血管新生因子融合蛋白在制備用于治療與血管新生相關的眼部疾病藥物中的應用
【專利摘要】本發明涉及多種血管新生因子融合蛋白在制備用于治療與血管新生相關的眼部疾病藥物中的應用，如糖尿病視網膜病變，年齡相關黃斑變性等。更具體地，本發明涉及VEGF受體和FGF受體的融合蛋白在制備用于治療與血管新生相關的眼部疾病藥物中的應用。
【專利說明】
血管新生因子融合蛋白在制備用于治療與血管新生相關的 眼部疾病藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發明涉及多種血管新生因子融合蛋白在制備用于治療與血管新生相關的眼部 疾病藥物中的應用，如糖尿病視網膜病變，年齡相關黃斑變性等。更具體地，本發明涉及 VEGF受體和FGF受體的融合蛋白和/或FGF受體融合蛋白在制備用于治療與血管新生相關 的眼部疾病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 眼底新生血管是多種眼部的嚴重并發癥，新生血管可以在角膜、虹膜睫狀體、脈 絡膜、視網膜、黃斑及視盤等幾乎眼內所有組織中出現，它能夠引起這些部位的組織出血、 滲出及增生等一系列病理改變，因而造成眼球結構和功能的破壞，嚴重損害視功能。這 一系列的眼底病變包括糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR)、早產兒視網膜 病（retinopathy ofprematurity，R0P)、年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD)等，嚴重影響視力，甚至致盲。
[0003]糖尿病視網膜病變（DR，Diabetic Retinopathy)是糖尿病（DM, Diabetes Mellitus)常見的微血管并發癥，是糖尿病的嚴重并發癥之一，發病機制復雜，致盲率 高，也是后天致盲性眼病的重要原因之一。臨床上，一般將DR分為3類：第一類為非增 殖型 DR(NPDR，Non-Proliferative Diabetic Retinopathy);第二類為增殖型 DR(PDR， Proliferative Diabetic Retinopathy)，此類型 DR 較為嚴重，致盲率高，50% PDR 患者會 在5年內致盲；第三類為糖尿病黃斑水腫（DME，Diabetic Macular Edema)，若不及時治療 會有失明的危險。在這三種類型的DR中，導致DR患者視力減退和喪失的主要是TOR和DME。 DR的病理特征為視網膜新生血管形成和BRB (血-網膜屏障）破壞。DR的基本病變為毛細 血管內皮細胞破壞，周細胞的選擇性減少甚至消失，細胞移行、增生，新生血管形成，出血、 滲出、膜增殖、牽拉性視網膜脫離直至失明。
[0004] 年齡相關性黃斑變性是一種隨年齡增加而發病率上升并導致中心視力下降的疾 病，又稱為老年相關性黃斑變性，是臨床上老年人眼底病中的常見病，也是一種嚴重損害中 心視力的眼病，以視覺極為敏感的視網膜黃斑區的退行性改變和新生血管生成為特征。臨 床上根據脈絡膜有無新生血管伸入視網膜色素上皮下，而將AMD分為萎縮型與滲出型（萎 縮型又稱為干性，滲出性又稱為濕性）。
[0005] 研究表明，VEGF是目前所知對血管新生最特異、最有效的生長因子[1，2]。1990 年代以來，以VEGF為靶標，通過阻斷VEGF信號通路抑制眼底血管新生的藥物成為開發的熱 點。蘭尼單抗（Ranibizumab，商品名Lucentis)可特異性地結合VEGF A，已獲美國FDA批 準用于治療濕性老年黃斑變性和糖尿病性黃斑水腫[3]。VEGF陷阱-眼（VEGF Trap-Eye) (阿柏西普或Eylea)是美國Regeneron制藥公司開發的抗VEGF重組蛋白，臨床研究結果顯 示對DME的療效令人滿意，已遞交治療DME補充申請。KH902(康柏西普，Conbercept)是成 都康弘公司開發的針對老年黃斑變性（AMD)的VEGFR-Fc重組蛋白，2013年12月批準上市 用于治療AMD [4]。以VEGF為靶標的雷珠單抗等成功用于DR的臨床研究和臨床應用中表明 VEGF是DR的主要有效靶標之一。
[0006] 盡管針對VEGF靶標的藥物在臨床上取得了很大的進展，由于血管新生受多種因 子的調節，血管新生的調控是一個十分復雜的動態平衡過程。現有的藥物在臨床治療中也 存在很大的局限性，因此如何進一步提高抗血管新生的臨床治療效果是研究者需要解決的 問題，也是研究開發下一代抗血管新生藥物的重點。
[0007] 成纖維細胞生長因子（FGF)是結合肝素的生長因子家族，在哺乳動物中其具有22 個家族成員（FGF 1-14, 16-23)。FGF在多種生物學功能上具有重要作用，例如細胞增殖、分 化、迀移、血管新生和腫瘤發生。其通過結合并活化細胞表面FGF受體（FGFR)發揮其多種 生物學功能[5]。成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR) 是與FGF家族成員相結合的受體。FGFR中的一部分參與疾病過程。

【發明內容】

[0008] 本發明人出人意料地發現拮抗血管新生因子（特別是拮抗FGF和/或雙重拮抗 VEGF和FGF)的大分子蛋白藥物能夠更好地抑制血管的新生，在臨床上得到更好的治療效 果。本發明人通過構建多種包含不同的VEGFR片段、FGFR片段和Ig GlFc的融合蛋白，獲 得了對VEGF和FGF (尤其是FGF-2)具有高度親和力的融合蛋白以及對FGF (尤其是FGF-2) 具有高度親和力的融合蛋白。而且，本發明人證明本發明的融合蛋白在用于治療血管新 生相關眼部疾病時的治療效果顯著優于現有技術中針對VEGF單靶標的藥物（例如美國 Regeneron公司研發的VEGF-Trap)。特別地，本發明的融合蛋白在糖尿病視網膜病（例如 STZ誘導的DR大鼠模型）、年齡相關的黃斑變性（例如激光致恒河猴脈絡膜新生血管抑制 模型）、早產兒視網膜病（例如高氧誘導的視網膜病OIR小鼠模型）中表現出出人意料地顯 著優于VEGF單靶標藥物的治療作用。
[0009] 在一個方面中，本發明提供了 VEGFR和FGFR的融合蛋白（VEGFR-FGFR融合蛋白） 在制備用于治療與血管新生相關的眼部疾病之藥物中的應用。
[0010] 特別地，本發明的VEGFR-FGFR融合蛋白包含=VEGFRl的第二Ig樣結構域、VEGFR2 的第三Ig樣結構域、源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR第二Ig樣結 構域和FGFR第三Ig樣結構域。
[0011] 在一些實施方案中，本發明的融合蛋白中所含的源自FGFR Ig樣結構域中間功能 性序列區的部分之氨基酸序列對應于SEQ ID NO: 1中起點為選自第119至151位的氨基酸 至終點為第162位氨基酸的氨基酸序列，優選為SEQ ID NO: 1第134至162位、145至162 位或151至162位所示的氨基酸序列，更優選為SEQ ID NO: 1第145至162位所示的氨基 酸序列。
[0012] 在另一些實施方案中，本發明的所述融合蛋白還包含免疫球蛋白Fc區，優選人 IgGlFc區，例如所述人IgGlFc區具有與SEQ ID N0:4相對應的氨基酸序列。
[0013] 在另一些實施方案中，所述VEGFRl第二Ig樣結構域具有：與SEQ ID NO: 2第151 至214位相對應的氨基酸序列，所述VEGFR2第三Ig樣結構域具有：與SEQ ID NO: 3第224 至320位相對應的氨基酸序列，所述FGFRl第二Ig樣結構域具有：與SEQ ID NO: 1第163 至247位相對應的氨基酸序列，和所述FGFRl第三Ig樣結構域具有：與SEQ ID N0:1第270 至359位相對應的氨基酸序列。
