一種三層人工血管制備技術的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種三層(內層，中層和外層)人工血管的制備方法，內層是由墨水打印法制備的光滑致密薄層構成，能夠抑制血漿蛋白和血小板粘附，防止急性血栓形成，同時提供軸向的力學支持。中層是由濕法紡絲或熔融紡絲制備的取向微米纖維纏繞構成，其主要作用是引導組織細胞向取向纖維空隙內部生長，實現細胞外基質取向沉積排布，同時取向微米纖維能夠提供徑向力學支持。外層由粗的聚合物纖維纏繞并與中層緊密粘接在一起，主要是在人工血管彎曲時起到防止打折的作用。本發明制備的人工血管能夠顯著提高通暢率，而且能夠利用植入部位微環境實現擬天然重塑再生，在冠脈搭橋、血液透析、腦和外周血管替換方面具有良好的應用前景。
【專利說明】
一種三層人工血管制備技術
技術領域
[0001] 本發明屬于組織工程領域，具體地說是涉及一種三層人工血管制備方法。
【背景技術】
[0002] 血管性疾病是全球致死率最高的疾病，該疾病的發生常由于血管狹窄或阻塞導致 血流減少和營養物質缺乏，從而使組織或器官受損，通常表現為冠心病、腦血管病、外周動 脈疾病和深靜脈血栓。據世界衛生組織預測，到2030年全世界每年死于心血管相關疾病的 人數會增加到2330萬。血管移植手術仍是治療這類疾病常規手段，這類手術首選是采集使 用患者自體血管如大隱靜脈，兩側胸廓內動脈、橈動脈等。但是有些患者由于自體血管已經 被采集過或者患有復雜的血管病變而只能選擇小口徑人工血管代替。另外，血液透析動靜 脈痿構建，外傷性動脈損傷，外周動脈瘤等也要用到小口徑人工血管。目前，聚苯二甲酸乙 二醇酯（Dacron?)，膨體聚四氟乙烯(Gore-Tex?)和聚氨酯等材料制備的大口徑（內徑> 6mm)人工血管移植后長期通暢率較高，已廣泛應用于臨床。但用這類非降解材料制備的小 口徑血管在臨床上應用中通暢率很低，盡管研究者對其進行修飾例如接枝肝素等來改善其 抗凝血性能，但問題依然沒有得到解決。因此，開發新型小口徑人工血管（內徑<6mm)日益 受到國內外科學家的重視。
[0003] 目前，科學家已開發出多種工藝用來制備各種類型的小口徑人工血管，大致可分 三類:包括以合成材料和天然材料為基質制備人工血管技術，天然血管脫細胞技術和自組 裝技術。其中利用合成材料或天然材料制備得到的人工血管，可以通過活性修飾植入到體 內后，利用宿主重塑潛能來體內再生出擬天然的人工血管，這也是當前該領域研究的熱點 之一。研究者利用靜電紡絲，粒子瀝濾，相分離等多種技術制備具有孔隙的人工血管，然而 在利用這些技術制備人工血管的過程中極少考慮并控制人工血管內表面物理拓撲結構。大 量基礎研究顯示人工血管材料表面的拓撲結構(如光滑與粗糙程度），會影響血漿蛋白以及 血小板的粘附，同時也會影響內皮細胞和平滑肌細胞的粘附和增殖，進而影響人工血管的 通暢。可降解聚合物類人工血管還存在一個問題就是在長期植入體內后容易變形，并形成 動脈瘤，主要原因之一是由于人工血管材料的孔結構沒有規則，材料降解后導致新生血管 的細胞外基質無法形成擬天然取向排布，以致不能長期承受體內的血液壓力。另外，大量研 究中所制備的人工血管經過一定角度的彎曲會形成死折，在植入體內后會阻礙血液流通。
[0004] 為了解決上述問題，我們設計并制備了由內層、中層和外層組成的三層人工血管。 內層由10-100微米的光滑致密薄層構成，由于內表面光滑致密所以能夠抑制血漿蛋白和血 小板粘附，同時防止在植入時血液向人工血管壁滲透，引發急性血栓，另外致密的內層能夠 提供軸向的力學支持。中層由5-100微米具有一定角度排布的螺旋取向微米纖維纏繞而成， 其主要作用是引導周圍組織細胞向支架內部取向生長，實現細胞外基質取向沉積排布，同 時取向微米纖維能夠提供徑向力學支持。外層由50-500微米的聚合物纖維纏繞并與中層緊 密粘接在一起，主要是在人工血管彎曲時起到防止打折的作用。

