專利名稱：一種桉屬植物提取物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種桉屬植物，具體來說是一種桉屬植物提取物及其用途。
背景技術：
桉屬植物為桃金娘科植物的一個主要屬種，原產澳州，從1890年開始引入國內，目前在我國已有大規模種植，成為我國三大造林樹種之一。藍桉是桉屬植物中的一個主要成員，又名灰楊柳、玉樹、小球桉樹、藍油木、楊草果樹。桉屬植物原有主要用途如下其莖、枝可用于做木材、枕木、包裝材料和造紙，從其葉中提取出的桉葉油可用于香料生產和醫藥用途中，用于醫藥用途中的桉葉油多為藍桉葉油。
已有報道表明藍桉葉油具有抗多種細菌的作用，能抑制金黃色葡萄球菌及副傷寒桿菌的氧消耗及其琥珀脫氫酶活性，其濃度在6％以上時還具有抗結核桿菌的作用。臨床上通過抑菌實驗，發現藍桉葉油有抑菌能力，其對呼吸道感染，特別是對上呼吸道感染、慢性支氣管炎，具有較好療效，可有效祛痰。通過吸入和氣管滴入兩法應用時，對治療肺結核病人有令人滿意的效果。在消除常見癥狀，尤其是空洞閉合上似較其它抗癆藥物為佳。藍桉葉油也可用于某些皮膚病，并作為創傷面、潰瘍、瘺管的沖洗劑、除臭劑及神經病患者的鎮痛藥。此外藍桉葉油也常用于十滴水、清涼油、風油精、驅蚊油、止咳藥等。另民間也有用藍桉果實(俗名一口鐘)煎服治療感冒、哮喘、跌打損傷及真菌引起的皮膚病等疾病的治療，效果不錯。但至今為止尚未見到有對藍桉果實抗腫瘤作用進行系統研究的文獻和報道。

發明內容
本發明所要解決的問題是由于現實社會中人們認為桉屬植物只可用于造紙、木材和提取桉葉油，本發明的目的在于提供一種桉屬植物提取物及其用途，所述的提取物從桉屬植物中提取，所述的提取物包括熊果酸、2-羥基熊果酸、白樺脂酸、白樺脂酮，所述的熊果酸、2-羥基熊果酸、白樺脂酸、白樺脂酮占所述的提取物的重量百分比在50-95％之間，所述的桉屬植物包括藍桉、大葉桉、檸檬桉、斑皮桉、窿緣桉、大葉桉、柳葉桉、毛葉桉、尾葉桉、布氏桉、廣葉桉、粗皮桉、細葉桉和剛果桉，所述的桉屬植物中的提取部位為枝、葉或果實，優選的，所述的桉屬植物中的提取部位為藍桉果實，本發明的另一個目的為所述的提取物在制備治療腫瘤的藥物中的應用。本發明還提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有桉屬植物提取物中的總三萜類化合物，以及藥學上可接受的其他組分。本發明還提供了一種用于治療腫瘤的藥物組合物，所述的藥物組合物含有所述的桉屬植物提取物的有效成分即熊果酸、白樺脂酸、2-羥基熊果酸、白樺脂酮中的一種或者幾種，以及藥學上可接受的其他組分。
桉屬植物的提取物中含有抗腫瘤活性較好的總三萜類化合物(ETA)，并將其用于制備治療腫瘤的藥物。本發明中對提取出的ETA對接種人黑色素瘤B16細胞的小鼠的抑瘤作用進行了考察，結果表明ETA對小鼠黑色素瘤B16有明顯抑制作用。本發明中對14種桉屬植物的果實及其部分枝、葉中ETA的含量進行了考察，結果表明以上所考察對象中皆或多或少含有ETA。其中果實中的ETA含量要高于枝和葉中的ETA含量，而所有考察對象中ETA含量最多的為藍桉果實，其次為大葉桉、檸檬桉、斑皮桉的果實。
本發明中所提取出的ETA的主要成份有四種，其分別為熊果酸、白樺脂酸、白樺脂酮和2-羥基熊果酸。這四種主要成份在桉屬植物提取物ETA中所含的含量在50-95％之間，而這四種成分中又以熊果酸和白樺脂酸的含量最高、抗腫瘤活性最好。


