京尼平交聯魚源膠原復合材料及其制備方法
【專利摘要】一種京尼平交聯魚源膠原復合材料，所述復合材料由魚源酶促溶性膠原蛋白和京尼平制成，所述魚源酶促溶性膠原蛋白從魚皮中獲得，所述京尼平溶液是京尼平用溶劑溶解，質量體積比為0.625％～1.0％。本發明還涉及一種京尼平交聯魚源膠原復合材料的制備方法。在上述復合材料及其制備方法中，采用胃蛋白酶結合鹽析提取的方法提取魚皮中的膠原蛋白，得到魚源酶促溶性膠原蛋白，再與天然生物交聯劑京尼平進行交聯，具有細胞毒性小和良好的生物相容性特點。
【專利說明】
京尼平交聯魚源膠原復合材料及其制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及海洋生物醫用材料領域，特別涉及一種京尼平交聯魚源膠原復合材料及其制備方法。
【背景技術】
[0002]我國是水產品加工大國，其中山東省水產品加工總量連續多年居全國第一。由此產生大量的水產品加工下腳料，這些下腳料大多被遺棄或簡單地充作低值資源利用，沒有做到物盡其用，有時還污染了環境。羅非魚、金槍魚和魷魚是我國加工量比較大且集中的溫帶或熱帶水生生物，每年產生大量魚皮、魚骨、魚頭等下腳料。研究表明魚皮干物質70%以上為膠原。
[0003]近年來，瘋牛病、口蹄疫等流行病頻發，國際上對哺乳動物膠原生物材料檢疫非常嚴格，為其應用帶來了困擾。此外，在某些宗教人群中，豬來源的膠原被禁止使用。在這種情況下，醫用生物材料的研究逐漸傾向于水產膠原。國外有關學者利用海蜇膠原制備了一種軟骨組織支架;在國內，發現利用魷魚皮和草魚膠原構建膠原海綿的研究。
[0004]目前，與人工合成的生物材料(如聚乳酸、聚羥基乙酸等)相比，熱變性溫度過低、機體內降解速率過快以及材料機械性能不理想是天然膠原蛋白的主要不足之處。國內外學者圍繞天然膠原蛋白的性能改進開展了大量前沿研究，其中分子交聯技術是改善天然膠原蛋白性能的常用手段之一。
[0005]傳統的交聯方法大都使用化學合成類交聯劑進行，而這類交聯劑本身具有相對較高的細胞毒性，導致所得的生物材料在植入受體以后，會影響正常組織的生長。

【發明內容】

[0006]基于此，有必要提供一種細胞毒性小、生物相容性好的京尼平交聯魚源膠原復合材料及其制備方法。
[0007]—種京尼平交聯魚源膠原復合材料，所述復合材料由魚源酶促溶性膠原蛋白和京尼平制成，所述魚源酶促溶性膠原蛋白從魚皮中獲得，所述京尼平溶液是京尼平用溶劑溶解，質量體積比為0.6 2 5 %?1.0 %。
[0008]在其中一個實施例中，所述魚皮為羅非魚、金槍魚或魷魚的魚皮。
[0009]—種京尼平交聯魚源膠原復合材料的制備方法，包括以下步驟:
[0010]提供魚皮，采用正丁醇對所述魚皮進行脫脂，得到脫脂魚皮；
[0011]采用蒸餾水清洗所述脫脂魚皮后，將所述脫脂魚皮浸泡在NaOH水溶液中以除去所述脫脂魚皮的非膠原成分，然后水洗至中性得到魚皮膠原蛋白；
[0012]往所述魚皮膠原蛋白中加入0.2mol/L?0.5mol/L的醋酸溶液和1%?2%胃蛋白酶，并在4°C磁力攪拌提取48h?72h，離心后上清液得到酶促溶性膠原蛋白；
[0013]往所述酶促溶性膠原蛋白加入NaCI溶液，離心，收集沉淀物溶于0.2mol/L?0.5mol/L醋酸溶液中，采用Na2HP04溶液透析后離心，收集沉淀物復溶于0.2mol/L?0.511101/1的醋酸溶液中，采用0.0211101/1?0.111101/1的醋酸溶液透析后再用蒸餾水透析，得到未經交聯的酶促溶性膠原蛋白溶液；
[0014]往所述酶促溶性膠原蛋白溶液中加入質量分數為0.625?I%的京尼平交聯劑，所述魚源酶促溶性膠原蛋白和所述京尼平的質量比為:1:100?200，在25°C下靜置交聯反應Ih?3h，凍干，隨后用磷酸鹽緩沖液漂洗，再用蒸餾水清洗，冷凍干燥，得到京尼平交聯魚源膠原復合材料。
[0015]在其中一個實施例中，所述正丁醇的體積百分比為10%?15%，所述魚皮與所述正丁醇的質量體積比w/v為1:20?1:40;所述脫脂時間為24h?48h。
