本申(shen)請涉(she)及(ji)生物醫學，特別涉(she)及(ji)一種融(rong)合蛋白、工程化免疫細胞及(ji)其制(zhi)備方(fang)法和(he)應用。

背景技術：

1、腫瘤浸潤淋巴(ba)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(tumor?infiltrating?lymphocytes，tils)是由cd8+t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、cd4+t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、b細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、nk細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)、γδt細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)以及固有淋巴(ba)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(innate?lymphocytes,ilcs)等組成(cheng)的(de)異(yi)質性(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)群體(ti)(ti)。經體(ti)(ti)外擴增培養后，cd3+t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)成(cheng)為(wei)最主要細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)群體(ti)(ti)(所(suo)占比例通常大于(yu)95％)。cd3+t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)表面表達(da)tcr受(shou)體(ti)(ti)，在介(jie)導癌變細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)免疫殺傷中起關鍵(jian)作用。由于(yu)不(bu)同的(de)tcr受(shou)體(ti)(ti)識別主要組織相(xiang)容性(xing)(xing)復合物(wu)(major?histocompatibility?complex，mhc)分子所(suo)呈遞的(de)不(bu)同抗(kang)原肽，從而(er)賦予t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)抗(kang)原特異(yi)性(xing)(xing)。因(yin)此，一(yi)旦(dan)針對(dui)某抗(kang)原特異(yi)性(xing)(xing)t細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)受(shou)到特定抗(kang)原刺激，這些細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)可通過(guo)釋(shi)放細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)毒素和(he)受(shou)體(ti)(ti)介(jie)導機制等方式，以促進靶細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)程序(xu)性(xing)(xing)死亡。

2、與car-t(chimeric?antigen?receptor?t-cell)/tcr-t細胞治療產品不同(tong)的是，通(tong)常(chang)tils是通(tong)過(guo)(guo)識(shi)別腫瘤(liu)細胞所呈遞出來(lai)的腫瘤(liu)相關抗(kang)原，如新(xin)抗(kang)原(neoantigen)等(deng)，從而發揮抗(kang)腫瘤(liu)作用。因(yin)此，til療法可(ke)通(tong)過(guo)(guo)識(shi)別和(he)靶向多種腫瘤(liu)相關抗(kang)原以達到抗(kang)腫瘤(liu)治療目(mu)的。

3、然而，由(you)于受腫(zhong)(zhong)瘤(liu)微(wei)環(huan)境(jing)中存在多種(zhong)免(mian)疫抑制(zhi)相(xiang)關(guan)因(yin)素的(de)(de)調控(kong)作用，til高(gao)表達免(mian)疫檢查點相(xiang)關(guan)分子(zi)，如(ru)(ru)pd-1、ctla4、tim3、lag3、tigit等。同時，由(you)于持(chi)續(xu)性地受到(dao)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)相(xiang)關(guan)抗(kang)原的(de)(de)刺激(ji)作用，til呈現出(chu)高(gao)度耗竭狀態，如(ru)(ru)高(gao)表達tox、id3等耗竭相(xiang)關(guan)轉錄因(yin)子(zi)。即(ji)使將til分離，在體外進行重新激(ji)活后，til的(de)(de)殺傷(shang)功(gong)能仍受到(dao)限制(zhi)。因(yin)此(ci)，如(ru)(ru)何增強til的(de)(de)持(chi)續(xu)地抗(kang)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)功(gong)能是亟待解(jie)決的(de)(de)技術問題(ti)。

技術實現思路

1、基(ji)于此，本申(shen)請一個或者多(duo)個實施例(li)提供一種融合蛋白、工程化免疫(yi)細胞及其制備方(fang)法(fa)和應用。

2、本(ben)申請的一個(ge)或者多個(ge)實施例提供一種融合蛋(dan)白；

3、自(zi)胞外結構(gou)域一端(duan)至胞內(nei)結構(gou)域一端(duan)，所(suo)述融合(he)蛋(dan)白包括il-12p40亞(ya)基和膜蛋(dan)白，所(suo)述膜蛋(dan)白用于將所(suo)述il-12p40亞(ya)基錨定在細胞膜上。