圖1是熊果酸、羥基熊果酸、自樺脂酸、白樺脂酮和ETA五種化合物對腫瘤的抑制率的對照圖。
具體實施例方式實施例1對14種桉屬植物果實及部分枝、葉中ETA含量的考察。
取14種桉屬植物果實及部分枝、葉于60℃干燥12小時，粉碎。分別精密稱取10g置入100ml二氯甲烷中，超聲20分鐘，過濾。殘渣再用70ml二氯甲烷超聲提取，共提取3次。合并提取液，減壓濃縮至浸膏狀。在超聲振蕩條件下用適量甲醇使浸膏充分溶解，將溶解液轉移至離心管中，于3000r/min條件下離心10分鐘。將上清液轉移至10ml容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，使每ml甲醇中含有1g生藥。再精密量取該溶液8.0ml，內標溶液2.0ml混勻，采用高效毛細管電泳法(HPCE)對各樣品溶液中的4種主要三萜類成分的含量進行測定，并將測定值與原生藥量進行相比，求得4種主要三萜類成分在各種桉屬果實及部分枝葉中的相對含量。結果如下表所示14種桉屬植物果實及部分枝、葉中總三萜類化合物(ETA)含量測定結果(‰)樣品 熊果酸 白樺脂酮白樺脂酸2-羥基熊果酸窿緣桉果實0.21 0.680.11 0.63檸檬桉果實0.57 0.841.02 0.55斑葉桉果實0.72 0.620.63 0.60大葉桉果實0.64 0.560.97 0.88大葉桉葉 0.04 0.650.21 0.52斑皮桉果實0.82 0 0.15 1.06柳葉桉果實0.70 0 0.22 0.67毛葉桉果實0.64 0.280.75 0.88尾葉桉枝條0.02 0 0.06 0.01布氏桉果實0.55 0.270.56 1.08廣葉桉果實0.08 0.240.29 1.13尾葉桉葉 0.02 0.710.19 0.17尾葉桉果實0.35 0.750.84 0.84
粗皮桉果實 0.24 0.21 0.310.53細葉桉果實 0.31 0.25 0.340.52細葉桉葉 0.51 0.09 0.130.68藍桉果實 0.97 1.26 1.280.56剛果桉果實 0.47 0.52 0.430.35實施例2總三萜類化合物(ETA)及其內各組分體外抗腫瘤作用的研究將藍桉果實晾干，稱取20.0kg，粉碎，用95％乙醇于室溫滲漉提取，濾液減壓濃縮得乙醇浸膏A。將浸膏混懸于水中，用乙酸乙酯反復萃取，于不同洗脫時間可收集到相應分離組分，如熊果酸、羥基熊果酸、白樺脂酸、白樺脂酮等。將相應組分濃縮后再經進一步純化處理，即可得到各單組分純品。在一段時間內收集含以上組分的溶液，經濃縮后即可得到總三萜類化合物(ETA)。
選用SK-Hep 1人肝癌細胞株進行藥物體外抗腫瘤實驗。將此株細胞在培養瓶中培養至細胞數達1×107個。將細胞消化后，用DMEM培養液(GIBCO公司)將細胞稀釋至3×104/ml。取96孔板，每孔加入200ul稀釋好的細胞液，于37℃ 5％CO2孵箱中溫孵。24小時后，棄去原有細胞培養液，在相應孔中分別加入用DMEM培養液配制好的含不同濃度各種受試藥物的溶液200ul后，繼續將細胞培養板置于37℃ 5％CO2孵箱中溫孵。48小時后，各孔中分別加入10mg/ml MTT(Sigma公司)20ul，在同樣條件下再溫孵4小時后，每孔加入200ul的二甲基亞砜，混勻，室溫下放置半小時后測定吸光值。將96孔板置酶標儀上測定各孔在570nm處的吸光值(OD)。腫瘤抑制率＝(1--OD用藥組/OD對照組)×100％，試驗所得結果如下圖所示。