[0014] 在另一些實施方案中，本發明的VEGFR-FGFR融合蛋白具有SEQ ID NO: 5的氨基酸 序列。
[0015] 在又一些實施方案中，所述與血管新生相關的眼部疾病選自：年齡相關性黃斑變 性例如萎縮型AMD和滲出型AMD，糖尿病視網膜病變例如非增殖型DR、增殖型DR和DME，糖 尿病性黃斑水腫，早產兒視網膜病和視網膜血管阻塞。
[0016] 在一個方面中，本發明提供了 FGFR融合蛋白在制備用于治療與血管新生相關的 眼部疾病之藥物中的應用。優選地，本發明還提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和FGFR融合蛋白 在制備用于治療與血管新生相關的眼部疾病之藥物中的應用。特別地，本發明的FGFR融合 蛋白包含源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR第二Ig樣結構域和FGFR 第三Ig樣結構域。
[0017] 在另一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白在制備 用于在糖尿病對象中改善短期視網膜損傷之藥物中的應用。在一些實施方案中，所述短期 視網膜損傷選自減少視網膜血管網中凋亡細胞的數量、降低血-視網膜屏障的滲漏、抑制 視網膜膠質細胞反應性增生、以及改善神經視網膜和視網膜血管的超微結構。
[0018] 在又一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白在制備 用于在糖尿病對象中改善長期視網膜損傷之藥物中的應用。在一些實施方案中，所述長期 視網膜損傷選自改善視網膜屏障滲漏以及抑制毛細血管基底膜的增厚。
[0019] 在又一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白在制備 用于在早產兒視網膜病對象中改善視網膜無血管灌注區或者降低視網膜新生血管細胞核 數之藥物中的應用。
[0020] 在又一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白在制備 用于在對象中降低視網膜血管內皮細胞增殖、移行和/或管腔形成之藥物中的應用。
[0021] 在另一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白，其用于 治療與血管新生相關的眼部疾病。
[0022] 在另一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白，其用于 在糖尿病對象中改善短期視網膜損傷。在一些實施方案中，所述短期視網膜損傷選自減少 視網膜血管網中凋亡細胞的數量、降低血-視網膜屏障的滲漏、抑制視網膜膠質細胞反應 性增生、以及改善神經視網膜和視網膜血管的超微結構。
[0023] 在又一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白，其用于 在糖尿病對象中改善長期視網膜損傷。在一些實施方案中，所述長期視網膜損傷選自改善 視網膜屏障滲漏以及抑制毛細血管基底膜的增厚。
[0024] 在又一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白，其用于 在早產兒視網膜病對象中改善視網膜無血管灌注區或者降低視網膜新生血管細胞核數。
[0025] 在又一個方面，本發明提供了 VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白，其用于 在對象中降低視網膜血管內皮細胞增殖、移行和/或管腔形成。
[0026] 在另一個方面，本發明提供了在對象中治療與血管新生相關的眼部疾病的方法， 其包括向所述對象施用治療有效量的根據本發明的VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合 蛋白D
[0027] 在另一個方面，本發明提供了在糖尿病對象中改善短期視網膜損傷的方法，其包 括向所述對象施用治療有效量的根據本發明的VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋 白。在一些實施方案中，所述短期視網膜損傷選自減少視網膜血管網中凋亡細胞的數量、降 低血-視網膜屏障的滲漏、抑制視網膜膠質細胞反應性增生、以及改善神經視網膜和視網 膜血管的超微結構。
[0028] 在另一個方面，本發明提供了在糖尿病對象中改善長期視網膜損傷的方法，其包 括向所述對象施用治療有效量的根據本發明的VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋 白。在一些實施方案中，所述長期視網膜損傷選自改善視網膜屏障滲漏以及抑制毛細血管 基底膜的增厚。
[0029] 在另一個方面，本發明提供了在早產兒視網膜病對象中改善視網膜無血管灌注區 或者降低視網膜新生血管細胞核數的方法，其包括向所述對象施用治療有效量的根據本發 明的VEGFR-FGFR融合蛋白和/或FGFR融合蛋白。
[0030] 在另一個方面，本發明提供了在對象中降低視網膜血管內皮細胞增殖、移行和/ 或管腔形成的方法，其包括向所述對象施用治療有效量的根據本發明的VEGFR-FGFR融合 蛋白和/或FGFR融合蛋白。
[0031] 本發明的一個目的在于提供VEGFR和FGFR雙靶標融合蛋白在制備治療與新生血 管有關的眼部疾病中的藥物的應用。特別地，與新生血管有關的眼部疾病包括但不限于：年 齡相關性黃斑變性例如萎縮型AMD和滲出型AMD，糖尿病視網膜病變例如非增殖型DR、增殖 型DR和DME，糖尿病性黃斑水腫，早產兒視網膜病，視網膜血管阻塞等。
[0032] 本發明的VEGFR和FGFR雙靶標融合蛋白可具有如下的結構：包含至少一個衍生自 VEGFR胞外區的部分和至少一個衍生自FGFR胞外區的部分，其中所述衍生自VEGFR胞外區 的部分包含：VEGFRl的第二Ig樣結構域和VEGFR2的第三樣結構域，所述衍生自FGFR胞外 區的部分由以下組成：源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR第二Ig樣結 構域和FGFR第三Ig樣結構域，其中所述FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區是FGFR蛋白 中第一 Ig樣結構域和第二Ig樣結構域之間的序列，并且所述源自FGFR Ig樣結構域中間 功能性序列區的部分對應于SEQ ID NO: 1中起點為選自第119至151位的氨基酸至終點為 第162位氨基酸的氨基酸序列，上述結構域和/或部分之間直接連接和/或通過接頭連接。
[0033] 優選地，本發明的雙靶標融合蛋白具有如SEQ ID N0:5所述的氨基酸序列。
[0034] 在一個實施方式中，在STZ誘導糖尿病大鼠的短期視網膜損傷模型中，本發明的 VEGFR和FGFR雙靶標融合蛋白能夠顯著減少糖尿病視網膜血管網中凋亡細胞的數量，顯著 降低糖尿病早期血-視網膜屏障的滲漏，明顯抑制視網膜膠質細胞反應性增生。改善神經 視網膜和視網膜血管的超微結構。
[0035] 在另一個實施方式中，在STZ誘導糖尿病大鼠的長期視網膜損傷模型中，本發明 的VEGFR和FGFR雙靶標融合蛋白能夠改善糖尿病大鼠視網膜屏障滲漏現象，抑制DR毛細 血管基底膜的增厚。
[0036] 在另一實施方式中，本發明的VEGFR和FGFR雙靶標融合蛋白能夠有效改善高氧誘 導的OIR小鼠視網膜無血管灌注區，顯著降低視網膜新生血管細胞核數。
[0037] 在又一個實施方式中，本發明的VEGFR和FGFR雙靶標融合蛋白顯著降低高糖和 VEGF+FGF誘導的視網膜血管內皮細胞增殖、移行和管腔形成.