【發明內容】

[0005] 本發明專利分為三步完成，第一步是利用墨水打印的方法制備人工血管致密光滑 薄層。具體方法包括，以化學純試劑(包括四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸、丙酮、三氟 乙醇、六氟異丙醇等)為溶劑，配制一定濃度(質量/體積分數為1%_60%)的可降解聚合物 (包括聚己內酯(PCL)、聚丙交酯(PLA)、聚（丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚乙醇酸(PGA)、 聚羥基脂肪酸酯(PHA)聚(丙交酯-己內酯)共聚物(PLCL)、聚對二氧六環己酮(TOS)等)或天 然材料(包括絲素蛋白、殼聚糖、明膠、膠原等)溶液，溶解完全后，將溶解的合成或天然材料 溶液裝入注射器中，利用微量注射栗將注射器中的聚合物溶液打印到位于下方轉速和移動 速度均可控的光滑金屬接收棒上，流速為0.1_50ml/h，注射器針頭與下方接收棒距離為 0.1-5cm，接收棒的轉速為l-500rpm，移動速度為lmm-50mm/ sec，擠出的聚合物溶液中的溶 劑成分揮發，從而固化形成薄膜，調節聚合物濃度、流速、接受棒轉動速度和移動速度等參 數從而制備厚度可控(5-200微米)的人工血管內層。
[0006] 發明專利的第二步是人工血管中層具有取向微米纖維的制備方法。具體可用濕法 紡絲或熔融紡絲加工而成，將第一步所制備的帶有光滑致密內層接收棒安裝在濕法紡絲儀 器上，將一定濃度聚合物溶液加入到注射器里，將注射器安裝在注射栗上，調整注射栗推進 速度、接收棒轉速和移動速度等參數來調控中層微米纖維的直徑以及纖維之間的角度從而 制得直徑為5-100微米取向纖維中層。同時也可以將第一步所制備的帶有光滑致密內層接 收棒安裝在熔融紡絲儀上，將聚合物添加到恒溫加熱料筒里，升溫使聚合物融化后，通過調 節料筒推進活塞速度、針頭粗細、接收棒轉速和橫向移動速度等參數來調控中層微米纖維 直徑、以及纖維之間的角度從而制得直徑為10-100微米取向纖維的人工血管中層。
[0007] 本發明專利的第三步是制備人工血管抗打折外層。具體是使用熔融紡絲的方法， 將第二步所制備的帶有中層和內層的接收棒安裝在熔融紡絲儀上，將聚合物添加到恒溫加 熱料筒里，升溫使聚合物融化后，調節料筒加熱溫度、活塞推進速度、針頭粗細、接收棒轉速 和移動速度等參數來調控外層微米纖維直徑、以及纖維之間的角度從而制得直徑為50-500微米具有取向纖維的人工血管外層。通過調節加熱料筒溫度使外層與中層緊密粘接。
[0008] 本發明專利與現有可降解聚合物類小口徑人工血管相比，具有以下優點：1、該人 工血管具有超薄致密光滑的內表面，與現有研究中常用的靜電紡絲技術制備的納米或微米 纖維人工血管的粗糙內表面相比能夠顯著降低血小板和蛋白的粘附，同時致密內層能夠防 止血液向人工血管壁內滲透，減少血小板的激活和急性血栓的形成，另外內層能夠增強該 人工血管的軸向力學;2、由于該人工血管中層具有螺旋取向微米纖維結構，這種取向的微 米纖維具有增強該人工血管的徑向力學作用，同時植入血管部位周圍組織細胞會向取向微 米纖維的孔隙快速迀移，并分泌膠原和彈性蛋白等細胞外基質，分泌的細胞外基質呈圓周 取向排布，這也能夠增強人工血管體內植入后的徑向力學，取向微米纖維和取向細胞外基 質二者共同作用可使人工血管在植入體內后能夠長期抵抗血液壓力，從而避免動脈瘤的形 成;3，該人工血管外層是由粗聚合物纖維螺旋纏繞而成，并且外層纖維與中層緊密粘接，這 樣在將該人工血管彎曲時可以防止打折;4、該人工血管制備工藝可控性強，可調控內層薄 膜的厚度，中層和外層纖維直徑以及纖維之間的角度和粘接程度等，同時也可以調控人工 血管的直徑。
