徑為5mm菌餅，接種到200mLPDB培養液中，每瓶接5塊，25 °C 180r HiirT1培養5d，培 養液真空抽濾，濾液再用0.45μπι微孔濾膜過濾，得發酵濾液。
[0010]進一步地，發酵濾液的噴施量為50mL/m2。
[0011] 進一步地，草為闊葉類雜草。
[0012] 進一步地，闊葉類雜草為豬殃殃、大刺兒菜、藜、冬葵或酸模葉寥中的一種或者幾 種。
[0013] 與現有技術相比，本申請可以獲得包括以下技術效果：
[0014] 1)本發明利用微生物資源防除雜草具有對作物影響小、環境負效應少、安全性高 等優點，符合可持續農業的發展，已受到世界各國的高度重視。對微生物除草劑的評價，理 論上主要依據兩條標準即有效性(藥效)和專一性(安全性）。雜草生防菌具備既對靶標雜草 具有強致病性又對作物相對安全兩大特點。
[0015] 2)本發明針對青稞、蠶豆、豌豆田的豬殃殃、藜、冬葵等闊葉雜草，篩選一種極細鏈 格孢菌菌株，用于生物除草。本發明能有效安全地控制和防治部分闊葉雜草，成本低，無污 染，低殘留對環境友好。
[0016] 當然，實施本申請的任一產品必不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。
【附圖說明】
[0017] 此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構成本申請的一部分，本申 請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。在附圖中：
[0018] 圖1是本申請極細鏈格孢菌HZ-I的形態特征，其中I:菌落形態；Π :菌絲形態；m: 孢子；
[0019] 圖2是本申請基于ITS rDNA序列BLAST結果構建的菌株HZ-I的系統發育樹；
[0020]圖3是本申請極細鏈格孢菌HZ-I對酸模葉寥、大刺兒菜、冬葵和藜的離體致病效 果，其中，1-4分別為酸模葉寥、大刺兒菜、冬葵和藜對照組；Γ-4'分別為酸模葉寥、大刺兒 菜、冬葵和藜HZ-I處理組；
[0021]圖4是本申請極細鏈格孢菌HZ-I對豬殃殃、藜、冬葵和酸模葉寥的盆栽致病效果， 其中，1-4分別為豬殃殃、藜、冬葵和酸模葉寥對照組；Γ-4'分別為豬殃殃、藜、冬葵和酸模 葉寥HZ-I處理組；
[0022]圖5是本申請極細鏈格孢菌HZ-I對青稞、油菜、小麥、豌豆、蠶豆的安全性測定，其 中，1-5分別為青稞、油菜、小麥、豌豆、蠶豆對照組；Γ-5'分別為青稞、油菜、小麥、豌豆、蠶 豆HZ-I處理組。
【具體實施方式】
[0023] 以下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應用 技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。
[0024] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0025]實施例1菌的分離與鑒定
[0026] 一、菌的分離與純化
[0027] 參照"植病研究方法"（方中達編著，中國農業出版社，2007.4)中有關病原真菌的 分離方法，對采集自互助的老鸛草植株病葉按組織分離法進行分離純化，斜面培養后4°C冰 箱保存。根據采集地將分離得到的菌株命名為HZ-I。
[0028]二、鑒定
[0029]將菌株HZ-I置于PDA平板培養基上進行培養，定期觀察菌落生長速度、菌落形態及 色澤變化，光學顯微鏡下觀察其菌絲、孢子形態。結合《真菌鑒定手冊》(魏景超編著，上海科 學技術出版社，1979.9)進行初步鑒定。
[0030] 菌體的形態和生理生化特性：
[0031 ]菌株HZ-I于PDA平板上菌落疏松，易挑取。菌落圓形，初期為白色，后期于菌落邊緣 逐漸變為黑色，直至整個平板。基內菌絲及氣生菌絲發達，氣生菌絲呈放射狀，且基內菌絲 于初期呈黑色，顯微觀察顯示菌絲有隔。分生孢子易萌發，有隔。
[0032](二）16S rDNA試驗
[0033] 細胞總DNA提取方法參照王彥芹(基因組學與應用生物學，2010，5)中的方法。
[0034] 真菌通用引物ITS 1和ITS 4,其序列如下：
[0035] ITSl(5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，），其核苷酸序列如SEQIDN0:l所示，19bp;
[0036] ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATGTGC-3，），其核苷酸序列如SEQIDN0:2所示，20bp;
[0037] PCR擴增反應體系如下：4yL dNTP Mixture，ITS4和ITS5各 1.0yL，6.0yL的IOXTaq reaction buffer，I .OyL Taq DNA polymerase，模板DNA為2yL，35.OyL無菌去離子水。PCR 循環設置如下:94°C預變性5min;94°C變性lmin，51°C退火lmin，72°C延伸lmin，共設35個循 環。收集PCR產物進行測序，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，大小為545bp，測序結果用 chromas. exe軟件進行序列修正，從NCBI Blast檢索與目標序列同源性高的DNA序列，與本 試驗所測序列分別進行菌株種內比對。利用MEGA5.0軟件近鄰歸群法構建系統發育樹。 [0038] 采用通用引物ITSl和ITS4,自菌株HZ-I的基因組DNA中擴增獲得片段大小為545bp 的ITS片段。發現該菌的ITS與鏈格孢菌屬的ITS高度相似，其中與Alternaria sp.的同源性 最高。結合形態學特征，鑒定結果表明：菌株HZ-I與(Alternaria tenuissima)為同一個屬。