[0016]在其中一個實施例中，所述NaOH水溶液的濃度為0.lmol/L?0.4mol/L，所述脫脂魚皮與所述NaOH水溶液的質量體積比w/v為1: 20?1: 50，所述脫脂魚皮浸泡在NaOH水溶液中的浸泡時間為24h?48h。
[0017]在其中一個實施例中，在往所述魚皮膠原蛋白中加入0.2mol/L?0.5mol/L的醋酸溶液和1%?2%胃蛋白酶中，所述魚皮膠原蛋白和所述醋酸溶液的質量體積比w/v為I: 20
?1:50ο
[0018]在其中一個實施例中，往所述酶促溶性膠原蛋白加入NaCl溶液至最終NaCl濃度為
0.9mol/L?lmol/L，所述Na2HP04溶液的濃度為0.02mol/L?0.lmol/L。
[0019]在其中一個實施例中，采用0.02moVL?0.lmol/L的醋酸溶液透析的時間為Id?2d，采用蒸餾水透析的時間為2d?3d。
[0020]在其中一個實施例中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.0IM?0.02M，pH為7.4?8.4。
[0021]在其中一個實施例中，所述魚皮來自羅非魚、金槍魚或魷魚的魚皮。
[0022]在上述京尼平交聯魚源膠原復合材料及其制備方法，京尼平是傳統中藥杜仲的活性成分之一，是從京尼平甙中分離、提純而獲得的。京尼平屬于環烯醚萜類的化合物，具有羥基、羧基等多個活性官能基團，而且可以以單分子和多分子形式進行交聯，這些都為使京尼平成為膠原體系比較理想的交聯劑提供了良好的基礎條件。魚皮中的主要成分為膠原蛋白(占總質量70%以上)，采用胃蛋白酶結合鹽析提取的方法提取魚皮中的膠原蛋白，得到魚源酶促溶性膠原蛋白，再與天然生物交聯劑京尼平進行交聯，具有細胞毒性小和良好的生物相容性特點。
【附圖說明】
[0023]圖1為一實施方式的京尼平交聯魚源膠原復合材料制備方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合實施方式及附圖，對京尼平交聯魚源膠原復合材料及其制備方法作進一步的詳細說明。
[0025]—實施方式的京尼平交聯魚源膠原復合材料，該復合材料由魚源酶促溶性膠原蛋白和京尼平制成。其中，所述魚源酶促溶性膠原蛋白從魚皮中獲得，所述京尼平溶液是京尼平用溶劑溶解，質量體積比為0.6 2 5 %?1.0 %。
[0026]在一實施方式中，該魚源酶促溶性膠原蛋白從魚皮中獲得。該魚皮為羅非魚、金槍魚、魷魚魚皮。魚皮是魚類加工業過程中產生的廢棄物，其利用程度很低，只有小部分被加工成飼料和肥料，絕大部分被直接丟棄，不僅嚴重污染了環境，而且造成了資源的浪費。魚皮的主要成分為纖維狀膠原蛋白，其含量最高可占蛋白質總量的80%，因此從魚皮中提取膠原蛋白不僅能夠充分利用資源，提高魚類加工的附加值，而且可以減少環境污染，對促進魚類加工業的發展具有重要意義。
[0027]京尼平是傳統中藥杜仲的活性成分之一，是從京尼平甙中分離、提純而獲得的。京尼平屬于環烯醚萜類的化合物，具有羥基、羧基等多個活性官能基團，而且可以以單分子和多分子形式進行交聯，這些都為使京尼平成為膠原體系比較理想的交聯劑提供了良好的基礎條件。
[0028]請參閱圖1，一實施方式的京尼平交聯魚源膠原復合材料的制備方法，包括以下步驟:
[0029]S110、提供魚皮，采用正丁醇對該魚皮進行脫脂，得到脫脂魚皮。
[0030]在一實施方式中，魚皮來自羅非魚、金槍魚、魷魚的魚皮。
[0031]在一實施方式中，該正丁醇的體積百分比為10%?15%，該魚皮與該正丁醇的質量體積比w/v為1:20?1:40;該脫脂時間為24h?48h。采用正丁醇脫脂，正丁醇揮發性較好，魚皮中殘留毒性較小。
[0032]S120、采用蒸餾水清洗該脫脂魚皮后，將該脫脂魚皮浸泡在NaOH水溶液中以除去該脫脂魚皮的非膠原成分，然后水洗至中性得到魚皮膠原蛋白。NaOH溶液對蛋白質有極高的溶出率，在溶出雜蛋白的同時，魚皮原料中膠原蛋白(羥脯氨酸)的流失率也低于其他脫雜試劑。