[0038] 在又一實施方式中，在恒河猴脈絡膜新生血管模型中，本發明的VEGFR和FGFR雙 靶標融合蛋白能夠改善熒光滲漏現象。
【附圖說明】：
[0039] 圖I. VF28對胰酶消化大鼠視網膜血管網的細胞凋亡的抑制作用
[0040] *ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01，***ρ〈0· 001。
[0041] 圖2.伊文思藍法檢測血-視網膜屏障滲漏：注射伊文思藍染料之前，大鼠形態正 常（A)。注射染料之后，大鼠的眼，耳廓，四肢末端，以及尾巴均呈現藍色（B)。用標準曲線 法檢測檢測血（C)和視網膜（D)中的伊文思藍含量，然后根據計算公式定量分析各組視網 膜中的伊文思藍含量（Ε)。*ρ〈0·05，***ρ〈0·001。
[0042] 圖3. GFAP染色檢測各組神經視網膜膠質細胞活化。
[0043] 圖4.電鏡檢測神經視網膜和視網膜血管的早期變化：電鏡檢測并對比各處理組 脈絡膜血管，感光細胞外節，外核層，以及視網膜血管的超微結構。
[0044] 圖5VF28對糖尿病大鼠視網膜VEGF (圖5Α)和FGF (圖5Β)蛋白水平的影響， *ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01。
[0045] 圖6VF28對糖尿病大鼠視網膜各基因 mRNA表達的影響（*ρ〈0. 05)。A : ICAM-ImRNA ;B :TNF- a mRNA。
[0046] 圖7. FITC-右旋糖酐球后注射顯示對各組大鼠視網膜血管網的標記。
[0047] 圖8.胰酶消化視網膜毛細血管網的PAS染色結果：正常視網膜毛細血管網未見 或極少見無細胞毛細血管結構。糖尿病視網膜血管網視野下可見多個無細胞毛細血管結構 (黑色箭頭所示）。
[0048] 圖9.伊文思藍法檢測血-視網膜屏障滲漏：㈧和⑶分別為檢測血和視網 膜中伊文思藍含量的標準曲線；(C)為各組大鼠視網膜中伊文思藍含量的定量分析。 *ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01。
[0049] 圖10.透射電鏡檢測視網膜毛細血管基底膜厚度：㈧為各組大鼠視網膜毛細血 管透射電鏡的代表性圖片，其中毛細血管基底膜以白色箭頭標出。（B)為各組毛細血管基底 膜厚度的定量分析；*Ρ〈〇· 05, #ρ〈0· 01，*#ρ〈0· 001。
[0050] 圖11.蛋白質印跡（Western Blot)檢測VEGF與FGF蛋白水平的變化：(A)⑶分 別代表各組VEGF和FGF蛋白定量分析。*ρ〈(λ 05, #ρ〈(λ 01，*#ρ〈(λ 001
[0051] 圖12.蛋白質印跡檢測FLK蛋白水平的變化：柱形圖表示FLK蛋白定量分析。 *ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01，***p〈0. 001
[0052] 圖13.眼底熒光血管造影顯示各組小鼠視網膜血管狀況：各組小鼠經球后注射高 分子量FITC-右旋糖酐后，視網膜鋪片的代表性圖片如（A)所示。視網膜無灌注區所占面 積比例量化分析如（B)所示。***ρ〈0·001。
[0053] 圖14ΗΕ染色檢測各組小鼠視網膜新生血管細胞核數：㈧為各組視網膜石蠟切片 HE染色的代表性圖片。（B)為各組小鼠平均每張視網膜切片新生血管細胞核數的定量分 析。***ρ〈〇·〇〇1。
[0054] 圖15.蛋白質印跡結果檢測PEDF、VEGF蛋白水平的變化。
[0055] 圖16.高糖刺激下視網膜血管內皮細胞的數量變化。高糖刺激 后24h(A)，48h⑶，72h(C)，各處理組RF/6A細胞的數量變化如圖所示。 *ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01，***ρ〈0· 001。
[0056] 圖17.高糖刺激下，視網膜血管內皮細胞的移行試驗。㈧為各處理組細胞移行之 后，結晶紫染色后的代表性圖片。（B)為各組移行細胞的定量分析。***ρ〈0. 001。
[0057] 圖18.高糖刺激下，劃痕試驗6h㈧和12h(B)后的視網膜血管內皮細胞的定量分 析。
[0058] 圖19.高糖刺激下，RF/6A細胞管腔形成實驗。（A)為各處理組的代表性圖片。（B) 為各組成管腔的定量分析。**ρ〈〇· 01，***ρ〈〇· 001。
[0059] 圖20. VF28對VEGF+FGF刺激下RF/6A細胞增殖的影響，視網膜血管內皮細胞的數 量變化。*Ρ〈0·05，***ρ〈0·001。
[0060] 圖21. VEGF和FGF因子刺激下，視網膜血管內皮細胞的移行。㈧為結晶紫染色后， 各組細胞的代表性圖片。（B)為各組移行細胞數量的定量分析結果。*ρ〈0. 05, ***ρ〈0. 001。
[0061] 圖22.在VEGF和FGF因子刺激下，RF/6A細胞的管腔形成。（A)為各處理組細胞 的代表性圖片。（B)為各組成管腔數量的定量分析。***p〈0. 001。
[0062] 圖23.高糖刺激下，視網膜血管內皮細胞中VEGF和FGF基因和蛋白表達的動態變 化。在高糖（33mM)培養基的刺激之下，RF/6A細胞中VEGF和FGF基因在轉錄水平隨時間 的變化趨勢如（A)所示。VEGF和FGF在蛋白水平的表達分別如（B)和（C)所示。
[0063] 圖24.恒河猴激光致脈絡膜新生血管增生模型中，各給藥組對眼熒光滲漏的改善 情況。
【具體實施方式】：
[0064] 定義：
[0065] 除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同 含義。關于本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的 標準3字母和/或1字母代碼。
[0066] 盡管本發明的廣義范圍所示的數字范圍和參數近似值，但是具體實施例中所示的 數值盡可能準確的進行記載。然而，任何數值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各 自的測量中存在的標準偏差所致。另外，本文公開的所有范圍應理解為涵蓋其中包含的任 何和所有子范圍。例如記載的"1至10"的范圍應認為包含最小值1和最大值10之間（包 含端點）的任何和所有子范圍；也就是說，所有以最小值1或更大起始的子范圍，例如1至 6. 1，以及以最大值10或更小終止的子范圍，例如5. 5至10。另外，任何稱為"并入本文"的 參考文獻應理解為以其整體并入。
[0067] 另外應注意，如本說明書中所使用的，單數形式包括其所指對象的復數形式，除非 清楚且明確的限于一個所指對象。術語"或"可與術語"和/或"互換使用，除非上下文另 有清楚指明。
[0068] 本文使用的術語"VEGFR-FGFR融合蛋白"可以與"VEGFR和FGFR的融合蛋白"互 換使用，表示血管內皮生長因子受體或其片段與成纖維細胞生長因子受體或其片段融合得 到的融合蛋白。在一些特定實施方案中，本發明的VEGFR-FGFR融合蛋白是VEGFR-FGFR-Fc 融合蛋白，即VEGFR、FGFR和Fe的融合蛋白。在一些實施方案中，本發明的VEGFR-FGFI^i 合蛋白是分離的。優選地，本發明的VEGFR-FGFR融合蛋白是可溶性融合蛋白。優選地，本 發明的VEGFR-FGFR融合蛋白中各個結構域和/或部分直接相連或者通過接頭相連。
