一種生產表阿霉素的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及到一種表阿霉素的生產方法。
【背景技術】
[0002] 蒽環類抗生素用于抗腫瘤治療已經超過三十年，成為應用最廣泛的抗腫瘤抗生 素。表阿霉素與阿霉素是同分異構體，它們的抗腫瘤活性相當，但是表阿霉素的毒性更小。 同時隨著新劑型、同其它抗腫瘤藥物的新組合應用使得表阿霉素在臨床上的應用范圍越來 越廣泛，在市場上比阿霉素更有競爭力。
[0003] 表阿霉素通常通過化學合成得到。專利US5874550披露了一種表阿霉素的合成 方法，首先通過發酵得到柔紅霉素，然后將柔紅霉素4號位的羥基氧化成酮基，再將這個 酮基立體特異性地還原得到表柔紅霉素，通過表柔紅霉素最終合成得到表阿霉素。專利 US20070142309A1披露了以13-dihydrodaunorubicine為起始原料的合成表阿霉素的合成 方法。
[0004] 然而化學合成過程復雜，成本高，反應條件要求嚴格；同時生產過程中大量使 用溶劑，容易對環境造成污染。這些因素制約著表阿霉素的大規模生產與應用。而專利 US20110171691A1 披露了一種將 13-dihydr〇-epi_daunorubicin 轉化為表阿霉素的方法， 但是轉化率不到10%。因此發明新的生物轉化方法，提高表阿霉素的轉化效率以適合大規 模商業化生產具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種生產表阿霉素的方法，所述的方法包括如下步驟：將 有阿霉素生產能力的鏈霉菌培養后，收集濕菌絲體，濕菌絲體和表柔紅霉素在緩沖液中，將 表柔紅霉素生物轉化為表阿霉素。
[0006] 在優選的實施方案中，其中所述的有阿霉素生產能力的鏈霉菌優選自鏈霉 菌（Streptomyces sp. )H323，其保藏編號為 CGMCC N0. 4827 ;鏈霉菌（Streptomyces peucetius subsp. caesius),其保藏編號為 ATCC No. 27952 ;鏈霉菌（Streptomyces peucetius)，其保藏編號為 ATCC No. 29050。
[0007] 在優選的實施方案中，其中所述緩沖液的pH值優選為5. 0-8.0,更優選為 6. 0-7. 0,最優選為6. 5。
[0008] 在優選的實施方案中，其中所述生物轉化的轉化溫度優為20-40°C，更優選 25-33°C，最優選為 28-30°C。
[0009] 在優選的實施方案中，其中所述生物轉化的轉化時間優為10-100小時，更優選為 24-100 小時。
[0010] 本發明所述的緩沖液是采用常規方法配制的，在優選的實施方案中，其中所述緩 沖液中的鹽選自磷酸鹽，檸檬酸鹽。
[0011] 在優選的實施方案中，其中所述緩沖液優選但不限于磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩 沖液，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。
[0012] 在優選的實施方案中，所述濕菌絲體質量與緩沖液的體積比優選為1:1一 1:100， 更優選為1:5 -1:10,單位為g/ml。
[0013] 在優選的實施方案中，其中所述表柔紅霉素質量與緩沖液的體積比優選為10:1- 200:1，更優選為 10:1-100:1，單位為 μ g/ml。
[0014] 在本發明的實施方案中，有阿霉素生產能力的鏈霉菌可采用常規的方法進行培 養，例如液體培養等，并可以采用常規的方法進行收集濕菌絲體，例如離心等。
[0015] 本發明中所述的表柔紅霉素可經常規的發酵制備方法得到，例如參考文獻 Krishnamurthy Madduri，Jonathan Kennedy, Giovanni Rivola,Production of the antitumor drug epirubicin(4J-epidoxorubicin)and its precursor by a genetically engineered strain of Streptomyces peucetius，Nature Biotechnology， 1998, 16,69-74 的方法，或者表柔紅霉素可經常規的化學合成制備得到，例如可參考專利US4345068的方 法。
[0016] 本發明表柔紅霉素和表阿霉素檢測方法如下：
[0017] 色譜柱為 C18 柱，5μL?，4· 6X250mm ;
[0018] 流動相：緩沖液：乙腈：甲醇=500 : 500 : 60 ;
[0019] 緩沖液：取十二烷基硫酸鈉1. 44g和磷酸0. 68ml溶于500ml超純水中；
[0020] 流速：1. 35ml/min ;
