源于桔青霉的penicitrinine A及其制備抗人結直腸癌藥物的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥領域，具體涉及一種源于桔青霉的penicitrinine A及制備其抗 人結直腸癌藥物的應用。
【背景技術】
[0002] 生物堿是一類由生物次級代謝產生的含氮有機化合物，自然界中的生物堿種類較 多，大多來源于植物，因此又有植物堿之稱。生物堿對人和動物有重要的生理作用，包括平 喘鎮咳、降血糖、降血脂、抗菌、抗腫瘤、鎮痛等，其中以抗菌、抗腫瘤活性最為突出。天然結 構生物堿是創新藥物研究中發現先導化合物的重要來源，目前應用于臨床的生物堿藥物已 經近百種。研究發現，一些海洋真菌能夠在次級代謝過程中產生結構新穎、活性好的生物 堿，具有很好的藥用和產業化前景。
[0003] 本發明人研究得知，桔青霉IBPT-5，（已于2013年12 月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，地址：武漢武漢大學，保藏編號是：CCTCC NO :M 2013713)的發酵產物的粗提取物有很好的細胞增殖抑制活性，遂對其活性成分進行研究。 研究發現所示生物堿類化合物具有抗人結直腸癌活性，目前尚未見該化合物對人結直腸癌 細胞SW-480、SW-620、LOVO的增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關的藥 物。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種源于桔青霉的penicitrinine A及其制備抗人結直腸 癌藥物的應用。該化合物具有抑制人結直腸癌細胞增殖作用，具有抗人結直腸癌活性。其 結構式為：
[0005] 該化合物的制備方法，是通過發酵培養桔青霉ciiriiwa?) IBPT-5， 獲取發酵物，然后從發酵物中分離純化出該化合物。具體步驟如下： 1發酵生產 培養微生物的常規方法，取桔青霉ciiri/wa?) IBPT-5接種到PDA固體 斜面培養基上在28°C培養箱中培養4天，然后接種到培養液中，28°C靜止培養30天后，獲得 菌絲體和發酵液；所述培養液組成：每升水含甘露醇20.0 g、酵母膏3.0 g、麥芽糖20.0 g、 味精 10.0 g、葡萄糖 10.0 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.3 g、NaCl 30.0 g; 2浸膏的獲得 用紗布將菌絲體和發酵液分離。將發酵液用乙酸乙酯1:2 (v/v)萃取兩次，萃取液減 壓蒸餾至干，得到發酵液的乙酸乙酯浸膏32.0 g。
[0006] 3化合物的分離精制 該浸膏通過100-200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色 譜柱梯度洗脫，得到11個組分。組分7 (4.2 g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:l的洗脫物）以 二氯甲烷：甲醇為洗脫液，進一步通過加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的亞組分7-6 (二氯 甲烷：甲醇￥八=50:1的洗脫物）通過半制備液相色譜（1010型003-厶，10\250臟，5以111) : 分離流速為5 mL/min，流動相為75%乙腈含0. 1% TFA，得到所示化合物（97. 9 mg，tR 19. 3 min) 〇
[0007] 所述桔青霉（Penicillium citrinum) ΙΒΡΤ-5,已于2013年12月25日保藏在中 國典型培養物保藏中心，地址：武漢武漢大學，保藏編號是：CCTCC NO :Μ 2013713。
[0008] 本發明還保護了所述的化合物在制備抑制人結直腸癌細胞增殖藥物中的用途，及 該化合物在制備抗人結直腸癌藥物中的用途。所述腫瘤細胞為人結直腸癌細胞SW-480、 SW-620、L0V0。
[0009] 本發明的顯著優點：研究所示該生物堿化合物較為罕見，所述生物堿類化合物具 有顯著的抑制人結直腸癌細胞增殖活性，目前尚未見該化合物對人結直腸癌細胞SW-480、 SW-620、LOVO增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關的藥物。
【附圖說明】
[0010] 圖 I Penicitrinine A 主要的 COSY，HMBC 和 NOESY 信號。
【具體實施方式】
[0011] 在如下的實施例中所指的化合物的化學結構：
[0012] 實施例1該化合物的發酵生產及分離精制 1發酵生產 生產菌的發酵培養：按培養微生物的常規方法，取桔青霉（ci IBPT-5 (已于2013年12月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，地址：武漢武漢大學， 保藏編號是：CCTCC NO :M 2013713)接種到PDA固體斜面培養基上在28°C培養箱中培養4 天。
[0013] 取斜面培養4天的桔青霉（ciiri/wa?) IBPT-5接種到裝有400mL培 養液[培養液組成（克/升）：甘露醇20. 0,酵母膏3. 0,麥芽糖20. 0,味精10. 0,葡萄糖 10. 0, KH2PO4 0· 5, MgSO4 0· 3, NaCl 30. 0 定容]的 1000 mL 錐形瓶中，28°C靜止培養 30 天 后，獲得菌絲體和發酵液。