受試藥物有熊果酸、羥基熊果酸、白樺脂酸、白樺脂酮和ETA。各受試藥物皆分低、中、高三個劑量組，每組的藥物濃度分別為4ug/ml、20ug/ml、100ug/ml。對照組和各受試藥物各濃度組在96孔板上皆重復12孔。
實施例3.總三萜類化合物(ETA)體內抗腫瘤作用的研究將人黑色素瘤B16細胞(上海第二軍醫大學基礎免疫教研室提供)置于RPMI-1640培養液(GIBCO)中進行常規培養。取增殖期活性好的細胞，以體積為0.2ml、濃度為1×106細胞/只的劑量接種于C57BL/6J小鼠(購自中科院上海實驗動物中心)右大腿外側皮下。接種后次日將小鼠隨機分成6組，每組7只(具體分組見表2)。給受試藥組每只小鼠每天灌胃給予各相應濃度藥物溶液0.5ml；陰性對照組每只小鼠每天給予等體積的生理鹽水；陽性藥對照組每只小鼠每天給予相當劑量的氮烯米胺0.5ml。各組小鼠每天皆給藥1次，連續給藥10天。于停藥24小時后，將各組小鼠皆放血處死，進行尸體解剖，取出瘤塊稱重，計算腫瘤抑制率。實驗結果皆以均值±標準差表示，顯著性分析用Ts檢驗。
腫瘤抑制率＝(C-T)×100/C式中T為給藥組平均瘤重，C為對照組平均瘤重。
表2ETA對小鼠黑色素瘤的抑制作用組別給藥劑量體重(g) 瘤重 抑制率P值(mg/kg) 開始最后 (x±s)g (％)生理鹽水 0 19.222.32.41±0.30氮烯米胺 4019.822.60.74±0.5169.3 ＜0.01ETA 1 125 19.622.81.07±0.3755.6 ＜0.01ETA 2 250 18.621.71.10±0.1054.5 ＜0.01ETA 3 500 20.223.20.93±0.2361.4 ＜0.01實施例4.總三萜類化合物(ETA)體內免疫指標的影響按實施例3中的方法給C57BL/6J小鼠(購自中科院上海實驗動物中心)接種腫瘤細胞，并分組、給藥。于停藥24小時后，將各組小鼠皆放血處死。將小鼠用75％的乙醇浸泡消毒后，打開腹腔，分別取出腹腔巨噬細胞和脾臟進行處理。
將腹腔巨噬細胞離心、洗滌2次后，用RPMI 1640培養液調細胞濃度為5×105/ml。加入終濃度為10ug/ml的刀球蛋白A(ConA)后，將細胞懸液加入到細胞培養板上，于37℃ 5％CO2孵箱中溫孵24小時后吸出培養液，離心取上清。配制一系列標準濃度的TNG-α溶液，用雙抗夾心ELISA法測定其相應吸光值(OD)，并繪制成標準曲線。測定標本溶液中TGN-α的吸光值(OD)，并從標準曲線中求出其相應的濃度。結果如表3所示。
用取出的小鼠脾臟制成脾細胞濃度為5×106/ml的懸液，加入終濃度為10ug/ml的刀球蛋白A(ConA)后，將細胞懸液加入到細胞培養板上，于37℃ 5％CO2孵箱中溫孵48小時后吸出培養液，離心取上清。配制一系列標準濃度的IL-2溶液，用雙抗夾心ELISA法測定其相應吸光值(OD)，并繪制成標準曲線。測定標本溶液中IL-2的吸光值(OD)，并從標準曲線中求出其相應的濃度。結果如表3所示。
表3ETA對C57小鼠TNF、IL-2產生的影響。