【具體實施方式】
[0009] 實施例1:聚己內酯(PCL)三層人工血管的制備
[0010] 人工血管內層制備：稱取2. Og數均分子量為80000的PCL加入到IOml氯仿中，室溫 攪拌溶解過夜，制得濃度分數為20% (質量/體積）的PCL溶液。在室溫通風櫥中利用直接打 印法制備人工血管內層。將直徑為2. Omm不銹鋼接收棒安裝在打印機上。將PCL溶液吸入到 注射器中，將注射器安裝在注射栗上，將注射器針頭置于距離金屬接收棒上方2mm的位置。 設定注射栗推進速度為2ml/h，接收棒轉速為lOOrpm，橫向移動速度為0.2mm/sec，打印時間 為2min，制備完成后將帶有人工血管內層的接收棒真空干燥。
[0011] 人工血管中層制備：在室溫通風櫥中利用濕法紡絲制備人工血管中層。具體是將 帶有光滑致密內層的接收棒安裝在濕法紡絲儀上，將20 % PCL紡絲溶液吸入注射器中，將注 射器安裝在注射栗上，將注射器針頭置于紡絲凝固浴中距離接收棒Icm位置處。設定注射栗 速度為4ml/h，接收棒轉速為1000 rpm，移動速度為lmm/sec，紡絲時間為15min，完成后除去 凝固浴和紡絲液溶劑。
[0012] 人工血管外層制備:利用熔融紡絲法制備人工血管外層。具體是將帶有內層和中 層的接收棒安裝在熔融紡絲儀上，將20.0 gPCL添加到恒溫加熱料筒里，升溫到100°C使PCL 充分融化后，設定料筒推進活塞速度為l〇ml/h，接收棒轉速為400rpm，移動速度lmm/sec，時 間為2min。完成外層紡絲后將三層人工血管取下備用。
[0013] 實施例2:聚L-丙交酯-己內酯(PLCL)三層人工血管制備
[0014] 人工血管內層制備:稱取1.5g PLCL加入到IOml四氫呋喃溶劑中，室溫攪拌溶解過 夜，制得濃度分數為15% (質量/體積)的PLCL溶液。在室溫通風櫥中利用直接打印法制備人 工血管內層。將直徑為3.Omm不銹鋼接收棒安裝在打印機上。將PLCL溶液吸入注射器后安裝 在注射栗上，將注射器針頭置于距離金屬接收棒上方3. Omm的位置，設定注射栗推進速度為 3ml/h，接收棒轉速為200rpm，橫向移動速度為0.4mm/sec，打印時間為Imin，制備完成后將 帶有人工血管內層的接收棒真空干燥。
[0015] 人工血管中層制備：在室溫通風櫥中利用熔融紡絲制備人工血管中層。將帶有光 滑致密內層的接收棒安裝在熔融紡絲儀上，將20.OgPLCL添加到恒溫加熱料筒里，升溫到 240 °C使PLCL融化后，設定料筒推進活塞速度為lml/h，接收棒轉速為200rpm，移動速度 0.5mm/sec，時間為lOmin。
[0016] 人工血管外層制備：在室溫通風櫥中利用熔融紡絲制備人工血管外層。具體是將 帶有內層和中層的接收棒安裝在熔融紡絲儀上，將20.0 gPLCL添加到恒溫加熱料筒里，升溫 到240 °C使PLCL充分融化后，設定料筒推進活塞速度為12ml/h，接收棒轉速為200rpm，移動 速度2. Omm/sec，時間為lmin。完成外層紡絲后將三層人工血管取下備用。
[0017] 實施例3:聚丙交酯(PLA)三層人工血管制備