[0039] 基于以上特征，將菌株HZ-1鑒定為Alternaria tenuissima。該菌株已于2016年01 月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰 西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 11992。
[0040] 實施例2菌株HZ-I對闊葉雜草的致病性的影響
[00411將田間生長4~5葉期，葉色正常的藜、冬葵、酸模葉寥，4~6輪生葉期的豬殃殃移 栽于花盆（Φ= 15cm)中，于實驗室內培養;將生防真菌在PDB培養液中擴大培養120h后，制 成IO7個· ml/1的發酵液后噴霧接種到移栽的健康雜草植株上，接種量為30mL/盆。以接種 PDB培養液的植株作為空白對照;設3次重復。接種后的雜草植株置于室溫，用JBX-3.5離心 式工業加濕器保持相對濕度為60%，12h光暗交替培養。7d后調查雜草發病程度，稱鮮重，計 算發病率、鮮重效、病情指數，所有數據采用DPS統計軟件進行差異顯著性分析。
[0042]如圖3和圖4所示，噴施菌株HZ-I發酵液后，5種雜草表現出不同程度的受害癥狀， 豬殃殃表現為葉片卷曲，莖葉發黑，藜和酸模頂部葉片出現萎蔫，冬葵葉片褪綠變黃，刺兒 菜出現大面積病斑。結合發病率、鮮重效和病情指數綜合分析(見表1 )，HZ-I發酵液對豬殃 殃、藜致病效果突出，與其它闊葉雜草相比差異顯著，HZ-I可作為防除豬殃殃、藜的候選菌 株，進行進一步繼續研究。
[0043]表1菌株發酵液對不同雜草致病力
L〇〇45」 汪：冋列小冋小與子母表不在0.05?^干上差丼M者。
[0046] 實施例3菌株HZ-I對作物的安全性的影響
[0047] 將青海省5種主栽作物:春小麥(青春587)、春油菜(青雜5號）、蠶豆(青海9號）、豌 豆(草原224)、青稞(北青8號)分別種植于?=15cm花盆中，室內培養備用。HZ-I發酵液稀釋 后按上述方法接種于到3~4葉期的作物植株上，設3次重復，接種7d后觀察供試作物的發病 情況，記載發病程度。
[0048]如圖5所示，HZ-I菌株發酵液接種后對春小麥(青春587)、豌豆(草原224)、蠶豆(青 海9號）、青稞(北青8號）均無致病性，作物長勢和株高與對照植株相比均未受影響，表現為 沒有反應(NS);對春油菜(青雜5號)有輕微的致病性，接種后3d，5%葉片出現萎蔫，有零星 斑點，后期癥狀不擴展，表現為輕微反應(LS)。
[0049]上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明并非 局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改 和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行 改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍，則都應在發明所附權 利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一株極細鏈格孢菌，其特征在于，其分類命名為極細鏈格孢菌，Alternaria tenuissima，該菌株于2016年01月11日保藏于中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 11992。2. -種如權利要求1所述的極細鏈格孢菌的發酵濾液的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟:在培養7d后的菌落邊緣取菌絲塊打成直徑為5mm菌餅，接種到200mLPDB培養液中， 每瓶接5塊，25°C 180r mirT1培養5d，培養液真空抽濾，濾液再用0.45μπι微孔濾膜過濾，得發 酵濾液。3. 權利要求1所述的極細鏈格孢菌在生物除草中的應用。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，將該菌株的發酵濾液噴施于青稞、蠶豆或 豌豆作物上，植株表現安全。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述發酵濾液具體是通過以下方法制備得 到:在培養7d后的菌落邊緣取菌絲塊打成直徑為5mm菌餅，接種到200mLPDB培養液中，每瓶 接5塊，25°C 180r mirT1培養5d，培養液真空抽濾，濾液再用0.45μπι微孔濾膜過濾，得發酵濾 液。6. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述發酵濾液的噴施量為50mL/m2。7. 根據權利要求權利要求3至6中的任一權利要求所述的應用，其特征在于，所述草為 闊葉類雜草。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述闊葉類雜草為豬殃殃、大刺兒菜、藜、 冬葵或酸模葉寥中的一種或者幾種。
【文檔編號】C12R1/645GK105861318SQ201610229836
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月13日
【發明人】郭青云, 朱海霞, 程亮, 李瑋, 翁華, 魏有海, 郭良芝
【申請人】青海省農林科學院