4、在(zai)本申請(qing)的(de)一(yi)些(xie)實施方式中(zhong)，所述(shu)膜(mo)(mo)蛋白(bai)(bai)包括i型(xing)膜(mo)(mo)蛋白(bai)(bai)、ii型(xing)膜(mo)(mo)蛋白(bai)(bai)、多次跨膜(mo)(mo)蛋白(bai)(bai)和糖(tang)基(ji)磷脂酰肌(ji)醇(glycosylphosphatidylinositol,gpi)錨定蛋白(bai)(bai)中(zhong)的(de)一(yi)種(zhong)或者多種(zhong)。

5、在本申請(qing)的(de)一些(xie)實施方式中(zhong)，所述膜蛋白(bai)具(ju)有以下至少(shao)一種蛋白(bai)的(de)跨膜結構域(yu)或者所述跨膜結構域(yu)的(de)部分區域(yu)：t細胞(bao)受(shou)體(ti)的(de)α鏈(lian)、t細胞(bao)受(shou)體(ti)的(de)β鏈(lian)、t細胞(bao)受(shou)體(ti)的(de)ζ鏈(lian)、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd48、cd55、cd64、cd80、cd86、cd90、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、icos、gitr、cd40、baffr、hvem、slamf7、nkp80、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、tgfβrii、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、itgb7、tnfr2、dnam1、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、ly9、psgl1、cd100、slamf6、slam、blame、selplg、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、和nkg2c。

6、在本申請的一些(xie)實施方式中，所(suo)述il-12p40亞基(ji)和所(suo)述膜蛋白直(zhi)接(jie)或(huo)間(jian)接(jie)連(lian)接(jie)。

7、在本申(shen)請的(de)一些實施方式中，所述il-12p40亞基和所述膜蛋白通(tong)過柔(rou)性linker和/或鉸鏈區中的(de)一個(ge)或者多(duo)個(ge)相連接。

8、在本申請的一些實施方式中，所(suo)述鉸(jiao)(jiao)鏈(lian)區(qu)選(xuan)自以(yi)下至少一種蛋白的鉸(jiao)(jiao)鏈(lian)區(qu)：igg1、igg4、igg4m、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos和cd154。

9、在本申請的一些(xie)實(shi)施(shi)方式(shi)中，所述融合蛋(dan)白從胞(bao)(bao)外結構(gou)(gou)域(yu)到胞(bao)(bao)內結構(gou)(gou)域(yu)依次(ci)包括所述il-12p40亞基、所述柔(rou)性linker、所述鉸鏈區(qu)和(he)所述膜蛋(dan)白。

10、在本申請的一(yi)些實施方(fang)式中，所述融(rong)合蛋白(bai)的n端連接有信(xin)號(hao)肽或者內在信(xin)號(hao)錨定序列片段(duan)。

11、本(ben)申(shen)請的一(yi)個(ge)或者多個(ge)實施例提供一(yi)種(zhong)工程化免疫細胞，所(suo)述(shu)工程化免疫細胞過(guo)表達所(suo)述(shu)融(rong)合蛋白。

12、在(zai)本申請(qing)的一(yi)(yi)些(xie)實施方式中，所述工(gong)程化免疫細胞(bao)包(bao)括car-t、tcr-t、til和car-nk中的一(yi)(yi)種或者多種。

13、本(ben)申請(qing)的一個或者多個實施例提供一種所述的工(gong)程化(hua)免疫細(xi)胞(bao)的制備方法，其包括如下步驟：

14、提供(gong)一種待(dai)改造免疫細(xi)胞，對所述待(dai)改造免疫細(xi)胞進行改造使(shi)表(biao)達所述的融合蛋白，從而(er)構建(jian)工程化免疫細(xi)胞。

15、本申請(qing)的一(yi)(yi)個或者(zhe)多個實施例提供一(yi)(yi)種核酸分子，其編碼上述的融合蛋(dan)白。

16、本申請的(de)一個(ge)(ge)或者多個(ge)(ge)實(shi)施例提供一種載體，其包括所述的(de)核酸分子(zi)。

17、在本(ben)申(shen)請(qing)的一些實施方(fang)式(shi)中，所(suo)述載(zai)體(ti)(ti)包括慢病毒、γ逆轉錄病毒載(zai)體(ti)(ti)和脂(zhi)質納米顆粒中的一種或者多種。

