用于從微生物細胞獲得微生物油的方法
【專利摘要】本發明公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸(PUFA)的微生物油的方法，其通過裂解細胞以形成裂解細胞組合物然后從所述裂解細胞組合物回收所述油。本發明還公開了包含一種或多種PUFA的微生物油，其通過至少一個本文所述的方法自微生物回收細胞。
【專利說明】用于從微生物細胞獲得微生物油的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求申請日為2013年12月20日的美國臨時申請No.61/918,953的申請日權 益，其公開內容在此通過提述并入。
[0003] 發明背景
[0004] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，所述方法通過裂解所述細胞以形成裂解細胞組合物，然后從所 述裂解細胞組合物回收該油。本文還公開了包含一種或多種PUFA的微生物油，所述PUFA是 通過本發明所述的至少一種方法從微生物細胞回收的。
[0005] 含有一種或多種PUFA的微生物油是由微生物所生產，例如，舉例而言，藻類及真菌 類。
[0006] 從微生物細胞獲得含PUFA的油的通常方法涉及:使能夠生產所需的油的微生物在 發酵器、池或生物反應器中生長以生產微生物細胞生物質(biomass);從所述生物質生長的 發酵培養基分離該生物質;干燥該微生物細胞生物質，使用不與水互溶的有機溶劑(例如己 烷)從該干燥的細胞提取所述油；以及從所述油去除該有機溶劑(例如己烷）。此方法還可以 涉及用水稀釋含有所述細胞生物質的該發酵培養基，然后進行離心以從經稀釋的發酵培養 基分離所述生物質。
[0007] 從微生物細胞獲得含PUFA的油的另一種方法涉及:使能夠生產所需的油的微生物 在發酵器、池或生物反應器中生長，以生產微生物細胞生物質;通過使用機械力（例如均質 化）、酶處理、或化學處理破壞細胞壁，從而將所述含PUFA的油釋放至該細胞生長的發酵培 養基中；以及用水溶性有機溶劑(例如異丙醇)從所得的含有含PUFA的油、細胞碎片和液體 組合物回收該油。可以從該組合物機械地分離所述油，并且必須從所述油和水性生物質廢 物流二者去除醇。
[0008] 上述任一項從微生物細胞獲得含PUFA的油的方法的工業規模利用，需要使用大量 的揮發性且可燃的有機溶劑，這產生了危險的操作條件且需要使用昂貴的防爆設備。此外， 使用有機溶劑會產生有機溶劑廢棄物流其需要執行昂貴的溶劑回收工藝以解決對于揮發 性有機化合物(V0C)排放的嚴格環境限制，這又導致需要更多的人力以及昂貴的設備。
[0009] 并且，上述方法中使用熱來干燥細胞和/或從回收的油去除溶劑可降解含PUFA的 油且增加能源的使用，這可進一步增加加工成本。當含PUFA的油暴露于氧時(如當微生物細 胞壁的完整性被破壞時)和/或微生物細胞暴露于熱時，發生降解。
[0010] 用于從微生物細胞獲得含PUFA的油的無溶劑方法涉及:使能夠生產所需的油的微 生物在發酵器、池或生物反應器中生長以產生微生物細胞生物質;通過使用機械力(例如均 質化）、酶處理、或化學處理破壞細胞壁而將所述含PUFA的油釋放至該細胞生長的發酵培養 基中；以及通過提升PH、添加鹽、加熱，和/或攪拌所得的組合物而從所得的組合物（其包含 含有PUFA的油、細胞碎片和液體）回收粗制油。然而，此種從細胞獲得含PUFA的油的無溶劑 方法可需要長的油回收時間、大量的鹽，和/或許多步驟，其都能增加加工成本。
[0011]結果，仍然需要一種用于從微生物細胞獲得高質量的含PUFA的油的方法，其不使 用揮發性有機溶劑、可以使用容易得到的設備進行、需要最小數目的步驟、具有更短的油回 收時間，并且能提供高質量的含PUFA的油的高產量/收率(yield)。
[0012] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合 物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括降低所述裂解細胞組合物的pH)以形成去乳化 的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離該油；以及(d)回收該油。
[0013] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合 物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括在(a)之前、過程中、或之后添加乳化劑）以形成 去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離所述油；以及(d)回收 所述油，其中（a)或(b)中至少一個還包括將所述細胞或組合物加熱到至少70°C的溫度。