[0069] 本文使用的術語"FGFR融合蛋白"表示成纖維細胞生長因子受體或其片段與其 他蛋白片段融合得到的融合蛋白。在一些特定實施方案中，本發明的FGFR融合蛋白是 FGFR-Fc融合蛋白，即FGFR和Fe的融合蛋白。在一些實施方案中，本發明的FGFR融合蛋 白是分離的。優選地，本發明的FGFR融合蛋白是可溶性融合蛋白。優選地，本發明的FGFR 融合蛋白中各個結構域和/或部分直接相連或者通過接頭相連。更優選地，本發明的FGFR 融合蛋白是FGF陷阱。
[0070] 本文使用的術語"Fc"、"Fc區"、"Fc片段"或"免疫球蛋白Fe區"等表示免疫球蛋 白的可結晶片段，在本發明中，所述Fe區優選人IgGl的Fe區。
[0071 ] 術語"Fc融合蛋白"指將異源蛋白質的結合特異性與免疫球蛋白恒定結構域的效 應子功能相結合的抗體樣分子。從結構上來說，Fe融合蛋白包含具有所需結合特異性的氨 基酸序列以及免疫球蛋白恒定結構域序列。Fe融合蛋白分子通常包含受體或配體的結合位 點。所述免疫球蛋白恒定結構域序列可以獲得自任何免疫球蛋白，例如IgG-1，IgG-2, IgG-3 或 IgG-4 亞型，IgA (包括 IgA-I 和 IgA-2)，IgE，IgD 或 IgM。
[0072] 本文使用的術語"可溶性"蛋白是指在生物學相關的溫度、pH水平和滲透壓下可溶 于水溶液的蛋白。本文使用的"可溶性融合蛋白"表示該融合蛋白不包含跨膜區和胞內區。
[0073] 如本文所用，術語"分離的"是指以下物質和/或實體，（1)與起初產生時（在天 然環境中和/或在試驗設置中）和其相關聯的至少一些組分相分離和/或（2)通過人工生 產、制備和/或制造。分離的物質和/或實體可與至少約10%、約20%、約30%、約40%、 約 50%、約 60%、約 70%、約 80%、約 90%、約 95%、約 98%、約 99%、基本 100%或 100% 的其初始相關聯的其他組分相分離。
[0074] 術語"部分"和"片段"可互換的指代多肽、核酸或其它分子構建物的一部分。
[0075] 本文使用的術語"VEGFR"是指血管內皮生長因子受體，其可以是VEGFR1、VEGFR2 和/或VEGFR3。優選地，本發明中的VEGFR是VEGFRl和/或VEGFR2,優選人的VEGFR。
[0076] 本文使用的術語"FGFR"是指成纖維細胞生長因子受體，其可以是FGFR1、FGFR2、 FGFR3和/或FGFR4。優選地，本發明中的FGFR是FGFRl，更優選人FGFRl。
[0077] 本文使用的術語"Ig樣結構域"表示免疫球蛋白樣結構域，其可見于多種蛋白質家 族，參與多種生物學功能，包括細胞-細胞識別、細胞表面受體、免疫功能等等。
[0078] 本文使用的術語"VEGFR第一 Ig樣結構域"表示VEGFR蛋白中自N端起第一個Ig 樣結構域，優選VEGFRl蛋白自N端起第一個Ig樣結構域（本文稱為VEGFRl第一 Ig樣結 構域）或VEGFR2蛋白自N端起第一個Ig樣結構域（本文稱為VEGFR2第一 Ig樣結構域）， 具有例如SEQ ID N0:2第32至123或SEQ ID N0:3第46至110位的氨基酸序列。類似 地，VEGFR第二Ig樣結構域具有例如SEQ ID NO: 2第151至214位或SEQ ID NO: 3第141 至207位的氨基酸序列，VEGFR第三Ig樣結構域具有例如SEQ ID NO: 2第230至327位或 SEQ ID N0:3第224至320位的氨基酸序列，VEGFR第四Ig樣結構域具有例如SEQ ID N0:2 第335至421位或SEQ ID N0:3第328至414位的氨基酸序列，VEGFR第五Ig樣結構域例 如具有SEQ ID N0:2第428至553位或SEQ ID N0:3第421至548位的氨基酸序列，VEGFR 第六Ig樣結構域具有例如SEQ ID NO: 2第556至654位或SEQ ID NO: 3第551至660位 的氨基酸序列，VEGFR第七Ig樣結構域具有例如SEQ ID NO: 2第661至747位或SEQ ID NO: 3第667至753位的氨基酸序列。優選地，所述VEGFR可以是VEGFRl或VEGFR2。
[0079] 本文使用的術語"FGFR第一 Ig樣結構域"或"FGFR1第一 Ig樣結構域"表示FGFR 或FGFRl蛋白中自N端起第一個Ig樣結構域，其具有例如SEQ ID NO: 1第40至118位的 氨基酸序列。類似地，術語"FGFR第二Ig樣結構域"或"第二Ig樣結構域"表示FGFR蛋白 中自N端起第二個Ig樣結構域，其具有例如SEQ ID NO: 1第163至247位的氨基酸序列； 術語"FGFR第三Ig樣結構域"或"第三Ig樣結構域"表示FGFR蛋白中自N端起第一個Ig 樣結構域，其具有例如SEQ ID NO: 1第270至359位的氨基酸序列。優選地，所述FGFR是 FGFRl，FGFR第一 Ig樣結構域是FGFRl第一 Ig樣結構域，FGFR第二Ig樣結構域是FGFRl 第二Ig樣結構域，FGFR第三Ig樣結構域是FGFRl第三Ig樣結構域。
[0080] 本文使用的術語"FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區"或"中間功能性序列區" 表示FGFR蛋白中第一 Ig樣結構域和第二Ig樣結構域之間的序列，優選地，IFS序列具有 對應于SEQ ID NO: 1第118至162位的氨基酸序列。本發明人出乎意料地發現，所述中間 功能性序列區對于Ig樣結構域的功能具有顯著的影響。所述FGFR蛋白優選FGFRl (SEQ ID NO: 1)，特別是人FGFRl蛋白。人FGFRl蛋白的氨基酸序列參見SEQ ID NO: 1。
[0081] 下面給出hFGFRl的部分序列，陰影部分依次表示各個Ig樣結構域，可參見 //www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/AAH15035. I
[0082] MffSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVE FLVHPG0LLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTR1TGEEVE VQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNY sdalpssedddddddssseeketdn tkpnpvapywtspekmekk L|| AyPAAKTVKFKCPSS GTFHFTmWLKHGKEFJCFDIlMGGYICyRYATWSriMMVVFSBKG HYTCIVEmyGSIHHTYQLDWE Rsphrpilqaglpanktvalgs n VErMCKWSBFQFHIQWLKHIEVNGSICIOPDNLPYVQlLKTAGVNT TDKEMEVLHLRINVSFEDAGEYTCLAGNSiGLSHHSAWLTVLEA LEER