[0021] 檢測波長：254mn;
[0022] 進樣量：10 μ 1。
[0023] 生物轉化高度依賴于轉化條件的選擇，現有技術中沒有找到一種合適的生物轉化 條件可以高效率將表柔紅霉素轉化為表阿霉素。本發明通過大量的篩選實驗找到了一種將 表柔紅霉素高效率地轉化為表阿霉素的生物轉化方法，本發明方法操作簡單，易行，更適合 工業化生產，并且本發明表柔紅霉素轉化為表阿霉素的生轉化率較高，同時本發明的生物 轉化方法相比化學合成方法綠色環保。
[0024] 具體實施方法
[0025] 實施例1 :表柔紅霉素生物轉化為表阿霉素
[0026] 培養基配方（8/1):可溶性淀粉30，葡萄糖10，黃豆餅粉20,0&0)32，似(：13，？冊.5， 250mL的三角瓶裝25mL培養基，121°C滅菌20分鐘。鏈霉菌（Str印tomyces sp.)H323(其 保藏編號為CGMCC NO. 4827)在每個三角瓶接種量為105-106c. f. u. /mL，28°C，250rpmJ$ 養48小時。每瓶培養液轉入50mL離心管，4000rpm離心10分鐘后棄上清液得濕菌絲體。 將所得的濕菌絲體5. 0g分別加入到ρΗ5· 0、6· 0、6· 5、7· 0、8· 0,0· 2M磷酸氫二鈉-磷酸二 氫鈉緩沖液25mL中，把菌絲體混勻后轉入250mL三角瓶，同時加入10mg/mL的表柔紅霉素 250μ L，28°C，250rpm，轉化24小時。結果見表1。
[0027] 表1磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液轉化表柔紅霉素
[0028]
[0029] 實施例2 :表柔紅霉素生物轉化為表阿霉素
[0030] 培養基配方（8/1):可溶性淀粉30，葡萄糖10，黃豆餅粉20,0&0)32，似(：13，？冊.5， 250mL的三角瓶裝25mL培養基，121°C滅菌20分鐘。每個三角瓶鏈霉菌（Str印tomyces sp.) H323接種量為105-106c. f. u. /mL，28°C，250rpm，培養48小時。每瓶培養液轉入50mL離心 管，4000rpm離心10分鐘后棄上清液得濕菌絲體。將所得的濕菌絲體5. 0g分別加入pH5. 0、 6. 0、6. 5,1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液25mL，把菌絲體混勻后轉入250mL三角瓶，同時加入 10mg/mL的表柔紅霉素250 μ L，28°C，250rpm，轉化24小時。結果見表2。
[0031] 表2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液轉化表柔紅霉素
[0032]
[0033] 實施例3 :表柔紅霉素生物轉化為表阿霉素
[0034] 培養基配方（8/1):可溶性淀粉30，葡萄糖10，黃豆餅粉20,0&0)32，似(：13，？冊.5， 250mL的三角瓶裝25mL培養基，121°C滅菌20分鐘。每個三角瓶鏈霉菌（Str印tomyces sp.) H323接種量為105-106c. f. u. /mL，28°C，250rpm，培養48小時。每瓶培養液轉入50mL離心 管，4000rpm離心10分鐘后棄上清液得濕菌絲體。將所得的濕菌絲體5. 0g分別加入pH6. 5、 7. 5、8. 0,0. 05M磷酸二氫鉀-氫氧化鈉25mL，把菌絲體混勻后轉入250mL三角瓶，同時加入 10mg/mL的表柔紅霉素250 μ L，28°C，250rpm，轉化24小時。結果見表3。
[0035] 表3磷酸二氫鉀-氫氧化鈉轉化表柔紅霉素
[0036]
[0037] 實施例4 :表柔紅霉素生物轉化為表阿霉素
[0038] 實驗過程同實施例1，僅采用實施例1的pH6. 5的0. 2M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 緩沖液，而轉化時間分別為1〇、24、72、100小時。結果見表4。
[0039] 表4不同轉化時間的表柔紅霉素轉化率
[0040]
[0041] 實施例5 :表柔紅霉素生物轉化為表阿霉素
[0042] 實驗過程同實施例1，僅采用實施例1的pH6. 5的0. 2M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 緩沖液，而轉化溫度分別為20°C、25°C、28°C、30°C、33°C、40°C。結果見表5。
[0043] 表5表柔紅霉素在不同溫度下的轉化率
[0044]
[0045] 實施例6表柔紅霉素生物轉化為表阿霉素
