有效的肽偶聯及其在環戊二烯并[g]喹唑啉三鈉鹽的合成和分離中的用途
【專利摘要】本發明提供了一種合成L-谷氨酰基-γ-D-谷氨酸的新方法及其在合成(2R)-((4S)-羧基-4-(4,N-(((6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3,4,7,8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1中的用途。還提供了一種有效的分離和純化上述酸的三鈉鹽2的方法，該三鈉鹽2呈適合長期儲存和用于腸胃外劑型的形式。
【專利說明】有效的肽偶聯及其在環戊二烯并[G]喹唑啉三鈉鹽的合成和分離中的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及(R)-2-((S)-4-氨基-4-羧基丁酰胺基)戊二酸(L-谷氨酰基-Y -D-谷氨酸，L-Glu- y -D-Glu)的合成，及其在合成中的用途，尤其是在合成(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)_戊二酸中的用途，以及上述酸的三鈉鹽的分離和純化。
【背景技術】
[0002]為更充分地描述和公開本發明以及其所屬的【技術領域】，此處引用了多篇專利和公開。這些參考文獻中的每一篇均在此整體引入作為本文內容的參考，如同每一篇單獨的引文均具體地、單獨地指出引入作為參考。
[0003]在整個本說明書中，包括其后的權利要求，除非上下文另有所指，“包含”及其變型“包括”和“含有”，應當理解為意味著包括所述的整數或步驟或者整數組或步驟組，但不排除任何其它整數或步驟或者整數組或步驟組。
[0004]必須指出，如本說明書和所附權利要求使用的，單數形式“一種”、“一個”和“該”包括復數對象，除非上下文明確的另有指定。因此，例如，提及“一種藥用載體”包括兩種或多種該載體的混合物，等。
[0005]此處范圍經常表示為從“約”某一具體值，和/或至“約”另一具體值。當范圍如此表達時，另一實施方案包括從一個具體值和/或至另一具體值。類似地，數值通過使用先行詞“約”表示為近似值時，應理解為該具體值形成另一實施方案。
[0006]當方法或過程在本文表示為步驟的列表或順序(包括數字編號、字母編號，或項目符號編號的步驟的列表)時，列表中步驟呈現的順序并不意味著該方法中這些步驟有任何特殊的順序或時限，除非特殊順序是要求的或明確說明的。因此，除非另有規定，每種公開方法的步驟可以任何合理的順序進行，如本領域技術人員所明確的，即任何適合達到該方法所陳述的目的和產物的順序。而且，除非明確的說明，本方法中不排除存在附加的步驟。
[0007]該新的胸苷酸合成酶抑制劑(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)-4_氧代_3，4，7，8-四氫-3!1-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸1，作為其三鈉鹽也稱為CB300945、BCG945或0NX-0801)是胸苷酸合成酶很有效的抑制劑，對該酶的IC5(I為3nM。
[0008]不像大多數胸苷酸合成酶抑制劑如甲氨蝶(呤和培美曲塞)，2的活化或細胞滯留不需要聚谷氨酰化(polyglutamoylation),而且它并不是聚谷氨酰化合成酶的底物。
[0009]此外,2不是普遍表達的Ki>250 μ Μ的還原性葉酸載體蛋白(reduced folatecarrier protein, RFCP)的底物，并且不能輕易地穿過正常的細胞膜。然而，它以很高的亞納摩爾級親和力(ΚΑ5ηΜ)與葉酸受體a (FRa)結合，并且可通過該受體以適當的速率轉運至細胞中，即使2的血清水平非常低。
[0010]一旦進入細胞，2抑制胸苷酸合成酶并且隨著其慢慢地降解和從細胞中排出，它對胸苷酸合成酶產生長效的抑制作用。這造成DNA加工錯誤，而啟動了修復周期，而由于缺乏三磷酸胸苷摻入到DNA中，該修復最終是無效的。這導致了凋亡DNA損傷反應和細胞死亡。
[0011]這是胸苷酸合成酶抑制劑通常的作用方式，臨床經驗表明胸苷酸合成酶抑制劑對人類腫瘤有強烈的細胞毒作用，但是由于相當廣譜的毒性，其使用受到了限制；靶組織，特別是骨髓，受到該藥物細胞毒性的嚴重影響。
[0012]目前這代胸苷酸合成酶抑制劑是普遍表達的RFCP的良好底物，可很好的分布到大多數組織，而2僅僅有效地分布到表達或優選過表達FRa的組織中。相對地很少有組織內源性表達FRa，即使在適中水平。大多數組織在細胞遠極面以極化方式表達FRa，意味著細胞面向循環內皮一面沒有運載體。這樣的結果是，即使在這些組織中，之的穿透也往往是非常無效的。這意味著血漿中高循環水平的2導致相當低的全身毒性。
[0013]如果對于腫瘤同樣如此，也可以預期其產生低抗腫瘤療效。然而,有些種類的腫瘤組織傾向于過表達FRa。作為腫瘤細胞，它們已經失去極性并在近極面和遠極面均表達FRa。因此，這些腫瘤組織有著異常的傾向，能夠在細胞中聚集非常大量的、細胞毒性的2的劑量，而血漿藥物水平足夠低，只有非常小的毒性作用。這導致在過表達腫瘤類型中，之的治療指數提聞。
[0014]有些腫瘤類型過表達FR α，最顯著的是卵巢癌，其中90%最常見的腫瘤類型，粘液型卵巢癌，過表達FRa。因此4是一種非常有吸引力的化療藥物，用于治療FRa過表達的癌癥，特別是卵巢癌，然而并不限于那一種腫瘤類型，其中子宮癌、間皮瘤和腎癌均有高百分比的FRa過表達。
[0015]化合物I和I以及若干相似同源物，在W02003/020748中被公開，盡管是作為在6位的非對映異構體1:1的混合物。