18、本申請的一(yi)(yi)個或(huo)者多個實施例提供一(yi)(yi)種所(suo)(suo)述的工程(cheng)化免疫細胞、所(suo)(suo)述的核(he)酸分子或(huo)者所(suo)(suo)述的載體在制備抗腫瘤藥物中的應用。

19、在(zai)本申請的一(yi)些實施(shi)方(fang)式中，所述抗(kang)腫(zhong)瘤(liu)藥物預(yu)防(fang)或/和治(zhi)療(liao)如下腫(zhong)瘤(liu)：肝癌(ai)(ai)、結腸癌(ai)(ai)、直腸癌(ai)(ai)、卵(luan)巢癌(ai)(ai)、宮頸癌(ai)(ai)、胃癌(ai)(ai)、胰(yi)腺(xian)癌(ai)(ai)、肺癌(ai)(ai)、乳腺(xian)癌(ai)(ai)、黑(hei)色素瘤(liu)等實體(ti)腫(zhong)瘤(liu)。

20、本申請(qing)的(de)一個或者多(duo)個實施例提(ti)供一種藥物(wu)，其包(bao)括所述的(de)工程化免疫細胞(bao)，以及(ji)藥學(xue)上(shang)可(ke)以接受的(de)載(zai)體。

21、相對于傳統技(ji)術(shu)，本申(shen)請的有益效(xiao)果包括(kuo)：

22、本申請通(tong)過(guo)將(jiang)il-12的(de)p40亞基與具有錨定作用的(de)膜(mo)蛋白(bai)相連，使得p40亞基通(tong)過(guo)膜(mo)蛋白(bai)錨定在免(mian)疫細(xi)胞(bao)(例如為til)的(de)細(xi)胞(bao)膜(mo)表面，意外地(di)達到增(zeng)強免(mian)疫細(xi)胞(bao)的(de)增(zeng)殖能(neng)力和(he)抗腫(zhong)瘤(liu)殺傷(shang)效果。同時，也提升了il-12用于抗腫(zhong)瘤(liu)治療的(de)安(an)全性。

技術特征：

1.融合蛋白；

2.根據權利要(yao)求1所述的融合蛋(dan)白(bai)，其中，所述膜(mo)蛋(dan)白(bai)包(bao)括i型膜(mo)蛋(dan)白(bai)、ii型膜(mo)蛋(dan)白(bai)、多(duo)次跨膜(mo)蛋(dan)白(bai)和糖基磷脂酰肌(ji)醇(chun)錨定蛋(dan)白(bai)中的一種(zhong)或(huo)者(zhe)多(duo)種(zhong)。

3.根據權利要求1所(suo)述的(de)(de)融合蛋(dan)白，其中，所(suo)述膜蛋(dan)白具有以下至少一種蛋(dan)白的(de)(de)跨(kua)膜結(jie)構域或者(zhe)所(suo)述跨(kua)膜結(jie)構域的(de)(de)部分(fen)區域：t細(xi)胞(bao)受(shou)(shou)體(ti)(ti)的(de)(de)α鏈、t細(xi)胞(bao)受(shou)(shou)體(ti)(ti)的(de)(de)β鏈、t細(xi)胞(bao)受(shou)(shou)體(ti)(ti)的(de)(de)ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd48、cd55、cd64、cd80、cd86、cd90、cd134、cd137、cd154、kirds2、ox40、cd2、cd27、icos、gitr、cd40、baffr、hvem、slamf7、nkp80、cd160、cd19、il2rβ、il2rγ、il7rα、tgfβrii、itga1、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、itgb7、tnfr2、dnam1、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、ly9、psgl1、cd100、slamf6、slam、blame、selplg、ltbr、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、和(he)nkg2c。

4.根據權利要求1至3中(zhong)任一(yi)項所述(shu)的融合蛋白，其(qi)中(zhong)，所述(shu)il-12p40亞(ya)基和所述(shu)膜蛋白間接(jie)連接(jie)。

