一種高度純化胰激肽酶原的方法及提高胰激肽酶原穩定性的藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，具體地說是以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統與現代相結合的蛋白純化技術，制備胰激肽酶原。
【背景技術】
[0002]胰激肽酶原(kallikein)是從豬胰臟中分離純化制得的天然酶類藥物，臨床上又稱血管舒緩素，具有舒展毛細血管和小動脈的作用，在臨床上常用來治療高血脂，防治脂肪肝、動脈粥樣硬化、高血壓、心絞痛等多種疾病，它的開發具有重要的醫學和社會價值。在我國，胰激肽酶原生產還存在很大的發展空間。
[0003]傳統的純化胰激肽酶原的工藝由于工藝復雜、成本較高；離子交換層析是目前是適合胰激肽酶原工業化生產的最普遍方法；但通常需要采用多種進口離子交換介質對胰激肽酶原進行純化，不僅操作繁瑣，且因多次上柱使得回收率很低，以最具有實用價值的周祖萌等人的方法為例，通過在PH7.0、pH5.0、pH6.7條件下，依次將所得樣品上DEAE-Cellulose、DEAE_Sepharosecl-6B,得到了比活1500u/mg左右的胰激肽酶原，收率為40%。除此之外，目前國際上大多采用陰離子交換，結合陽離子交換，最后加一步凝膠過濾層析，并且離子交換過程中胰激肽酶原的洗脫都采用改變pH的方式，由于緩沖溶液的緩沖作用，使得柱內pH改變緩慢，周期延長，耗費大量緩沖液，以法國Graham S.Bailey的純化過程，雖然經三步純化后，胰激肽酶原比活高達1254u/mg，但收率只有28.4% ;其次有采用離子交換層析與親和層析或疏水層析相結合，步驟較多，純化周期較長且成本高昂，以英國Talal S.El.Thaher的純化過程為例，雖然收率達到87%，但胰激肽酶原比活只有156.3u/mg;再次，采用一種離子交換介質想要通過一次純化就獲得高純度和高收率的胰激肽酶原幾乎是不可能完成的任務，以李立桓等利用Amberlite-CG50 —步從胰酶中分離純化胰激肽酶原，但其比活和收率分別只有107.4u/mg和12.1%。
[0004]而本發明是靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統與現代相結合的蛋白純化技術，使用DEAE-瓊脂糖快膠具有高流速、高載量，可以有效的縮短生產周期，且對化學和熱穩定性好，產品的收率在同類工藝中處于領先地位；而胰激肽酶原分步洗脫的方法，雖然不能達到國際最高標準，但是依然超過了臨床用藥的要求，適合工業化生產。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是高度純化從合格的豬胰臟中提取的胰激肽酶原。
[0006]本發明的技術方案是:以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統與現代相結合的蛋白純化技術，高度純化胰激肽酶原。本發明具有生產周期短，對化學和熱穩定性好、成本低的特點，非常適用于規模化大生產。包括如下步驟:
(1)醋酸提取:將豬胰臟制成丙酮粉后，加醋酸溶液攪拌提取，離心，得上清液；
(2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得胰激肽酶原粗品；
(3)氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜:將粗品用氯化鈉溶液溶解，用氨水調PH，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液中加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得胰激肽酶原中間品;
(4)離子交換層析:將胰激肽酶原中間品溶于18~22倍量的0.0005-0.0015mol/L醋酸緩沖液(PH4.5)中，離心，得上清液；取上清液，按1:8~12的體積比上DEAE-瓊脂糖快膠柱吸附，吸附平衡后，用含0.15-0.25mol/L氯化鈉的0.0lmol/L醋酸緩沖液洗脫至基線，再用含0.25-0.45mol/L氯化鈉的0.0lmol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液透析脫鹽，凍干，得胰激肽酶原精品。
【具體實施方式】
[0007]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0008]實施例1
所述的以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統與現代相結合的蛋白純化技術，制備胰激肽酶原，包括如下步驟:
(1)醋酸提取:將豬胰臟10Kg制成丙酮粉后，加入30倍量的醋酸溶液，攪拌提取，離心，得上清液29.8L。
[0009](2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得膜激妝酶原粗品93g。