[0083] FGFRl的氨基酸序列參見SEQ ID NO: I。
[0084] 下面給出hVEGFRl的部分序列，陰影部分依次表示各個Ig樣結構域，各結構域之 間為天然連接序列，可參見
[0085] //www.uniprot.org/uniprot/P17948:
[0086] SKLKD PELSLKGTQHIMiQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMV SKESERLSITKSACGENGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVF TSKKKETESA iyifisdtgrpfvemyseipeiIHMTE GRELYIPCRVTS PN1TVTLKKFFL0TLIPDG ICRi IWDSRKG Pl ISNATV KEIGLLTCE AT VMGH lyktnylthrqtnti IBVQISTFRFVELLEGETLVLNCTATTF LNTRVQMTWSVPDEKNKRASVIiRRlBQSMSHANIFYSV^rlDKMQ EKBKGhYTcmm^BmmmsvmIYDKAFI Tvkhrkqqyletva GiCMSYiiLSfVIICVKAFPSPEVVWLKDCLPATEKSARVLTRGYSLirKD VTEEDAG-NYTlLLSIKQSHWimLTAT livnvk pQIYEKAVSSFFBFA LYPtCSRQI LTCTAYGI PQPTi KW FWH PCN IiN HSEARCOFCSN NEE SFlLDAPSNMGNRlESiTQRMAIIEG KNKMASTLVVADSRISGIYlCiA SN KVGTVG RN ISFY IT DV PNCFHVNLEKMPTECEDLKLSCTVNKFt YROVTWILLRTVNNRTMHYSrSKQKMAITKEHSITLNLTiMNVSLQ DSGTYACRARNYYTGEEILQKKEIT irdQea PYLLRNLSOHWAISS STTLBCHANGVPEPQiTWFKNNHKI QQEiiGlILOPGSSTLRERVTE EDEGVYHCKATNQKGSVESSAYLT vqgtsdksnle
[0087] VEGFRl的氨基酸序列參見SEQ ID NO:2。
[0088] 下面給出hVEGFR2的部分序列，陰影部分依次表不各個Ig樣結構域，各結構域之 間為天然連接序列，可參見
[0089] //www. uniprot. org/uniprot/P35968
[0090] asvglpsvsldlprlsiqkdiltikaotxlQITCEGQRBLDWLW rNNQSGSEQRVEVTECSBCLFCKTLTrPKVICNDTGAVKCFYRETD I ASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGWYITE NKNCTW1PCLQS格· NVSLCARYFEJECRFVFDQNRrSWPSKKOFTlFSYMISyAOMVFCEAK 睡 IVDE SYQS 頂 yivvvvgyri 瓦 KLVLNCmitT ELNVOIBrN^^EYFSSKH'Q'HKKLVINRDLCTQSGSEMKKrLSTLTm G￥TRSI>QGL￥T€AASSGLMTIOCNST FVRVHEK FF￥AFGSGMESL￥ EATVGERVRIPAKYLGYPFPEMWYKNGIFLESNHTIKAGHYLTIME vserbtgnytviltnfiskikqshws lwyvp FqiqeksmSFVDSy qygttqtltctvyaippfhhihwywqleeecanefsqavsvtjmpyp Ceewrsvedfqoginkievmknqfaliegicnkwstlviqaanvsal VKCEAVNKVGRGERVISFHVT ? PE1TLQPDMQPTEQESVSLWCTA BRSTrENI^TWYKLG^FLriBYGELFTFVCMKLBTLWKLNATMFS NSTN Dl LiM EL KN ASLQDQGO Y VCL AQDRKTKKRHC V VRQ LT VLERVA PTITGNLENQTTSi€ESIS：￥SCTASGNPrPQIMWFK.DNS：TLVS：DS GI￥LKBGHlMLTIlE￥MKEDEGL￥TC〇A€S￥LGCAKyEAFFI IEGAQEKTNLE
[0091] VEGFR2的氨基酸序列參見SEQ ID N0:3。
[0092] 本文所使用的術語"對象"是指哺乳動物，如人類，但也可以是其它動物，如家養動 物（如狗、貓等），家畜（如牛、羊、豬、馬等）或實驗動物（如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠 等）。
[0093] 本文使用的術語"接頭"、"肽接頭"、"連接序列"或"接頭序列"表示將本發明融合 蛋白所包含的各個結構域和/或區域相連接的短氨基酸序列，其一般為0-20個氨基酸長， 優選2-10個氨基酸。
[0094] 本文使用的術語融合蛋白或部分或結構域"與SEQ ID Ν0:Ν對應的氨基酸序列" 表示，所述融合蛋白或部分或結構域具有基本上如SEQ ID Ν0:Ν所示的氨基酸序列，優選地 其中含有不超過1、2、3、4、5、10或20個氨基酸替換、添加或缺失，又優選地所述融合蛋白或 部分或結構域具有與SEQ ID NO:N所示氨基酸序列至少80%、90%、93%、95%、97%、98% 或99%的同一性，更優選地，所述融合蛋白或部分或結構域具有SEQ ID NO:N所示氨基酸序 列。
[0095] 本發明的VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白還可包含翻譯后修飾。這樣的修飾包括但不 限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰基化。結果，經修飾的VEGFR-FGFR-Fc融合 蛋白可包含非氨基酸組分，例如聚乙二醇、脂質、多糖或單糖以及磷酸。這樣的非氨基酸組 分對VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白功能的作用可如本文針對其它VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白變體 所述的那樣進行測試。當VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白在細胞中產生時，翻譯后加工對于正確 折疊和/或蛋白質功能可能也是重要的。不同的細胞（例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、 NIH-3T3或HEK293)擁有針對這些翻譯后活性的特定細胞機器和特有機制，并且可以選擇 不同的細胞以確保VEGFR-FGFR-Fc融合蛋白的正確修飾和加工。