[0014] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合 物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括在(a)之前、過程中、或之后添加乳化劑并將裂 解細胞組合物的pH提升至8或更高）以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的 裂解細胞組合物分離所述油；以及(d)回收所述油。
[0015] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合 物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括在(a)之前、過程中、或之后添加離子性乳化劑） 以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離所述油；以及 (d)回收所述油。
[0016] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合 物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括在(a)之前、過程中、或之后添加離子性乳化劑） 以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去乳化的裂解細胞組合物分離所述油；以及 (d)回收所述油，其中（a)或(b)中至少一個還包括將所述細胞或組合物加熱到至少70°C的 溫度。
[0017] 本文公開了用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸 (PUFA)的微生物油的方法，其包括(a)裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合 物；（b)將所述裂解細胞組合物去乳化(包括在(a)之前、過程中、或之后添加離子性乳化劑 并將裂解細胞組合物的pH提升至8或更高）以形成去乳化的裂解細胞組合物；（c)從所述去 乳化的裂解細胞組合物分離所述油；以及(d)回收所述油。
[0018] 本發明公開了通過本文所述任一方法獲得的微生物油。
[0019] 本領域普通技術人員在閱讀以下詳細說明后，會更容易了解本發明的特征和優 點。應該了解的是，出于更清楚的原因，上文和下文的分開的實施方案的語境中所述的本發 明的某些特征也可以組合以形成其次級組合(sub-combinations)。
[0020] 本文作為示例鑒定的實施方案意欲為說明性的而非限制性的。
[0021] 術語"約"意欲獲取所述數字以上和以下的變動，其可以實現與所述數字基本相同 的結果。
[0022] 基于碳鏈的長度和飽和度特征來對脂肪酸進行分類。微生物油中存在的脂肪酸能 夠具有4至28個碳原子，并根據鏈中存在的碳數目而被稱為短鏈、中鏈或長鏈脂肪酸。當碳 原子之間不存在雙鍵時，脂肪酸被稱為飽和脂肪酸，而當存在雙鍵時脂肪酸則被稱為不飽 和脂肪酸。當只存在一個雙鍵時，不飽和長鏈脂肪酸是單不飽和的，而當存在多于一個雙鍵 時，不飽和長鏈脂肪酸是多不飽和的。
[0023] 本文所述的微生物油意指包含一種或多種PUFA且獲取自微生物細胞的油。
[0024] 多不飽和脂肪酸(PUFA)是根據距脂肪酸的甲基端的第一個雙鍵的位置來分類的； ω -3 (n-3)脂肪酸在第三個碳上含有第一個雙鍵，而ω -6 (n-6)脂肪酸在第六個碳上含有第 一個雙鍵。例如，二十二碳六烯酸（"DHA"）是一種鏈長為22個碳并有6個雙鍵的ω -3長鏈多 不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，通常稱為"22: 6η-3"。在一個實施方案中，PUFA選自ω -3脂肪酸、 ω-6脂肪酸，及其混合物。在另一個實施方案中，PUFA選自LC-PUFA。在又一個實施方案中， PUFA選自二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸 (ARA)、γ -亞麻酸(GLA)、二高-γ -亞麻酸(DGLA)、十八碳四稀酸（stearidonic acid，SDA)， 及其混合物。在另一個實施方案中，PUFA選自DHA、ARA，及其混合物。在又一個實施方案中， PUFA是DHA。在又一個實施方案中，PUFA是ARA。