[0033]在一實施方式中，該NaOH水溶液的濃度為0.lmol/L?0.4mol/L，該脫脂魚皮與NaOH水溶液的質量體積比w/v= 1: 20?1: 50。該脫脂魚皮浸泡在NaOH水溶液中的浸泡時間為24h?48h。
[0034]S130、往該魚皮膠原蛋白中加入0.2mol/L?0.5mol/L的醋酸溶液和I %?2%胃蛋白酶，并在4°C磁力攪拌提取48h?72h，離心后上清液得到酶促溶性膠原蛋白(Pepsin-soluble collagen,PSC)。采用低濃度的醋酸能更大程度的破壞分子間的離子鍵，使膠原纖維溶脹，膠原蛋白提取率升高。胃蛋白酶能溶解膠原蛋白，專一催化膠原蛋白的非螺旋區端肽，使提取率升高。
[0035]在一實施方式中，該魚皮膠原蛋白和該醋酸溶液的質量體積比w/v為1:20?1:50。在一實施方式中，該胃蛋白酶具體為胃蛋白酶(750U，Sigma)。
[0036]S140、往該酶促溶性膠原蛋白加入NaCl溶液，離心，收集沉淀物溶于0.2mol/L?0.5mol/L醋酸溶液中，采用Na2HPO4溶液透析后離心，收集沉淀物溶于0.2moVL?0.5mol/L的醋酸溶液中，采用0.02mol/L?0.lmol/L的醋酸溶液透析后再用蒸餾水透析，得到未經交聯的酶促溶性膠原蛋白溶液。利用Na2HPO4溶液將無機鹽等小分子物質降低到最小值。
[0037]其中，往該酶促溶性膠原蛋白加入NaCl溶液至最終NaCl濃度為0.9mol/L?Imol/L，該Na2HPO4溶液的濃度為0.02mol/L?0.lmol/L。采用0.02mol/L?0.lmol/L的醋酸溶液透析的時間為I d?2d，采用蒸餾水透析的時間為2d?3d。
[0038]S150、往該酶促溶性膠原蛋白溶液中加入京尼平交聯劑，所述京尼平溶液是京尼平用溶劑溶解，質量體積比為0.625%?1.0%，在25°C下靜置交聯反應Ih?3h，凍干，隨后用磷酸鹽緩沖液漂洗，再用蒸餾水清洗，冷凍干燥，得到京尼平交聯魚源膠原復合材料。
[0039]在一實施方式中，該磷酸鹽緩沖液的濃度為0.0lM?0.02M，pH為7.4?8.4。
[0040]在上述京尼平交聯魚源膠原復合材料及其制備方法，京尼平是傳統中藥杜仲的活性成分之一，是從京尼平甙中分離、提純而獲得的。京尼平屬于環烯醚萜類的化合物，具有羥基、羧基等多個活性官能基團，而且可以以單分子和多分子形式進行交聯，這些都為使京尼平成為膠原體系比較理想的交聯劑提供了良好的基礎條件。魚皮中的主要成分為膠原蛋白(占總質量80%以上)，采用胃蛋白酶結合鹽析提取的方法提取魚皮中的膠原蛋白，得到魚源酶促溶性膠原蛋白，再與天然生物交聯劑京尼平進行交聯，具有細胞毒性小和良好的生物相容性特點。
[0041 ] 實施例
[0042]實施例1
[0043]取15g羅非魚魚皮用10%&)正丁醇(《八=1:20)脫脂2411(811更換一次)，蒸餾水沖洗后用濃度為0.lmol/L的NaOH水溶液中浸泡24h(w/v= 1:20)以除去非膠原成分(8h更換一次)，水洗至中性ο然后加入0.5mol/L醋酸溶液(w/v = 1: 50)和I %的胃蛋白酶(750U，Sigma)，4°C磁力攪拌提取48h，10000r/min離心30min，上清液即為酶促溶性膠原蛋白。在上清液中加入NaCl至最終濃度C(NaCl) = 0.9mol/L，離心，收集沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液中，用0.02mol/L的Na2HPO4溶液(pH8.6)透析24h后離心收集沉淀，重新溶解于0.5mol/L醋酸溶液中，用0.lmol/L醋酸溶液透析ld，再用蒸餾水透析2d，即可得到未經交聯的酶促溶性膠原蛋白溶液。取上述溶液1ml，加入0.625%的京尼平交聯劑，在25°C下靜置交聯反應3h，凍干，隨后用磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)漂洗數次，最后用蒸餾水清洗，冷凍干燥，即得到羅非魚魚皮京尼平交聯魚源膠原復合材料。
