一種紅花籽抗氧化肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抗氧化膚的制備方法，具體為一種紅花巧抗氧化膚的制備方法。 特指W紅花巧稍為原料，利用酶解技術制備抗氧化多膚的制備方法，屬于紅花巧的綜合開 發利用。
【背景技術】
[0002] 隨著現代社會的發展，生存環境的惡化W及社會壓力的加大使現代人的健康受 到嚴重的威脅，自由基引起機體損傷變性，導致機體各種疾病產生，已經引起人們強烈的 重視。抗氧化膚能有效地清除體內過剩的活性氧自由基，保護細胞和線粒體的正常結構和 功能，防止脂質過氧化的發生，而氧化與人類及其他動物的許多疾病諸如癌癥、老化、動脈 硬化等的發病機理有關。因此低價、高效、低毒的天然食品抗氧化劑的開發成為研究熱點。 在醫藥、化妝品、保健品和食品與飼料添加劑等方面有廣闊的應用前景。因而篩選具有強抗 氧化活性的天然資源已成為生物學、醫學和食品科學研究的新趨勢。我國是地大物博的國 家，特別是農產品資源。因此開發利用各種農產品生產高效的抗氧化劑具有十分重要的意 義。
[000引紅花巧稍是紅花巧制油時的副產物，其中含有29%--70%的優質蛋白質。但目前紅 花巧稍一般僅用作飼料，沒有對其中的蛋白質作深加工利用，附加值低。
[0004] 據文獻報道，許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如半脫氨酸、組氨酸、色氨 酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、額氨酸、5-輕色氨酸等。現已發現一些含組氨酸、色氨 酸和酪氨酸等功能短膚具有明顯的抗氧化作用。此外，對于抗氧化膚，疏水性氨基酸，特別 是芳香族氨基酸，在很大程度上影響其生物活性。經檢測表明，紅花巧蛋白的上述氨基酸酸 含量達36%左右，且其疏水值與大豆蛋白相接近，為探索其抗氧化活性提供了一定的理論 依據。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種原料來源廣泛、制造成本低、高附加值、抗氧化活性高 的紅花巧抗氧化膚的制備方法，優化蛋白酶的酶解條件，W獲得抗氧化活性高的抗氧化膚 粗品。
[0006] 本發明是通過W下技術方案實現的： (1)紅花巧蛋白的制備：W紅花巧稍為原料，紅花巧稍粉碎，過60目篩，先用正己焼按 料液比1:5 (w/v)常溫浸提，不斷攬拌，脫脂立次，每2小時換一次，瞭干，再用甲醇按料液 比1:5 (w/v)常溫浸提，不斷攬拌，脫苦H次，每2小時換一次，瞭干。脫脂脫苦的紅花巧稍 在45C下，1:14 (w/v)的料液比加水攬拌，然后用1.0 mol/L化0H調節到抑9.0,并保 溫1 h,再經3000 r/min下離也10 min。取堿提工藝中的上清液，用Imol/L肥1調抑 值為5. 5,再經5000 r/min下離也lOmin，用去離子水洗涂沉淀H次，用1 mol/L化0H調 pH至7. 0,經冷凍干燥，得到紅花巧蛋白。
[0007] (2)酶的篩選：根據酶的酶切位點不同，選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶 和風味蛋白酶做預實驗。配制一系列3%的紅花巧蛋白溶液，按照8000U/g的酶添加量，分 別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶對原料進行水解，混勻后分別在 每種蛋白酶最適宜的溫度和抑值條件下水解化，100°c滅酶lOmin, 3500r/min，離也lOmin, 取上清液測定酶解液的還原能力。選用W水解液的還原力作為評價抗氧化效果的指標，篩 選出較合適的蛋白酶。結果顯示，最佳的酶種類為堿性蛋白酶。
[0008] (3)紅花巧抗氧化膚的制備：用緩沖溶液配制成質量濃度為1%-7%的紅花巧蛋白 溶液，攬拌均勻，調節pH9. 0-11. 0,然后加堿性蛋白酶4000-10000u/g，在35-65C水浴中水 解1-化，水解過程中保持抑恒定，酶解液在沸水浴中加熱5-15min滅酶，然后3500r/min離 也15min，取上清液，調節抑為中性，最后經濃縮和冷凍干燥，得到紅花巧抗氧化膚。最佳工 藝參數為；水解時間化，水解溫度49C，pH值為8. 6,酶添加量7700u/g，底物濃度5. 0%，得 到酶解液的還原力為1. 017,水解度為6. 389%。
[000引（4)還原力的測定；將酶解液稀釋1倍，取1. 0血紅花抗氧化膚于試管中，依次加 0. 2mol/L磯酸鹽緩沖液（P冊.6)2. 5血、1%的鐵氯化鐘溶液2. 5血并充分混合，5(TC水浴保 溫20min,迅速冷卻，然后加入10%H氯己酸2. 5血，搖勻，300化/min離也lOmin。吸取上 清液2. 5血，加入蒸觸水2. 5血和0. 1%H氯化鐵0. 5血，靜置lOmin，測定700皿波長處的吸 光值，所有測定值均為H次數據平均值。W 700nm波長處的吸光值反映還原力的大小，吸光 值越大，表明水解液抗氧化性越強。