[0010](3)氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜:將粗品用50倍量氯化鈉溶液溶解，用氨水調PH，攪拌混合，過濾，得濾液；，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得胰激肽酶原中間品60g。
[0011](4)離子交換層析:將胰激肽酶原中間品溶于20倍量的0.001mol/L醋酸緩沖液(pH4.5)中，離心，得上清液；取上清液，按1:10的體積比上DEAE-瓊脂糖快膠柱吸附，吸附平衡后，用含0.2mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液洗脫至基線，再用含0.35mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液透析脫鹽，凍干，得胰激肽酶原精品42g。
[0012]實施例2
將實施例1制備的胰激肽原酶6000單位、預膠化淀粉21.7g置混合機內，攪拌5分鐘，再加入糊精32.5g、糖粉20.lg、檸檬酸三鈉0.08g、羧甲基纖維素鈉1.5g于混合機內，攪拌20分鐘后將預先配好的粘合劑(取L-羥丙基纖維素2.0g加75%乙醇20ml使溶解，即得)和潤滑劑硬脂酸鎂0.0037g，緩緩均勻地加入混合機內攪拌，至顆粒形成，放入制粒機中制粒，中間體檢驗，合格后用壓片機制成1000片，片芯檢驗合格后包腸溶衣。
[0013]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。
【主權項】
1.一種高度純化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的藥物組合物，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)醋酸提取:將豬胰臟制成丙酮粉后，加醋酸溶液攪拌提取，離心，得上清液； (2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀；沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得胰激肽酶原粗品； (3)氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜:將粗品用氯化鈉溶液溶解，用氨水調PH，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液中加入丙酮沉淀；沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得胰激肽酶原中間品; (4)離子交換層析:將胰激肽酶原中間品溶于醋酸緩沖液中，離心，得上清液；取上清液，上DEAE-瓊脂糖快膠柱吸附，吸附平衡后，用含氯化鈉的醋酸緩沖液洗脫至基線，再用含氯化鈉的醋酸緩沖液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液透析脫鹽，凍干，得胰激肽酶原精品。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，胰激肽酶原中間品與醋酸溶液的比例為:lKg: 18~22L，醋酸溶液的濃度為:0.0005-0.0015mol/L, pH值為4.5。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，洗脫至基線的含氯化鈉的醋酸緩沖液為含0.15-0.25mol/L氯化鈉的0.0lmol/L醋酸緩沖液；第二次洗脫用的含氯化鈉的醋酸緩沖液為含0.25-0.45mol/L氯化鈉的0.01mol/L醋酸緩沖液。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(4)中用新型的陰離子交換柱吸附，所用的離子交換介質為DEAE-瓊脂糖快膠，DEAE-瓊脂糖快膠與上清液的體積比為:8~12:Ιο5.一種藥物組合物，其含有根據權利要求1-4制備的胰激肽酶原作為活性成分，還含有預膠化淀粉、糊精、糖粉、L-羥丙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂、檸檬酸三鈉、75%乙醇。
【專利摘要】本發明公開了一種高度純化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的藥物組合物。本發明的技術方案是以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協同除雜，離子交換樹脂DEAE-瓊脂糖快膠分步洗脫等傳統與現代相結合的蛋白純化技術，高度純化胰激肽酶原。本發明具有生產周期短，對化學和熱穩定性好、成本低的特點，非常適用于規模化大生產。
【IPC分類】A61K38/48, C12N9/64, A61P3/06, A61P9/10, A61P1/16, A61P9/12
【公開號】CN105385670
【申請號】CN201510820397
【發明人】劉乃山, 林曉磊, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業有限公司
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年11月24日