[0096] 本文所述的融合蛋白可通過任何本領域已知的方法產生。例如化學合成或從核酸 表達來產生。可根據本領域已知的完善的標準液體或優選固相肽合成方法容易地制備用于 本發明的肽（參見，例如 J.M. Stewart 和 J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition,Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois(1984), in M. Bodanzsky 和 A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984))〇 可以使用本領域已知技術產生所述融合蛋白以在位于預期包含在所述蛋白中的多肽序列 內的半胱氨酸殘基之間形成一個或多個分子內交聯（參見例如美國專利No. 5478925)。另 外，本文所述蛋白質可以通過在所述蛋白質的C端或N端添加半胱氨酸或生物素進行常規 修飾。
[0097] 本文使用的術語"治療有效量"或"有效量"是指足以顯示其對于所施用對象益處 的劑量。施用的實際量，以及施用的速率和時間過程會取決于所治療者的自身情況和嚴重 程度。治療的處方（例如對劑量的決定等）最終是全科醫生及其它醫生的責任并依賴其做 決定，通常考慮所治療的疾病、患者個體的情況、遞送部位、施用方法以及對于醫生來說已 知的其它因素。
[0098] 本文使用的術語"VF28"表示特定的VEGFR-FGFR融合蛋白，其包含VEGFRl的第二 Ig樣結構域、VEGFR2的第三Ig樣結構域、源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部 分、FGFR第二Ig樣結構域、FGFR第三Ig樣結構域和Fc片段。VF28是28#VEGFR-FGFR融 合蛋白的縮寫，其構建過程和其他信息可參見CN102219859A。具體地，VF28的氨基酸序列 如 SEQ ID NO:5 所示。
[0099] 本文使用的術語"FGF陷阱"是指FGFR-Fc融合蛋白，其可用作FGF的陷阱，從而拮 抗FGF。具體地，本發明實施例中所用的FGF陷阱是26#FGFR融合蛋白，其構建過程和其他 信息可參見CN102219860A。具體地，本發明實施例中所用的FGF陷阱的氨基酸序列如SEQ ID NO:6 所示。
[0100] 本文使用的術語" VEGF陷阱"是指VEGFR-Fc融合蛋白，其可用作VEGF的陷講，從 而詰抗VEGF。具體地，本發明實施例中所用的VEGF陷講是美國Regeneron制藥公司開發的 抗VEGF重組蛋白，其可從市場上購得。
[0101] 本發明的VEGFR-FGFR融合蛋白按照中國專利申請公開CN102219860A和 CN102219859A所公開的方法進行構建，其中所述專利申請公開通過引用以整體并入本文。
[0102] 實施例是對本發明進行進一步的闡述和解釋，而不應被看作是對本發明的限制。
[0103] 實施例1VF28對STZ誘導糖尿病大鼠的早期視網膜損傷的保護作用
[0104] 方法：8-10周齡SD大鼠，體重200-220g(購自于中國人民解放軍軍事醫學科學院 實驗動物中心），2% STZ(鏈脈佐菌素，Streptozotocin, ;Amresco Chemical Co. ,USA)以 45mg/kg的劑量注射誘導產生糖尿病模型；另設正常對照組，按體重注射等體積的檸檬酸 鈉緩沖溶液。于72小時后監測血糖水平，以動物血糖高于20mmol/L為造模成功標準，納入 糖尿病（DM)實驗組；造模成功的DM大鼠隨機分為模型對照組、VF28低劑量（1 μ g/眼）、 VF28 中劑量（3 μ g/ 眼），VF28 高劑量（9 μ g/ 眼），FGF 陷阱（FGF trap) (3 μ g/ 眼）和 VEGF 陷講（VEGF trap)(購自 Regeneron/Bayer) (3 μ g/ 眼），每組 15 只。
[0105] VF28 藥物濃度為 10mg/mL，規格 ImL/支；VEGF trap 濃度為 40mg/mL，規格 ImL/支； FGF trap濃度為5mg/mL，lmL/支。VF28、VEGF trap和FGF trap臨用前均采用無菌生理鹽 水稀釋成所需要的濃度使用，稀釋后在冰浴放置并在24小時內使用。所有藥物未稀釋前在 2-8 °C保存。
[0106] 在造模1周和4周后，各組各大鼠行玻璃體腔內注射給藥，每眼注射體積為3 μ L。 不同藥物組別大鼠，分別緩慢玻腔注射各自的藥物，模型對照組和正常對照組大鼠給予等 體積生理鹽水。糖尿病6周后，檢測視網膜血管內皮細胞凋亡；檢測視網膜中膠質細胞標志 基因 GFAP的表達；檢測血-視網膜屏障滲漏狀況；檢測視網膜血管和神經的超微結構的早 期變化；采用ELISA方法檢測視網膜組織勻漿液中FGF和VEGF因子的蛋白含量（檢測試劑 盒購自R&D公司）以及采用RT-PCR方法檢測VEGF、FGF、ICAM-I和TNF - α的mRNA表達以 期研究VF28對糖尿病早期血管內皮損傷保護作用的分子機制。
[0107] 結果：在6周的病程中，DM大鼠經兩次經玻璃體腔注射低、中、高3個劑量VF28 (1、 3和9 μ g/眼）或藥物VEGF-陷阱（3 μ g/眼）或FGF陷阱（3 μ g/眼），結果如下：
[0108] 1)VF28能顯著減少糖尿病視網膜血管網中凋亡細胞的數量，且相同劑量（3 μ g/ 眼）的VF28顯著優于VEGF陷阱（見圖1所示）；
[0109] 2)高劑量VF28顯著降低糖尿病早期血-視網膜屏障的滲漏（見圖2所示）；
[0110] 3) VF28各劑量均能明顯抑制視網膜膠質細胞反應性增生（見圖3所示）；
[0111] 4) VF28各劑量組均能改善神經視網膜和視網膜血管的超微結構（見圖4所示）；
[0112] 5)對于糖尿病早期視網膜中顯著上調的VEGF蛋白水平，VF28低、中、高劑量均有 顯著抑制作用（見圖5所示）；
[0113] 6)對于糖尿病早期視網膜中增加的FGF蛋白水平（非顯著性），VF28中、低劑量 顯著下調FGF蛋白水平，而VF28高劑量和FGF陷阱能夠使其降至與正常對照組的FGF水平 相近（見圖5所示）；
[0114] 7)在mRNA的表達水平上，在糖尿病早期大鼠視網膜中的ICAM-I和TNF- α的 mRNA顯著上調；VF28和FGF陷阱顯著下調ICAM-I和TNF - a mRNA水平（見圖6所示）。
[0115] 實施例2VF28對STZ誘導糖尿病大鼠的長期視網膜損傷的保護作用
[0116] 方法：8-10周齡SD大鼠，體重200-220g(購自于中國人民解放軍軍事醫學科學院 實驗動物中心）飼養在普通環境中，如實施例1中方法進行糖尿病造模；造模成功的DM大 鼠隨機分為模型對照組、VF28低劑量（2 μ g/眼）、VF28中劑量（6 μ g/眼），VF28高劑量 (18 μ g/眼），FGF陷阱（12 μ g/眼）和VEGF陷阱（12 μ g/眼），并同時設正常對照組。在 造模后第5周和第9周，各組各大鼠玻璃體腔內注射給各自的藥物，給藥方法同實施例1。 糖尿病12周后，觀察視網膜血管網的滲漏情況、血-視網膜屏障滲漏狀況，檢測有無細胞膜 細血管結構；視網膜毛細血管基底膜增厚的變化；并檢測視網膜勻漿液中FGF、VEGF和FLK 因子蛋白含量的變化。