[0044]實施例2
[0045]取30g(金槍魚)魚皮用12%(7)正丁醇(《八=1:40)脫脂4811(811更換一次)，蒸餾水沖洗后用濃度為0.4mol/L的NaOH水溶液中浸泡48h(w/v= 1:20)以除去非膠原成分(8h更換一次)，水洗至中性。然后加入0.5mo 1/L醋酸溶液(w/v = 1: 50)和I %的胃蛋白酶(750U，Sigma)，4°C磁力攪拌提取48h，10000r/min離心30min，上清液即為酶促溶性膠原蛋白。在上清液中加入NaCl至最終濃度C(NaCl) = lmol/L，離心，收集沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液中，用0.lmol/L的Na2HPO4溶液(pH8.6)透析24h后離心收集沉淀，重新溶解于0.5mol/L醋酸溶液中，用0.lmol/L醋酸溶液透析2d，再用蒸餾水透析2d，即可得到未經交聯的酶促溶性膠原蛋白溶液。取上述溶液10ml，加入1%的京尼平交聯劑，在25°C下靜置交聯反應3d，凍干，隨后用磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH8.4)漂洗數次，最后用蒸餾水清洗，冷凍干燥，即得到金槍魚魚皮京尼平交聯魚源膠原復合材料。
[0046]實施例3
[0047]取1g(魷魚)魚皮用15%(0正丁醇(《八=1:30)脫脂3611(811更換一次)，蒸餾水沖洗后用濃度為0.2mol/L的NaOH水溶液中浸泡24h(w/v= 1:20)以除去非膠原成分(8h更換一次)，水洗至中性ο然后加入0.2mol/L醋酸溶液(w/v = 1: 20)和I %的胃蛋白酶(750U，Sigma)，4°C磁力攪拌提取48h，10000r/min離心30min，上清液即為酶促溶性膠原蛋白。在上清液中加入NaCl至最終濃度C(NaCl) = 0.9mol/L，離心，收集沉淀溶于0.2mol/L醋酸溶液中，用0.02mol/L的Na2HPO4溶液(pH8.6)透析24h后離心收集沉淀，重新溶解于0.2mol/L醋酸溶液中，用0.02mol/L醋酸溶液透析ld，再用蒸餾水透析2d，即可得到未經交聯的酶促溶性膠原蛋白溶液。取上述溶液1ml，加入0.625%的京尼平交聯劑，在25°C下靜置交聯反應3d，凍干，隨后用磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)漂洗數次，最后用蒸餾水清洗，冷凍干燥，即得到魷魚魚皮京尼平交聯魚源膠原復合材料。
[0048]實施例4
[0049]取50g羅非魚魚皮用15%(v)正丁醇(w/v=l:50)脫脂48h(8h更換一次)，蒸饋水沖洗后用濃度為0.4mol/L的NaOH水溶液中浸泡48h(w/v= 1:20)以除去非膠原成分(8h更換一次)，水洗至中性。然后加入0.5moI/L醋酸溶液(w/v = 1: 50)和2 %的胃蛋白酶(750U，Sigma)，4°C磁力攪拌提取48h，10000r/min離心30min，上清液即為酶促溶性膠原蛋白。在上清液中加入NaCl至最終濃度C(NaCl) = lmol/L，離心，收集沉淀溶于0.5mol/L醋酸溶液中，用0.lmol/L的Na2HPO4溶液(pH8.6)透析48h后離心收集沉淀，重新溶解于0.5mol/L醋酸溶液中，用0.lmol/L醋酸溶液透析2d，再用蒸餾水透析3d，即可得到未經交聯的酶促溶性膠原蛋白溶液。取上述溶液10ml，加入1%的京尼平交聯劑，在25°C下靜置交聯反應3d，凍干，隨后用磷酸鹽緩沖液(0.02M，pH8.4)漂洗數次，最后用蒸餾水清洗，冷凍干燥，即得到羅非魚魚皮京尼平交聯魚源膠原復合材料。