[0016]
【權利要求】
1.一種合成L-Glu-Y-D-Glu 二妝的方法,其包括以下步驟: a)活化N-α O-雙保護的L-Glu衍生物的Y -羧酸； b)甲硅烷基化D-谷氨酸；和 c)將步驟a)產生的活化的羧酸衍生物與步驟b)的甲硅烷基化產物反應以生成被保護的 L-Glu-Y-D-Glu 物質。
2.根據權利要求1的方法，其中在步驟a)中，活化包括將N-α O-雙保護的L-Glu衍生物轉化成活化的衍生物，例如混合酸酐。
3.根據權利要求2的方法，其中活化包括用氯甲酸烷基酯和叔胺堿處理N-αO-雙保護的L-Glu衍生物。
4.根據權利要求3的方法，其中氯甲酸酯是氯甲酸異丁酯。
5.根據權利要求2至4的方法，其中緩慢加入N-α O-雙保護的L-Glu衍生物至氯甲酸烷基酯和叔胺堿的低溫溶液中。
6.根據權利要求5的方法，其中氯甲酸烷基酯和叔胺堿的溶液的溫度為-10°C至-50°C，優選約-30°C。
7.根據權利要求3至6 任一項的方法，其中叔胺堿為N-甲基嗎啉。
8.根據權利要求1至7任一項的方法，其中N-α O-雙保護的L-Glu衍生物為N-芐氧基擬基_L_谷氨酸-α -節酯。
9.根據上述權利要求任一項的方法，其中在步驟b)中，甲硅烷基化包括用甲硅烷基化劑處理D-谷氨酸。
10.根據權利要求9的方法，其中甲硅烷基化劑為O，N-二-(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
11.根據上述權利要求任一項的方法，其中在步驟b)中，D-谷氨酸被若干當量的甲硅烷基化劑溶解；和步驟c)中，將該溶液加入來自步驟a)的羧酸衍生物的冷溶液，以形成被保護的L-Glu- Y -D-Glu物質的甲硅烷基酯化溶液。
12.根據權利要求11的方法，其中Ν-αO-雙保護的L-Glu衍生物為N-芐氧基羰基-L-谷氨酸-α -芐酯且產物為2R- (N- (S) _4_ (芐氧基羰基)_4_芐氧羰基氨基)_1_氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化溶液。
13.根據權利要求12的方法，其中反應后，將2R-(N-(S)-4-(節氧基擬基)-4_節氧擬基氨基)-1_氧代丁基)氨基)戊二酸的甲硅烷基酯化溶液進行去甲硅烷基化水溶液后處理，從而以良好的收率和純度產生2R- (N- (S) -4-(芐氧基羰基)-4-芐氧羰基氨基)-1-氧代丁基)氨基)戊二酸。
14.根據權利要求13的方法，其中去甲硅烷基后處理包括在水和有機溶劑之間分配溶液。
15.根據權利要求1至14任一項的方法，其還包括: d)脫保護該被保護的L-Glu-Y -D-Glu物質。
16.根據權利要求15的方法，其中脫保護包括除去芐基和/或芐氧基羰基保護基以產生L-谷氨酰基-Y -D-谷氨酸。
17.根據權利要求15或16的方法，其中脫保護包括氫解。
18.根據權利要求17的方法，其中氫解包括在乙醇水溶液中，使用合適的過渡金屬催化劑氫解。
19.根據權利要求18的方法，其中催化劑包括鈀碳催化劑。
20.根據權利要求15至19任一項的方法，其中脫保護后，該產物經硫代硅膠處理以獲得含〈lOppm鈀的產物。
21.合成(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其可藥用鹽或溶劑合物的方法，其包括將甲硅烷基-保護的L-Glu- Y -D-Glu物質與(63)-4，^((2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸偶聯的步驟。
22.根據權利要求21的方法，其中偶聯包括活化(6S)-4，N-((2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸的羧酸部分和用甲硅烷基-保護的L-Glu- Y -D-Glu物質處理。
23.根據權利要求22的方法，其中活化包括通過用1-羥基苯并三唑水合物和偶聯劑處理將(65)-4，^((2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3!1-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸轉化成活化的HOBT酯。
24.根據權利要求23的方法，其中偶聯劑為二酰亞胺偶聯劑。
25.根據權利要求21至24任一項的方法，其中甲硅烷基保護的L-Glu-y -D-Glu物質是由L-谷氨酰基-Y -D-谷氨酸二肽的甲硅烷基化產生的。
26.根據權利要求25的方法，其中甲硅烷基-保護的L-Glu-y -D-Glu物質是從根據權利要求I至19任一項的方法產生的L-Glu- Y -D-Glu 二肽制備的。
27.根據權利要求26的方法，其中甲硅烷基化包括用甲硅烷基化劑處理。
28.根據權利要求27的方法，其中甲硅烷基化劑為0，N-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)。
29.根據權利要求21至28任一項的方法，其中偶聯反應是在乙腈中進行的。
30.根據權利要求21至29任一項的方法，其中任何涉及存在甲硅烷基化劑的操作都是在溫度范圍-10°C至+10°C進行的。
31.根據權利要求21至30任一項的方法，其還包括純化步驟，包括過濾、稀釋和沉淀，其通過加入謹慎限定量的堿水溶液，優選飽和碳酸氫鈉溶液，或酸水溶液，優選甲酸。