組別 給藥劑量 TNF 含量 P值 IL-2 含量 P值(mg/kg)(pg/ml) (pg/ml)生理鹽水 0 119.6±53.0/ 97.1±41.5 /氮烯米胺 40103.8±43.7＞0.0592.5 ±41.5＞0.05ETA 1 125 135.2±37.5＜0.05119.5±42.0＜0.01ETA 2 250 144.1±16.7＜0.01112.7±43.5＜0.01ETA 3 500 156.2±82.1＜0.01138.2±34.8＜0.01實施例5桉屬植物的提取物的提取工藝將藍桉果實粉碎后，以等體積量的70％ 醇先浸潤15-30小時，然后再用其5-10倍體積量的70％乙醇煎煮3-5小時，共重復進行2次。合并2次所得煎煮液，回收乙醇至無醇味，此時以藍桉果實的生藥量進行計算，所得醇提取物的得率約為30-85％。
實施例6總三萜類化合物的生產提取工藝將實施例5所獲得的提取物靜置8-16小時后過濾，得沉淀及濾液。將濾液上大孔吸附樹脂柱，先后以水、40％乙醇和95％的乙醇液進行洗脫，收集95％乙醇洗脫液并將其回收至干，可得浸膏。合并浸膏及沉淀，用10％的NaOH溶液溶解后過濾，得濾液。將濾液用10％HCl溶液調PH值至3-4后靜置12小時，濾出析出的灰白色沉淀即為總三萜類化合物(ETA)。按藍桉果實生藥量進行計算，最終提取出的總三萜類化合物的得率介于20-70％之間。
權利要求
1，一種桉屬植物提取物，所述的提取物從桉屬植物中提取，其中，所述的提取物中含有總三萜類化合物，所述的總三萜類化合物包括熊果酸、2-羥基熊果酸、白樺脂酸、白樺脂酮組分的全部或部分。
2，如權利要求1所述的一種桉屬植物提取物，其中，所述的桉屬植物是藍桉、大葉桉、檸檬桉、斑皮桉、窿緣桉、大葉桉、柳葉桉、毛葉桉、尾葉桉、布氏桉、廣葉桉、粗皮桉、細葉桉或剛果桉中的一種或幾種。
3，如權利要求1所述的一種桉屬植物提取物，其中，所述的提取物在桉屬植物中的提取部位為植物的枝、葉或果實部位。
4，如權利要求1或2所述的一種桉屬植物提取物，其中，所述的桉屬植物是藍桉。
5，如權利要求4所述的一種桉屬植物提取物，其中，所述的提取物在藍桉中的提取部位為果實部位。
6，如權利要求1或2所述的一種桉屬植物提取物，其中，所述的桉屬植物是大葉桉、檸檬桉或斑皮桉中的一種或幾種。
7，如權利要求1所述的一種桉屬植物提取物，其中，所述的提取物是有機溶媒的提取物或者水提取物。
8，權利要求1所述的桉屬植物提取物在制備治療腫瘤的藥物中的應用。
9，一種藥物組合物，含有權利要求1所述的桉屬植物提取物中的總三萜類化合物，以及藥學上可接受的其他組分。
10，一種用于治療腫瘤的藥物組合物，含有權利要求1所述的桉屬植物提取物的有效成分即熊果酸、白樺脂酸、2-羥基熊果酸、白樺脂酮中的一種或者幾種，以及藥學上可接受的其他組分。
全文摘要
本發明涉及一種桉屬植物提取物及其在制備治療腫瘤藥物中的應用，動物體內實驗證明，從桉屬植物中提取出來的總三萜類化合物(ETA)可提高腫瘤小鼠體內IL－2和TNF水平、增強小鼠自身機體免疫力，對小鼠接種腫瘤具有一定的抑制作用。
文檔編號C07J63/00GK1521182SQ0311523
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月28日 優先權日2003年1月28日
發明者吳玉田, 朱洪莉, 謝天培 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學, 上海天甲生物醫藥有限公司, 上海源創生物醫藥有限公司