[0014] 2浸膏的獲得 用紗布將菌絲體和發酵液分離。將發酵液用乙酸乙酯1:2 (v/v)萃取兩次，萃取液減 壓蒸餾至干，得到發酵液的乙酸乙酯浸膏32.0 g。
[0015] 3化合物的分離精制 該浸膏通過200目硅膠拌樣后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇為洗脫液用減壓硅膠色譜柱 梯度洗脫，得到11個組分。組分7 (4.2 g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:l的洗脫物）以二 氯甲烷：甲醇為洗脫液，進一步通過加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的亞組分7-6 (二氯甲 烷：甲醇v/v=50:1的洗脫物）通過半制備液相色譜（1010型0DS-A，10X250 mm，5 μπι): 分離流速為5 mL/min，流動相為75%乙腈含0. 1% TFA，得到所示化合物（97. 9 mg，tR 19. 3 min) 〇
[0016] 化合物黃色油狀，高分辨質譜HRESI-MS在餘々484. 2711處給出分子離子峰[Μ -ΗΓ，（calcd. for C28H38NO6, 484. 2705)，提示分子量為485,結合波譜信息推測分子式 為C2SH39N0 6。1H和13C-NMR數據見表1，主要的COSY，HMBC和NOESY信號見圖1。
[0017] 表1 NMR 化合物的1H 和13C-NMR 數據（500MHz 1H and 125MHz 13C，in CDCl3)
實施例2體外抗腫瘤活性的測試 1實驗樣品及實驗方法 被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施1中分離精制的化合物純品。精密稱取適 量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供測活性。
[0018] 細胞系及細胞的繼代培養采用腫瘤細胞系，腫瘤細胞用含10% FBS的RPMI 1640 培養基，在37 °C于通入5% 0)2的培養箱中繼代培養。
[0019] 細胞增殖抑制活性測試方法 WST-I法取對數生長期的腫瘤細胞，將細胞密度調至每毫升5 X IO4個細胞，按每孔 100 μ L接種于96孔細胞培養板中，于37°C通入5% CO2的培養箱中培養過夜。吸去上清 液，加入含樣品的培養基100 μ L，繼續培養48 h。每孔加入10 μ L WST-I液，培養4 h。 利用Bio-Rad公司產680型酶標儀測定每孔在450nm處的吸光值（OD)值。在同一塊96孔 板中樣品的每個濃度均設置五孔，另設五孔空白對照和無細胞調零孔（如果藥物有顏色要 做相應藥物濃度無細胞調零）。各孔OD值先做相應無細胞調零，再取五孔平均OD值按IR (%) = (0?自Jffla-OD樣品）/OD空自_ X 100%式計算每個濃度下細胞增殖抑制率（IR%)。
[0020] 2.實驗結果 細胞增殖抑制活性測試結果 在WST-I法測試中，根據不同濃度的該化合物的腫瘤細胞增殖抑制率，應用SPSS16. 0 軟件進行數據處理并計算半數抑制濃度IC5。值。結果見表2。
[0021] 表2化合物對人結直腸癌細胞增殖的抑制活性
3.結論 該化合物對人結直腸癌細胞SW-480、SW-620、LOVO具有較好的抗腫瘤活性。可作為制 備人結直腸癌細胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用于人結直腸癌的研究。
[0022] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. 源于桔青霉的penicitrinine A，其特征在于：所述化合物結構式為2. 如權利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于：發酵培養桔青霉（ ciiri/w?) IBPT-5,獲取發酵物，然后從發酵物中分離純化出該化合物，所述桔青霉 IBPT-5,已于2013年12月25日保藏在中國典型培養物保藏中 心，地址：武漢武漢大學，保藏編號是：CCTCC NO :M 2013713。3. 如權利要求1所述的化合物在制備抑制人結直腸癌細胞增殖藥物中的應用。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述的腫瘤細胞為人結直腸癌細胞 SW-480、SW-620、L0V0。5. 如權利要求1所述的化合物在制備抗人結直腸癌藥物中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種源于桔青霉的penicitrinine？A及其制備抗人結直腸癌藥物的應用。該化合物具有抑制人結直腸癌細胞增殖作用。其結構式為：通過發酵培養桔青霉(<i>Penicillium</i><i>？citrinum</i>)？IBPT-5，獲取發酵物，然后從發酵物中分離純化出該化合物。經實驗證實，該化合物對人結直腸癌細胞SW-480、SW-620、LOVO具有較好的抗腫瘤活性。可作為制備人結直腸癌細胞增殖抑制藥物或抗腫瘤藥物用于人結直腸癌的研究。CCTCC NO：M2025
【IPC分類】A61P35/00, C12P17/18, C07D491/20, C12R1/80
【公開號】CN105061444
【申請號】CN201510422121
【發明人】應敏剛, 劉沁穎, 陳立, 鄭秋紅, 周彤
【申請人】福建省腫瘤醫院
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月17日