專利名稱：具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及其應用。特別涉及一種鹽藻 {Dunaliella viridis)硫氧還蛋白(thioredoxin)基因DvTRX的核苷酸序列,及其編碼蛋白及其在提高生物耐鹽能力和在改良農作物性狀中的應用。
背景技術：
世界人口日益增長，耕地面積日趨減少，提高農作物產量成為了解決這對矛盾的重要途徑。然而，土壤鹽潰化、干旱、極端溫度和營養貧瘠等各種環境脅迫嚴重影響了農作物的生長和發育并降低其產量。植物遭受逆境脅迫時，在初期階段會造成植物體離子失衡和滲透紊亂；脅迫的延續或加重還常常會伴隨活性氧的產生和氧化脅迫的發生。鹽堿化是影響植物生長的最重要的環境壓力之一，它嚴重影響了農作物的產量和生產力。世界20% 的可耕土地嚴重的鹽潰化，嚴重影響了糧食的產量。大量實驗證明轉基因植物中活性氧清除因子的過量表達，或具有更高活性氧清除功能的突變體對環境脅迫，具有更強的耐受性。 研究生物的抗鹽機制，利用分子生物學技術來獲得抗性基因，揭示植物與逆境之間的關系， 輔助作物育種，已經成為了提高農作物產量的有效途徑之一。杜氏藻屬(JJunaliella)是自然界中廣泛存在的真核單細胞綠藻,廣泛分布于鹽湖、海洋、鹽土等高鹽度的環境中，尤其在高鹽水域中是主要種群，很容易從自然環境中分離得到。咎MiDunaliella ririt/is)是杜氏藻屬中具有代表性的一個種。該種又稱杜氏鹽藻、綠色杜氏藻、鹽生綠色杜氏藻等。對環境具有極強的適應能力，是已知最耐鹽的真核生物能耐受高鹽、重金屬、強烈紫外線輻射等環境脅迫。因此，鹽藻成為了一個重要的耐逆基因資源寶庫。硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一類廣泛存在于生物體內的多功能酸性蛋白。硫氧還蛋TRX家族是一類小分子量(約12 kD)的蛋白質，普遍存在于從原核生物到高等真核生物的幾乎所有生物個體中。硫氧還蛋白具有多種生物學功能，對維持生物體內穩定的氧化還原狀態具有重要的作用。其功能絕大多數是依賴于硫氧還蛋白還原靶蛋白中的二硫鍵。所有硫氧還蛋白均有一個保守的氧化還原活性位點氨基酸基序， Cys-Gly-Pro-Cys (CGPC)，活性中心有兩個具有氧還活性的半胱氨酸殘基，2個Cys殘基可通過轉移2個電子和2個質子可逆地形成二硫化物，為一系列生理反應提供氧化還原對。除了還原靶蛋白的二硫鍵之外，它還作為H+供體參與對酶的調節，對轉錄因子進行調控及在氧化逆境中發揮作用。Trx具有調節細胞生長、抑制凋亡、調節基因轉錄等功能。Trx還與植物耐逆性相關，如參與植物抗旱、耐熱和抗氧化脅迫過程，調節抗逆基因的表達等。目前，還沒有文獻報到硫氧還蛋白具有耐鹽的功能。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種具有耐鹽功能的基因，該基因是從鹽藻
3{Dunaliella viridis)中分離出來的硫氧還蛋白(thioredoxin)基因,稱為iVTEf。本發明的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。本發明的目的之三在于提供一種載體，該載體含有本發明的基因。本發明的目的之四在于提供一種含有本發明基因的宿主細胞。本發明目的之五是提供利用基因提高生物耐鹽性方面的應用，其特征在于含有 /VTET基因的鹽敏感酵母細胞可以獲得一定的耐鹽能力。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種具有耐鹽功能的基因，其特征在于該基因為SEQ ID NO 1所不的DNA序列。上述的基因的編碼蛋白，其特征在于該蛋白是SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。一種重組表達載體，該重組載體含有上述的基因。一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述的重組表達載體。一種上述的具有耐鹽功能的基因在提高生物體耐鹽能力中的應用。一種上述的具有耐鹽功能的基因在改良農作物性狀中的應用。本發明通過逆境脅迫的方法，從鹽藻中克隆到了一個硫氧還蛋白基因，并通過實驗證明了它還具有耐鹽的功能。隆分析鹽藻中TRX基因有助于深入理解鹽藻抗鹽機制，同時也會為生物耐鹽基因工程和分子育種提供了基因資源。本發明首次從鹽藻 viridis)中分離到硫氧還蛋白(thioredoxin)基因iVTET，并通過轉化酵母細胞證明該基因還具有耐鹽功能和改良農作物性狀的應用價值。


圖I為本發明的/VTET基因編碼蛋白的物種間同源性分析圖。方框標注為/VTET 基因具有氧化還原活性位點氨基酸基序，Cys-Gly-PiO-Cys (CGPC)。圖2為本發明的/VTET基因編碼的蛋白進化分析圖，表明該編碼蛋白屬于硫氧還蛋白家族。圖3為本發明的融合GST標簽的/VTET基因編碼蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。M:蛋白 marker ；1 :pGEX4T_l 全菌；2 :pGEX4T_l 上清；3 :pGEX4T_l 沉淀；4 pGEX4T-l-TRX 全菌；5 :pGEX4T-l_TRX 上清；6 :pGEX4T-l_TRX 沉淀；7 :未誘導 PGEX4T-1-TRX全菌；8 :未誘導pGEX4T_l_TRX上清；9 :未誘導pGEX4T_l_TRX沉淀。以上紅色箭頭所示為誘導表達融合GST標簽的/VTET基因編碼蛋白。圖4為本發明的/VTET基因在酵母突變體似沒中的功能分析。即含伽/ET完整 ORF的EST序列插入到酵母表達載體PAJ401中，轉化酵母鹽敏感突變體G19，在含不同濃度的NaCl的表型展示培養基上進行表型測定。具體實施方法