[0046] 實驗過程同實施例1，僅采用實施例1的pH6. 5的0. 2M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 緩沖液，加入表柔紅霉素的量，使得表柔紅霉素質量（μ g)與緩沖液的體積（ml)比為10:1、 100:1、200:1、400:1、600:1、1000:1。結果見表 6。
[0047] 表6不同濃度的表柔紅霉素轉化率
[0048]
[0049] 實施例7表柔紅霉素生物轉化為表阿霉素
[0050] 實驗過程同實施例1，僅采用實施例1的pH6. 5的0. 2M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩 沖液，不同之處在于，菌絲體濕重（g)與緩沖液體積（ml)比例分別為1:1、1:5、1:10、1:100、 1:1000。結果見表7。
[0051] 表7不同菌絲體濕重與緩沖液體積比的表柔紅霉素轉化率
[0052]
[0053] 實例 8Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC No. 27952、Streptomyces peucetius ATCC No. 29050 生物轉化
[0054] 實驗過程同實施例1，僅采用實施例1的pH6. 5的0. 2M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩 沖液。不同之處在于，所用菌種為 Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC No. 27952 和 Streptomyces peucetius ATCC No. 29050。結果見表 8.
[0055] 表8不同菌種的表柔紅霉素轉化率 [00561
【主權項】
1. 一種生產表阿霉素的方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟：將有阿霉素生產 能力的鏈霉菌培養后，收集濕菌絲體，濕菌絲體和表柔紅霉素在緩沖液中，將表柔紅霉素生 物轉化為表阿霉素。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述的鏈霉菌選自鏈霉菌（Streptomyces sp.) !1323，其保藏編號為〇6]\0^繼.4827;鏈霉菌（31:代。1:〇1115^68口611〇61:;[118 8油8。.〇&68；[118), 其保藏編號為4了0：如.27952;鏈霉菌（5廿印丨〇11^〇6 8?6以^丨丨118)，其保藏編號為六丁0： No.29050。3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述緩沖液的pH值為5. 0-8. 0。4. 根據權利要求2所述的方法，其中所述的pH值為6. 0-7. 0,優選為6. 5。5. 根據權利要求1所述的方法，其中所述生物轉化的轉化溫度為20-40°C，優選 25-33°C，更優選為 28-30°C。6. 根據權利要求1所述的方法，其中所述生物轉化的轉化時間為10-100小時，優選為 24-100 小時。7. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中所述緩沖液中的鹽選自磷酸鹽，檸檬酸 鹽。8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述緩沖液選自磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液， 磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。9. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中所述濕菌絲體質量與緩沖液的體積比為 1:1-1:100,更優選為 1:5-1:10,單位為 g/ml。10. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中所述表柔紅霉素質量與緩沖液的體積 比為 10:1- 200:1，優選為 10:1-100:1，單位為 μ g/ml。
【專利摘要】本發明公開了一種表阿霉素的生產方法，該方法包括如步驟：將能產阿霉素的鏈霉菌通過培養后收集菌絲體，將收集的菌絲體和表柔紅霉素加入到緩沖液中，從而將表柔紅霉素轉化為表阿霉素。本發明方法操作簡單，易行，更適合工業化生產。
【IPC分類】C12R1/465, C12P19/46
【公開號】CN105624239
【申請號】CN201410591255
【發明人】周敏, 蔣興, 蔡珍珍
【申請人】浙江海正藥業股份有限公司
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2014年10月29日