[0117] 結果：在12周的病程中，DM大鼠經兩次經玻璃體腔注射低、中、高3個劑量 VF28 (2、6 和 18 μ g/ 眼，分別相當 13. 5、40· 6 和 122pmoL/ 眼）或 VEGF 陷阱（12 μ g/ 眼， IMpmoL/眼）或FGF陷阱（I2 μ g/眼，lHpmoL/眼），結果如下：
[0118] 1)球后注射高分子量FITC-右旋糖酐只可標記糖尿病大鼠視網膜血管網，正常對 照組和其它各治療組的視網膜血管網均不可標記。結果表明VF28能夠顯著改善血-視網 膜屏障滲漏（圖7所示）。
[0119] 2)胰酶消化視網膜毛細血管網的PAS染色結果顯示VF28(2-18yg/眼）和FGF陷 阱（12 μ g/眼）均可顯著改善糖尿病視網膜無細胞毛細血管結構（見圖8所示）。
[0120] 3)在伊文思藍實驗中，VF28和FGF陷阱均可顯著改善糖尿病大鼠視網膜屏障滲漏 的現象，且摩爾劑量相近的VF28的作用顯著優于VEGF陷阱（P〈0. 05)(見圖9所示）。
[0121] 4)VF28和FGF陷阱均可顯著抑制DR毛細血管基底膜的增厚，且摩爾劑量相近的 VF28的作用顯著優于VEGF陷阱和FGF陷阱（P〈0. 05)(見圖10所示）。
[0122] 5)蛋白質印跡結果顯示，糖尿病組視網膜勻漿液中的VEGF和FGF含量顯著增加， 而VF28各劑量組可顯著降低VEGF的蛋白表達量，VF28高劑量組可顯著降低FGF的蛋白含 量（見圖11所示）。
[0123] 6)另一方面，蛋白質印跡結果顯示，介導VEGF信號傳導通路的主要受體FLK(又名 VEGFR2)，在糖尿病視網膜中蛋白水平顯著降低，而在VF28各干預組呈劑量依賴性地增加， 在中高劑量組恢復到與正常對照組水平相似。在VEGF陷阱組，FLK的蛋白水平顯著高于正 常對照組水平，FGF陷阱組，FLK水平與正常對照組相似。（見圖12所示）。
[0124] 7)摩爾劑量相近的VF28對長期糖尿病大鼠視網膜毛細血管基底膜增厚的抑制作 用顯著優于VEGF陷阱和FGF陷阱；對糖尿病組視網膜勻漿液中顯著增加的VEGF和FGF含 量均有顯著的抑制作用，而VEGF陷阱和FGF陷阱均只能顯著抑制各自靶標的異常上調，對 非靶標無作用。這些研究顯示在眼內有限空間注射相同摩爾劑量的生物靶向藥，作用于雙 靶標（VEGF+FGF)的VF28優于單靶標藥物VEGF陷阱（靶標VEGF)和FGF陷阱（靶標FGF)。
[0125] 實施例3在高氧誘導的OIR小鼠中觀察VF28對視網膜新生血管的干預作用
[0126] 方法：實驗所用的C57母、乳鼠購自于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物 中心，乳鼠日齡3-5d。OIR小鼠在出生7天（P7)時置于高氧處理的密閉氧艙中飼養5天， 正常對照組在常氧下飼養。在P12出倉后，OIR小鼠每眼立即經玻璃體腔注射低（0.5yg)、 高（1 μ g)劑量VF28,以及VEGF陷阱（0. 5 μ g)和FGF陷阱（0. 5 μ g)，雙眼注射，每眼注射 體積為I yL，并按照注射藥物不同分組；正常對照組注射生理鹽水，所有小鼠在注射后在 常氧狀態下再飼養5天。通過球后注射FITC-右旋糖酐行眼底熒光血管造影，觀察視網膜 血管變化，測量視網膜無灌注區的相對面積；檢測新生血管細胞核的數目；檢測眼勻漿液 中PEDF和VEGF蛋白含量的變化。
[0127] 結果：0IR小鼠經單次經玻璃體腔注射低、高2個劑量VF28 (0. 5和1 μ g/眼）或 藥物VEGF陷阱（0· 5 μ g/眼）或FGF陷阱（0· 5 μ g/眼），結果如下：
[0128] 1)眼底熒光血管造影顯示OIR小鼠視網膜出現無灌注區和大量排列紊亂的新生 血管，以及迂曲擴張的視網膜靜脈；各藥物干預組的無灌注區的相對面積顯著低于OIR小 鼠，VF28對視網膜無血管灌注區的改善作用顯著優于FGF陷阱組（見圖13所示）。
[0129] 2)檢測各組小鼠視網膜新生血管細胞核數試驗結果顯示高氧處理后，小鼠視網膜 新生血管核數較常氧組顯著增加。VF28、VEGF陷阱和FGF陷阱均可以顯著降低OIR小鼠視 網膜新生血管核數，同劑量的VF28組顯著優于VEGF trap組和FGF trap組（見圖14所 示）。
[0130] 3)蛋白質印跡結果顯示，PEDF和VEGF在OIR小鼠眼勻漿液中呈相反的變化，表現 為VEGF水平顯著升高而PEDF顯著降低；VF28 (0. 5-1 μ g/眼）能顯著降低VEGF水平而使 PEDF反應性地顯著增加（P〈0.0 Olvs模型組）；FGF陷阱（0. 5 μ g/眼）能顯著增加 PEDF水 平（P〈0. 05vs模型組）但是對VEGF的上調沒有影響（見圖15所示）。
[0131] 因此，VF28在OIR小鼠模型中，可有效改善視網膜無血管灌注區，顯著降低視網膜 新生血管細胞核數。
[0132] 實施例4VF28體外對高糖和VEGF+FGF刺激下視網膜血管內皮細胞的藥效學研究 及其分子機制
[0133] 方法：在體外利用視網膜血管內皮細胞為模型研究了 VF28作用下的細胞行為學 改變。將猴視網膜血管內皮細胞RF/6A(購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫） 置于33mmol/L高糖培養基中，分別用實時PCR和ELISA檢測12、24、36、48h后VEGF和FGF 基因和蛋白的表達狀況；在高糖刺激24、48、72h后，VEGF(80ng/mL)+FGF(70ng/mL)因子刺 激48h小時后，檢測不同劑量的VF28 (0. 025、0. 08和0. 24 μ g/ μ L)對RF/6A細胞增殖的影 響；從細胞增殖試驗中篩選出最佳VF28劑量后，將VF28、VEGF陷阱、FGF陷阱藥物分別加入 到培養基中使終濃度均為〇. 08 μ g/ μ L，分別采用TranswelUMatrigel和劃痕實驗檢測這 些藥物對高糖和VEGF+FGF因子刺激下的RF/6A細胞的移行和管腔形成的作用。
[0134] 結果：（見圖 16-23)
[0135] 1)在體外實驗中，VF28和FGF陷阱均可顯著降低高糖和VEGF+FGF誘導的視網膜 血管內皮細胞增殖、移行和管腔形成（見圖16-23)。
[0136] 2)完全出人意料地，FGF陷阱抑制血管內皮細胞增殖的效果強于各種劑量的VF28 以及VEGF陷阱。（見圖16, 20)
[0137] 3)在VEGF+FGF因子刺激下Transwell移行試驗以及高糖刺激下的劃痕試驗中， FGF陷阱和VF28能夠顯著抑制視網膜血管內皮細胞的移行，其兩者顯著強于VEGF陷阱。 (見圖 18, 21)
[0138] 4)在高糖刺激下視網膜血管內皮細胞中VEGF和FGF基因的mRNA和蛋白水平均上 調.（見圖23).