5.根據權(quan)利(li)要求4所述的融合(he)蛋(dan)白，其中，所述il-12p40亞基和所述膜蛋(dan)白通(tong)過柔性linker和/或鉸鏈區(qu)中的一個或者多個相連接。

6.根(gen)據權(quan)利要求5所述的融合蛋白，其(qi)中，所述鉸鏈(lian)區選自以下至少一種蛋白的鉸鏈(lian)區：igg1、igg4、igg4m、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd134、cd137、icos和cd154。

7.根據權利要(yao)求(qiu)5所(suo)述的融(rong)合(he)蛋(dan)白(bai)，其中，所(suo)述融(rong)合(he)蛋(dan)白(bai)從(cong)胞(bao)外結構域(yu)到胞(bao)內結構域(yu)依次包(bao)括所(suo)述il-12p40亞(ya)基、所(suo)述柔性linker、所(suo)述鉸(jiao)鏈區(qu)和所(suo)述膜蛋(dan)白(bai)。

8.根(gen)據權利(li)要(yao)求1至3和5至7中任一項所述的融合蛋白(bai)，其中，所述融合蛋白(bai)的n端連(lian)接有信號肽(tai)或者(zhe)內在信號錨定(ding)序列(lie)片(pian)段。

9.工(gong)程化免疫細胞(bao)，其特征在于(yu)，所(suo)述(shu)工(gong)程化免疫細胞(bao)過(guo)表達(da)權(quan)利要求(qiu)1至8中任一項所(suo)述(shu)的融合蛋白。

10.根據權利要求9所述的工程化免疫細胞，其中(zhong)，所述工程化免疫細胞包括car-t、tcr-t、til和car-nk中(zhong)的一種或者(zhe)多種。

11.權利要求9至10中任一項所(suo)述(shu)的工程化免疫細胞的制備(bei)方法，其包括如下(xia)步驟：

12.核酸分(fen)子，其編(bian)碼(ma)權利要求1至8中任一(yi)項(xiang)所述的(de)融合蛋白。

13.一種載體，其包括權(quan)利(li)要求12所(suo)述的(de)核(he)酸(suan)分子。

14.根據(ju)權(quan)利(li)要(yao)求13所述的載體(ti)，其中，所述載體(ti)包括(kuo)慢病毒、γ逆轉錄(lu)病毒載體(ti)和脂質(zhi)納米顆粒中的一種或者多種。

15.權利要求9至10中任(ren)一項所述的工程化免疫細胞、權利要求12所述的核酸分(fen)子或者權利要求13至14中任(ren)一項所述的載體在(zai)制備(bei)抗腫瘤藥(yao)物中的應用。

16.根據權利要求15中所述的用途，其中，所述抗腫(zhong)瘤(liu)藥物預(yu)防或/和治療如(ru)下腫(zhong)瘤(liu)：肝癌(ai)、結腸癌(ai)、直腸癌(ai)、卵巢癌(ai)、宮(gong)頸(jing)癌(ai)、胃癌(ai)、胰(yi)腺癌(ai)、肺癌(ai)、乳腺癌(ai)、黑色(se)素瘤(liu)。

17.一(yi)種藥(yao)物，其包括(kuo)權(quan)利要求9至10中任一(yi)項所述(shu)的(de)工程(cheng)化(hua)免(mian)疫(yi)細胞，以(yi)及藥(yao)學上可以(yi)接受的(de)載體。

技術總結
本申請涉及生物醫學技術領域，特別涉及一種融合蛋白、工程化免疫細胞及其制備方法和應用。自胞外結構域至胞內結構域，所述融合蛋白包括IL?12p40亞基和膜蛋白，所述膜蛋白用于將所述IL?12p40亞基錨定在細胞膜上。本申請通過將IL?12的p40亞基與具有錨定作用的膜蛋白相連，使得p40亞基通過膜蛋白錨定在免疫細胞(例如為TIL)的細胞膜表面，從而達到增強TIL的抗腫瘤殺傷效果，同時，也提升了IL?12用于抗腫瘤治療的安全性。

技術研發人員：劉明宇,盧永,劉秋燕,張曦,韓德平
受保護的技術使用者：廣州百吉生物制藥有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/10/10