32.制備(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三鈉鹽(0NX-0801)的方法，其包括以下步驟: (i)提供(2，R)-((4，S)-羧基-4-(4，N-(((6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亞化學計量的鈉鹽在水性鈉堿中的溶液； (ii)如有必要，調節pH; (iii)柱色譜分離； (iv)任選地，濃縮從步驟(iii)洗脫的產物；和 (V)凍干。
33.根據權利要求32的方法，其中用于步驟⑴的(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，^(((65)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3!1-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸或其亞化學計量的鈉鹽是根據權利要求1至30任一項的方法制備的。
34.根據權利要求32或33的方法，其中在步驟(i)中，水性鈉堿溶液是碳酸氫鈉或碳酸鈉溶液。
35.根據權利要求32至34任一項的方法，其中在步驟(ii)中，將pH調節到范圍pH7.5-9.0ο
36.根據權利要求32至35任一項的方法，其中在步驟(iii)中，色譜分離包括在改良的聚苯乙烯樹脂柱上通過柱色譜純化，用水或含1-10%的水混溶性溶劑的水洗脫。
37.根據權利要求32至36任一項的方法，其中步驟(iv)包括濃縮收集的色譜級分，該級分包含(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三鈉鹽的稀水溶液，所述濃縮使用連續蒸發技術如刮膜式蒸發；基于膜的濃縮方法如超濾；或柱裝載和洗脫。
38.根據權利要求37的方法，其包括在0°C至10°C使用超濾將柱洗脫液濃縮4倍至16倍。
39.根據權利要求38的方法，其還包括在0°C至10°C將超濾儀器中的保留物透濾，以減少水溶性低分子量雜質的量。
40.根據權利要求32至39任一項的方法，其中步驟(v)產生的凍干餅狀物含有不超過10%重量的水。
41.化合物，其用于合成(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，N-(U6S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸及其三鈉鹽，其選自:(R) - 二(0-三甲基甲硅烷基)2- ((S) -5-(芐氧基)-4-(芐氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸酯；(R) -2- ((S) -5-(芐氧基)-4-(芐氧羰基氨基)-5-氧代戊酰胺基)戊二酸；(S)-O-1H-苯并[d][l，2，3]三唑-1-基 4-((2-(羥基甲基)-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酯；(R)- 二(0-三甲基甲硅烷基)2-((S)-4-(4-(((S)-2-(羥基甲基)-4-氧代-4，6，7,8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5_氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯；(S)-O-1H-苯并[d][l，2，3]三唑-1-基4-((2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4，6，7,8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酸酷；(R) - 二(0-三甲基甲硅烷基)2-(⑶-4- (4-((⑶-2-(三甲基甲硅烷氧基甲基)-4-氧代-4，6，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)-5_氧代-5-(三甲基甲硅烷氧基)戊酰胺基)戊二酸酯。
42.制備(2，R)- ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸三鈉鹽2的方法，包括: 根據權利要求1至19任一項的方法合成L-GlU- Y -D-GlU 二肽； 根據權利要求25至30任一項的方法從所述的L-Glu- Y -D-Glu 二肽合成(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸；和根據權利要求31至39任一項的方法，從所述的(2，R)-((4，S)_羧基-4-(4，^(((65)-2-(羥基甲基)-4-氧代-3，4，7，8-四氫-3!1-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸制備和純化(2，R) - ((4，S)-羧基-4- (4，N- (((6S) -2-(羥基甲基)_4_ 氧代-3，4，7，8-四氫-3H-環戊二烯并[g]喹唑啉-6-基)-N-(丙-2-炔基)氨基)苯甲酰胺基)丁酰胺基)戊二酸的三鈉鹽(0NX-0801) 。
【文檔編號】C07D239/80GK103748106SQ201180066993
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2011年12月19日 優先權日:2010年12月22日
【發明者】J.A.克申, A.J.布里奇斯, M.D.喬巴爾, S.M.達爾齊爾, T.E.杰克斯, A.S.湯普森, J.R.澤勒 申請人:奧尼克斯醫藥品股份有限公司