[0050]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1.一種京尼平交聯魚源膠原復合材料，其特征在于，所述復合材料由魚源酶促溶性膠原蛋白和京尼平制成，所述魚源酶促溶性膠原蛋白從魚皮中獲得，所述京尼平溶液是京尼平用溶劑溶解，質量體積比為0.6 2 5 %?1.0 %。2.根據權利要求1所述的京尼平交聯魚源膠原復合材料，其特征在于，所述魚皮為羅非魚、金槍魚或魷魚的魚皮。3.—種京尼平交聯魚源膠原復合材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 提供魚皮，采用正丁醇對所述魚皮進行脫脂，得到脫脂魚皮； 采用蒸餾水清洗所述脫脂魚皮后，將所述脫脂魚皮浸泡在NaOH水溶液中以除去所述脫脂魚皮的非膠原成分，然后水洗至中性得到魚皮膠原蛋白； 往所述魚皮膠原蛋白中加入0.2mol/L?0.5mol/L的醋酸溶液和I %?2 %胃蛋白酶，并在4°C磁力攪拌提取48h?72h，離心后上清液得到酶促溶性膠原蛋白； 往所述酶促溶性膠原蛋白加入NaCl溶液，離心，收集沉淀物溶于0.2mol/L?0.5mol/L醋酸溶液中，采用Na2HPO4溶液透析后離心，收集沉淀物復溶于0.2mol/L?0.5mol/L的醋酸溶液中，采用0.02mol/L?0.lmol/L的醋酸溶液透析后再用蒸餾水透析，得到未經交聯的酶促溶性膠原蛋白溶液； 往所述酶促溶性膠原蛋白溶液中加入質量分數為0.625?1%的京尼平交聯劑，所述魚源酶促溶性膠原蛋白和所述京尼平的質量比為:1:100?200，在25°C下靜置交聯反應Ih?3h，凍干，隨后用磷酸鹽緩沖液漂洗，再用蒸餾水清洗，冷凍干燥，得到京尼平交聯魚源膠原復合材料。4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述正丁醇的體積百分比為10%?15%,所述魚皮與所述正丁醇的質量體積比w/v為1:20?1:40;所述脫脂時間為24h?48h。5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述NaOH水溶液的濃度為0.lmol/L?0.4mol/L，所述脫脂魚皮與所述NaOH水溶液的質量體積比w/v為1:20?1:50，所述脫脂魚皮浸泡在NaOH水溶液中的浸泡時間為24h?48h。6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，在往所述魚皮膠原蛋白中加入0.2mol/L?0.5mol/L的醋酸溶液和I %?2%胃蛋白酶中，所述魚皮膠原蛋白和所述醋酸溶液的質量體積比w/v為1:20?1:50。7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，往所述酶促溶性膠原蛋白加入NaCl溶液至最終NaCl濃度為0.9mol/L?lmol/L，所述Na2HP04溶液的濃度為0.02mol/L?0.lmol/L08.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，采用0.02moVL?0.lmol/L的醋酸溶液透析的時間為I d?2d，采用蒸餾水透析的時間為2d?3d。9.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.0lM?0.02Μ，ρΗ為7.4?8.4。10.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述魚皮來自羅非魚、金槍魚或魷魚的魚皮。
【文檔編號】C08J3/24GK105820355SQ201610206505
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月5日
【發明人】李 杰
【申請人】李 杰