[0025] LC-PUFA是含有至少3個雙鍵且具有18個或更多個碳或是20個或更多個碳的鏈長 的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFA包括但不限于二高-γ-亞麻酸（C20:3n-6)、花生四烯酸 (C20:4n-6)( "ARA"）、二十二碳四稀酸或腎上腺酸(adrenic acid) (C22:4n-6)，以及二十二 碳五烯酸(C22: 5n-6) ( "DPA n-6"）。ω-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20: 311-3)、二十碳四烯酸（020:411-3)、二十碳五烯酸（020 :511-3)(1?^)、二十二碳五烯酸 (C22:5n-3)，以及二十二碳六烯酸(CSSin-ShLC-PUFA還包括具有大于22個碳以及4個或 更多個雙鍵的脂肪酸，包括但不限于C24:6(n-3)與C28:8(n-3)。
[0026] PUFA可以為如下形式：游離脂肪酸、鹽、脂肪酸酯（例如甲酯或乙酯）、單酰甘油 (MAG)、二酰甘油(DAG)、三酰甘油(TAG)，和/或磷脂(PL)。
[0027] 高度不飽合脂肪酸(HUFA)是含有4個或更多個不飽和碳-碳鍵的ω -3和/或ω -6多 不飽和脂肪酸。
[0028] 如本文所用的，"細胞"意指一種含油生物材料，如衍生自油質微生物的生物材料。 由微生物生產的或從微生物細胞獲得的油稱為"微生物油"。由藻類和/或真菌所生產的油 也分別稱為藻類油和/或真菌油。
[0029] 如本文所用的，"微生物細胞"或"微生物"意指生物體，例如藻類、細菌、真菌、原生 生物、酵母，及其組合，例如單細胞生物。在一些實施方案中，微生物細胞是真核細胞。微生 物細胞包括但不限于，金藻(例如不等鞭毛類(Stramenopiles)界的微生物）、綠藻、娃藻類、 溝鞭藻類（dinof lagellates)(例如溝鞭藻（Dinophyceae)目的微生物，包括隱甲藻屬 (Crypthecodinium)的成員，如例如，寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii或C. cohnii)); 破囊壺菌目（Thraustochytriales)的微藻類;酵母(子囊菌類或擔子菌類），以及毛霉屬 (Mucor)和被孢霉屬（Mortierel la)的真菌，包括但不限于高山被孢霉（Mortierel la alpina)及施穆克被孢霉(Mortierella sect, schmuckeri)，以及腐霉屬(Pythium)，包括但 不限于詭譎腐霉(Pythium insidiosum)。
[0030] 在一個實施方案中，微生物細胞來自被孢霉屬、隱甲藻屬，或是破囊壺菌目。在又 一個實施方案中，微生物細胞來自寇氏隱甲藻。在又一個實施方案中，微生物細胞選自寇氏 隱甲藻、高山被孢霉、破囊壺菌（Thraustochytrium)屬、裂殖壺菌（Schizochytr ium)屬，及 其混合物。
[0031]在又一個實施方案中，微生物細胞包括但不限于屬于以下的微生物:被孢霉屬、耳 霉屬(Conidiobolus)、腐霉屬、疫霉屬(Phytophthora)、青霉屬(Penicillium)、枝孢霉屬 (Cladospori um)、毛霉屬、鐮孢屬（Fusar ium)、曲霉屬（Aspergillus)、紅酵母屬 (Rhodotorula)、蟲霉屬（Entomophthora)、刺抱囊霉屬（Echinosporangium)，以及水霉屬 (Saprolegnia)。在另一個實施方案中，ARA獲取自微生物細胞，所述微生物細胞來自被孢霉 屬，包括但不限于長孢被孢霉（Mortierella elongata)、微小被孢霉（Mortierella exigua)、喜濕被孢霉（Mortierella hygrophila)、高山被孢霉、施穆克被孢霉 (Mortierella schmuckeri)，以及小被抱霉(Mortierella minutissima)。在另一個實施方 案中，ARA獲取自微生物細胞，所述微生物細胞來自：長孢被孢霉IF08570、微小被孢霉 IF08571、喜濕被孢霉 IF05941、高山被孢霉 IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、 CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、和 CBS754.68,及其突變體。在又一個實施方案中，微生物細胞來自高山被孢霉。