[0018] 人工血管內層制備:稱取1.2g PLA加入到IOml二氯甲烷中，室溫攪拌溶解過夜，制 得濃度分數為12 % (質量/體積)的PLA溶液。在室溫通風櫥中利用直接打印法制備人工血管 內層。將直徑為4. Omm不銹鋼接收棒安裝在打印機上。將PLA溶液吸入注射器后安裝在注射 栗上，將注射器針頭置于距離金屬接收棒上方3. Omm的位置，設定注射栗推進速度為3ml/h， 接收棒轉速為200rpm，橫向移動速度為0.41111]1/86〇，打印時間為11]1；[11，制備完成后將帶有人 工血管內層的接收棒真空干燥。
[0019] 人工血管中層制備：在室溫通風櫥中利用熔融紡絲制備人工血管中層。將帶有光 滑致密內層的接收棒安裝在熔融紡絲儀上，將10.OgPLA添加到恒溫加熱料筒里，升溫到260 TMiPLA融化后，設定料筒推進活塞速度為2ml/h，接收棒轉速為IOOrpm，移動速度0.7mm/ sec，時間為12min。
[0020] 人工血管外層制備：在室溫通風櫥中利用熔融紡絲制備人工血管外層。具體是將 帶有內層和中層的接收棒安裝在熔融紡絲儀上，將20.OgPLA添加到恒溫加熱料筒里，升溫 至|J260°C使PLA充分融化后，設定料筒推進活塞速度為14ml/h，接收棒轉速為600rpm，移動速 度3. Omm/sec，時間為lmin。完成外層紡絲后將三層人工血管取下備用。
【主權項】
1. 一種三層人工血管制備方法，其特征在于該方法所采用的技術方案包括以下步驟： 步驟一，人工血管內層制備。以生物可降解高分子為原料，由墨水打印法制備人工血管 內層，是由10-100微米的光滑致密薄層構成，由于內表面光滑致密所以能夠抑制血漿蛋白 和血小板粘附，同時防止在植入時血液向人工血管壁滲透，引發急性血栓，另外致密的內層 能夠增強軸向的力學強度； 步驟二，人工血管中層制備。中層是在人工血管內層外側通過靜電紡絲，濕法紡絲，熔 融紡絲或3D打印技術中的一種或者幾種制備得到，由具有一定角度排布的直徑為5-100微 米螺旋取向纖維纏繞而成，其主要作用是引導組織細胞向取向纖維空隙生長，實現細胞外 基質取向沉積排布，同時取向微米纖維和取向排布的細胞外基質能夠增強徑向力學強度。 步驟三，人工血管外層制備。外層是在人工血管內層和中層外側通過熔融紡絲和3D打 印法制備，由50-500微米的聚合物纖維纏繞并與中層緊密粘接在一起，主要是在人工血管 彎曲時起到防止打折的作用。2. 根據權利要求1所述的三層人工血管的制備方法，其中，所述的生物可降解高分子可 以是合成高分子聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)，聚L-丙交酯-己內酯(PLCL)，聚羥基脂肪酸 酯(PHA)，聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)，聚二噁烷酮(PDS)，聚氨酯(PU)中的一種或幾 種，所述的可降解天然材料包括絲素蛋白、殼聚糖、明膠、膠原的一種或幾種。
【文檔編號】A61L27/18GK106075596SQ201610589001
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月21日 公開號201610589001.3, CN 106075596 A, CN 106075596A, CN 201610589001, CN-A-106075596, CN106075596 A, CN106075596A, CN201610589001, CN201610589001.3
【發明人】朱美峰, 孔德領, 王愷, 董顯豪
【申請人】南開大學