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遺傳學方法(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al 編，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例一全長編碼區的克隆與分析
對鹽藻ft viridis受不同濃度鹽誘導的cDNA文庫EST序列(表達序列標簽)進行分析，通過序列比對，分離到了一個鹽藻硫氧還蛋白基因，命名為DvTRX。DvTRX的cDNA全長 841 bp，含有完整的開放閱讀框(ORF)、Kozak序列(GGCMeC)以及poly(A)結構。實施例二 DvTRX編碼的蛋白結構、同源分析
Vector NTI軟件的分析結果顯示該基因編碼一個含161個氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小為18.02 kDa，等電點為9. 44。/VTET編碼的蛋白有5個β鏈和4個α鏈。 iV/ET與其他物種的Thioredoxin基因具有較高的同源性。該基因編碼的蛋白N端還具有 Thioredoxin保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)序列,這是硫氧還蛋白氧化還原活性位點氨基酸基序(圖I)。圖2為本發明的/VTET基因編碼的蛋白進化分析圖，表明該編碼蛋白屬于硫氧還蛋白家族。實施例三/VTET編碼蛋白的定位預測及原核表達分析
通過WoLFPSORT軟件預測，DvTRX蛋白定位在葉綠體中，屬于TRX的X類亞家族。通過PCR的方法，在伽/ET基因的ORF兩端加入限制性內切酶位點EcoRl和通ol，連接T載體測序正確后，及和通ol雙酶切目的片段連接到同樣雙酶切的原核表達載體PGEX4T-1 上，得到重組質粒pGEX4T-l-DvTRX。重組質粒轉化進入大腸桿菌表達菌株BL21中，ImM IPTG, 25°C誘導4個小時后超聲破碎菌體。圖3為融合GST標簽的DvTRX蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。實施例四DvTRX在酵母突變體中的功能分析 (一)酵母表達載體的構建
首先將含有完整ORF的EST序列(4977)構建到酵母表達載體中我們將 4977序列利用限制性內切酶位點I和ZAo I構建到酵母表達載體PAJ401中。(二)轉化酵母
使用LiAc熱激轉化法將含有4977的重組克隆轉化到酵母鹽敏感突變體G19 (Mat^ ura3 his3 trpl ade2 enal Δ : : ena4 Δ)中。(三)酵母轉化子的表型鑒定
所用基本培養基為AP培養基，并加入所需氨基酸。篩選標記為尿嘧啶營養缺陷。轉入載體為PAJ401的轉化子表型展示培養基，添加2%的半乳糖作為碳源。所用表型展示培養基以不含NaCl的AP培養基為對照生長條件，加入不同濃度的NaCl的AP培養基為耐鹽表型分析生長條件。首先將酵母轉化子在AP培養基中培養至OD6tltl=O. 6，以5 μ L為一個滴度，并以5倍稀釋度為系列稀釋滴度，在表型展示培養基上展示酵母轉化子的耐鹽表型。在PAJ401組成型強表達啟動子啟動下，4977成功互補了酵母鹽敏感突變體G19的表型(圖4);結果表明轉化了含/VTET完整ORF的EST序列的酵母鹽敏感突變體可以在220mM NaCl下仍然有表型， 說明了 iVTET基因能夠部分恢復酵母突變體的功能，證明了 DvTRX能夠有效地提高生物體的耐鹽能力。盡管本發明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的， 即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。
權利要求
1.一種具有耐鹽功能的基因，其特征在于該基因為SEQ ID NO :1所示的DNA序列。
2.一種根據權利要求I所述的基因的編碼蛋白，其特征在于該蛋白是SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.—種重組表達載體，該重組載體含有根據權利要求I所述的基因。
4.一種宿主細胞,該宿主細胞含有根據權利要求3所述的重組表達載體。
5.一種根據權利要求I所述的具有耐鹽功能的基因在提高生物體耐鹽能力中的應用。
6.一種根據權利要求I所述的具有耐鹽功能的基因在改良農作物性狀中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及其應用。該基因為SEQIDNO1所示的DNA序列。本發明首次從鹽藻(Dunaliellaviridis)中分離到硫氧還蛋白(thioredoxin)基因DvTRX，并通過轉化酵母細胞證明該基因還具有耐鹽功能和改良農作物性狀的應用價值。
文檔編號C07K14/405GK102586281SQ20121000357
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者劉翔, 孫文杰, 宋任濤, 李平, 李松, 王任, 許政暟 申請人:上海大學