[0139] 5) VF28通過作用于VEGF和FGF靶標而使之對視網膜內皮細胞的管腔形成抑制作 用與VEGF陷阱相近，對視網膜內皮細胞的增殖和移行抑制作用與FGF陷阱相近，VF28綜合 了 VEGF陷阱和FGF陷阱的兩者作用優勢。
[0140] 實施例5本發明的融合蛋白對激光致恒河猴脈絡膜新生血管抑制作用
[0141] 方法：將實驗動物恒河猴麻醉、散瞳后頭部固定于眼科激光光凝儀前，經全視網膜 鏡光凝黃斑區。光凝圍繞黃斑中心凹，每眼照射6~8個點。激光參數：光斑直徑50μπι， 能量〇. 6~0. 7W，曝光時間0. 05s。激光光凝后2~3周做1次熒光素血管造影術及光學 相干斷層掃描（OCT)檢查，作為造模成功與否判斷依據。
[0142] VF28經雙眼玻璃體單次注射給予0. 5、0. 25、0. 05mg/眼，同時給予FGF陷阱、VEGF 陷阱，0. 5mg/眼，模型對照組給予灌注液BSS Plus (Alcon公司），玻璃體注射，單次給藥。分 別于光凝前、光凝后當日、給藥前，給藥后7、14天熒光素血管造影（FFA)檢查。對熒光斑進 行1-4級分級評分并計算熒光素滲漏面積改善率.
[0143] 共冰辨、)P.而細r羊抑Λ給_滅光素7參漏面積-給藥后灰光素感漏面積，ΛΛ 災光素，參漏面積改褲㈨=--χΙΟΟ 給麵熒光_漏面積
[0144] 實驗結果：通過對熒光斑面積以及熒光滲漏面積的改善來評價藥物作用效果，結 果如圖24所示：與模型組（不給藥組）相比，本發明的融合蛋白（VF28和FGF陷阱）顯著 改善了熒光滲漏，而模型組給藥14天雖未見進展但28天后熒光滲漏明顯增加。
[0145] VF28藥效呈現一定的劑量相關性，即0· 5mg/眼優于0· 25mg/眼優于0· 05mg/眼。
[0146] 參考文獻
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[0151] [5]Eswarakumarj Lax I，Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev. 2005, 16:139-149.
【主權項】
1. VEGFR-FGFR融合蛋白在制備用于治療與血管新生相關的眼部疾病之藥物中的應用， 所述融合蛋白包含：VEGFR1的第二Ig樣結構域、VEGFR2的第三Ig樣結構域、源自FGFR Ig 樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR第二Ig樣結構域和FGFR第三Ig樣結構域。2. 根據權利要求1的應用，其中所述融合蛋白還包含免疫球蛋白Fc區，優選人IgGIFc 區，例如所述人IgGIFc區具有與SEQ ID N0:4相對應的氨基酸序列。3. 根據權利要求1的應用，其中： 所述VEGFR1第二Ig樣結構域具有：與SEQ ID NO: 2第151至214位相對應的氨基酸 序列， 所述VEGFR2第三Ig樣結構域具有：與SEQ ID NO: 3第224至320位相對應的氨基酸 序列， 所述FGFR1第二Ig樣結構域具有：與SEQ ID NO: 1第163至247位相對應的氨基酸序 列，和 所述FGFR1第三Ig樣結構域具有：與SEQ ID NO: 1第270至359位相對應的氨基酸序 列。4. 根據權利要求1的應用，其中所述VEGFR-FGFR融合蛋白具有SEQ ID NO: 5的氨基酸 序列。5. 根據權利要求1的應用，其中所述與血管新生相關的眼部疾病選自：年齡相關性黃 斑變性例如萎縮型AMD和滲出型AMD，糖尿病視網膜病變例如非增殖型DR、增殖型DR和 DME，糖尿病性黃斑水腫，早產兒視網膜病和視網膜血管阻塞。 6. VEGFR-FGFR融合蛋白在制備用于在糖尿病對象中改善短期視網膜損傷之藥物中的 應用，所述融合蛋白包含：VEGFR1的第二Ig樣結構域、VEGFR2的第三Ig樣結構域、源自 FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR第二Ig樣結構域和FGFR第三Ig樣結構 域。7. 根據權利要求6的應用，其中所述短期視網膜損傷選自減少視網膜血管網中凋亡細 胞的數量、降低血-視網膜屏障的滲漏、抑制視網膜膠質細胞反應性增生、以及改善神經視 網膜和視網膜血管的超微結構。 8. VEGFR-FGFR融合蛋白在制備用于在糖尿病對象中改善長期視網膜損傷之藥物中的 應用，所述融合蛋白包含：VEGFR1的第二Ig樣結構域、VEGFR2的第三Ig樣結構域、源自 FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR第二Ig樣結構域和FGFR第三Ig樣結構 域。9. 根據權利要求8的應用，其中所述長期視網膜損傷選自改善視網膜屏障滲漏以及抑 制毛細血管基底膜的增厚。10. 根據權利要求1的應用，其中所述源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部分 之氨基酸序列對應于SEQ ID NO: 1中起點為選自第119至151位的氨基酸至終點為第162 位氨基酸的氨基酸序列，優選為SEQ ID NO: 1第134至162位、145至162位或151至162 位所示的氨基酸序列，更優選為SEQ ID N0:1第145至162位所示的氨基酸序列。 11. VEGFR-FGFR融合蛋白在制備用于在早產兒視網膜病對象中改善視網膜無血管灌注 區或者降低視網膜新生血管細胞核數之藥物中的應用，所述融合蛋白包含：VEGFR1的第二 Ig樣結構域、VEGFR2的第三Ig樣結構域、源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部 分、FGFR第二Ig樣結構域和FGFR第三Ig樣結構域。 12. VEGFR-FGFR融合蛋白在制備用于在對象中降低視網膜血管內皮細胞增殖、移行和 /或管腔形成之藥物中的應用，所述融合蛋白包含：VEGFR1的第二Ig樣結構域、VEGFR2的 第三Ig樣結構域、源自FGFR Ig樣結構域中間功能性序列區的部分、FGFR第二Ig樣結構 域和FGFR第三Ig樣結構域。
【文檔編號】A61P27/02GK105983093SQ201510072627
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月11日
【發明人】房健民, 姜靜, 黃敏, 李偉偉
【申請人】煙臺榮昌生物工程有限公司