[0010] (5)水解度的測定：采用pH-stat法進行水解。
[0011] 水解度DH與水解過程中耗堿量成正比，可用耗堿量來表征水解度的大小，記錄下 不同時間的耗堿量即可得酶解進程曲線。
[0012] 水解度計算公式為：
【主權項】
1. 一種紅花籽抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 原料預處理：以紅花籽柏為原料，紅花籽柏粉碎，過60目篩，先用正己烷常溫浸提， 不斷攪拌，脫脂三次，每2小時換一次，晾干，再用甲醇常溫浸提，不斷攪拌，脫苦三次，每2 小時換一次，晾干。 (2) 紅花籽蛋白的制備：脫脂脫苦的紅花籽柏在45°C下，1:14的料液比加水攪拌， 然后用LO mol/L NaOH調節到pH 9. 0-11.0,并保溫I h，再經3000 r/min下離心10 min。取堿提工藝中的上清液，用lmol/L HCl調pH值為5. 0-6. 0,再經5000 r/min下離 心IOmin,用去離子水洗漆沉淀三次，用I mol/L NaOH調pH至7.0,經冷凍干燥，得到紅 花籽蛋白。 (3) 蛋白酶的篩選：根據各種蛋白酶的作用方式和作用位點不同，選取堿性蛋白酶、中 性蛋白酶、木瓜蛋白酶及風味蛋白酶4種酶，配制一系列3%的紅花籽蛋白溶液，混勻后分 別在每種蛋白酶最適宜的溫度和pH值條件下水解2h, 100°C滅酶IOmin, 3500r/min，離心 lOmin，取上清液測定酶解液的還原能力。選用以水解液的還原力作為評價抗氧化效果的指 標，篩選出較合適的蛋白酶。 (4) 紅花籽抗氧化肽的制備：用緩沖溶液配制成質量濃度為1%-7%的紅花籽蛋白溶液， 攪拌均勻，調節PH9. 0-11. 0,然后加蛋白酶4000-10000u/g，在35-65°C水浴中水解l_4h，水 解過程中保持pH恒定，酶解液在沸水浴中加熱5-15min滅酶，然后3500r/min離心15min， 取上清液，調節pH為中性，最后經濃縮和冷凍干燥，得到紅花籽抗氧化肽。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中，溶劑正己烷和甲醇與紅花籽柏 的量均按5:1 (v/w)加入。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（2)中，處理后的紅花籽柏與溶劑的料 液比為1:14 (w/v)，堿溶時的pH為9. 0-11.0,酸沉時的pH為5. 0-6.0。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（3)中，每種酶都在其最適的溫度和 PH值下進行酶解。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟⑷中，蛋白濃度為1%_7%，根據所調 節的pH不同，用適當的緩沖溶液，酶添加量為4000-10000u/g，在35-65°C水浴中水解l_4h， 沸水浴中加熱5-15min滅酶。
6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4)中，酶解上清液在旋轉蒸發器上進 行濃縮，控制真空度為0. 4-0. 8MPa，溫度為80°C，待溶液濃縮為原來體積的1/2 -1/4,再進 行冷凍干燥，干燥溫度為_48°C ^ - 52°C冷凍干燥時間為8-15h，至抗氧化肽的含水量不超 過3%為宜。
【專利摘要】本發明涉及一種抗氧化肽的制備方法，具體為一種紅花籽抗氧化肽的制備方法。是通過以下制備方法得到的：用緩沖溶液配制成質量濃度為1%-7%的紅花籽蛋白溶液，攪拌均勻，調節pH9.0-11.0，然后加堿性蛋白酶4000-10000u/g，在35-65℃水浴中水解1-4h，水解過程中保持pH恒定，酶解液在沸水浴中加熱5-15min滅酶，然后3500r/min離心15min，取上清液，調節pH為中性，最后經濃縮和冷凍干燥，得到紅花籽抗氧化肽。最佳工藝參數為：水解時間2h，水解溫度49℃，pH值為8.6，酶添加量7700u/g，底物濃度5.0%，得到酶解液的還原力為1.017，水解度為6.389%。屬于紅花籽的綜合開發利用，實現了廢物利用的目的。
【IPC分類】C12P21-06
【公開號】CN104630317
【申請號】CN201410537080
【發明人】毛曉英, 吳慶智, 孫立
【申請人】石河子大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2014年10月13日