[0032]在更進一步中，微生物細胞是來自破囊壺菌目（Thraustochytriales)的微藻，其 包括但不限于破囊壺菌屬(1'11抑1181：0〇1171：1'；[11111)(物種包括31'11(1；[111611丨316、金黃色破囊壺菌 (aureum)、benthicola、球破囊壺菌(globosum)、金尼破囊壺菌(kinnei)、動孢破囊壺菌 (11101：；^11111)、多增殖性破囊壺菌(1]11111：；[1'11(1；[11161^316)、厚皮破囊壺菌(。3(3117(161'1]111111)、層出破 囊壺菌(proliferum)、粉紅破囊壺菌(roseum)，以及紋帶破囊壺菌（striatum));裂殖壺菌 屬（Schizochytrium)(物種包括聚生裂殖壺菌（aggregatum)、limnaceum、紅樹林裂殖壺菌 (mangrovei )、微小裂殖壺菌（minutum)、八孢裂殖壺菌（octosporum));吾肯氏壺菌屬 (Ulkenia)(物種包括變形吾肯氏壺菌(amoeboidea)、克格倫吾肯氏壺菌(kerguelensis)、 小吾肯氏壺菌（mi nuta)、深海吾肯氏壺菌（profunda)、福射吾肯氏壺菌（radiate)、 sailens、沙氏吾肯氏壺菌（sarkariana)、schizochytrops、威瑟氏吾肯氏壺菌 (visurgensis)、約肯氏吾肯氏壺菌（yorkensis));Aurantiacochytrium 屬； OblongichytriumMNSicyoidochytiumjgNParientichytriumjgNBotryochytriumM 組合。在吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)內所描述的物種會視為裂殖壺菌屬的成員。在另一個實施 方案中，微生物細胞來自破囊壺菌目。在又一個實施方案中，微生物細胞來自破囊壺菌屬。 在又一個實施方案中，微生物細胞來自裂殖壺菌屬。在又一個實施方案中，微生物細胞選自 破囊壺菌屬、裂殖壺菌屬，或其混合物。
[0033] 在一個實施方案中，該方法包括裂解包含微生物油的微生物細胞以形成裂解細胞 組合物。術語"裂解(lyse)"及"裂解(lysing)"意指使微生物細胞的壁和/或膜破裂的方法。 在一個實施方案中，通過至少一種選自下組的處理來裂解微生物細胞:機械處理、化學處 理、酶處理、物理處理，及其組合。在另一個實施方案中，所述方法包括裂解包含微生物油的 微生物細胞以形成裂解細胞組合物，其中所述裂解選自機械處理、化學處理、酶處理、物理 處理，及其組合。
[0034] 在一些實施方案中，在裂解細胞之前，可以對所述細胞進行洗滌和/或巴氏消毒 (pasteurize)。在一些實施方案中，洗滌細胞包括使用水溶液(例如水)來去除任何細胞外 的水溶性或水分散性化合物。在一些實施方案中，可以將細胞洗滌一次、二次、三次，或更多 次。在一些實施方案中，對細胞進行巴氏消毒包括加熱該細胞以使任何不合意的酶(例如任 何可能降解該油或降低PUFA產量/收率的酶)失活。在一些實施方案中，可以洗滌該細胞然 后在裂解該細胞之前對其進行巴氏消毒。在一些實施方案中，要裂解的細胞包含于發酵液 中。
[0035]在一些實施方案中，所述方法包括裂解包含微生物油的未洗滌的微生物細胞以形 成裂解細胞組合物。在一些實施方案中，用例如水首先洗滌含有包含微生物油的微生物細 胞的發酵液，然后裂解該細胞以形成裂解細胞組合物。在其他實施方案中，所述方法包括裂 解發酵液中未洗滌的細胞以形成裂解細胞組合物。
[0036]機械處理包括但不限于均質化、超聲、冷壓、磨制，及其組合。在一些實施方案中， 所述方法包括通過均質化來裂解細胞。在一些實施方案中，所述方法包括用均質機來裂解 細胞。
[0037] 均質化包括但不限于使用下列設備的方法：弗氏細胞壓碎器（French cellpress)、超聲破碎器、均質機，微流化器(microfluidizer)、球磨機、棒磨機、爍磨機 (pebble mill)、珠磨機（bead mill)、高壓碾磨輯、立軸式沖擊機（verticalshaft impactor)、工業共混機、高剪切混合機、槳式混合機、polytron均質機、工業均質機(例如 Niro Soavi VHP均質機及APV Rannie和APV Gaulin均質機）、工業高剪切流體處理器(high shear fluid processors)(例如微流體高剪切流體處理器）、細胞裂解/珠磨均質機(例如 Dyno-Mill和Buhler)，及其組合。在一些實施方案中，細胞流經任選加熱的均質機。在一些 實施方案中，合適的均質化可以包括1次至3次通過處于高壓和/或低壓的均質機。
[0038] 在一些實施方案中，均質化過程中的壓強為150巴（bar)至1，400巴；150巴至1，200 巴；150巴至900巴；150巴至300巴；300巴至1,400巴；300巴至1,200巴；300巴至900巴；400巴 至800巴；500巴至700巴；或600巴。在一些實施方案中，均質化過程中的壓強為2，000psi至 20,000卩8；[;2,000卩8；[至18,000卩8；[;2,000卩8；[至16,000卩8；[;2,000卩8；[至14,000卩8；[;2， OOOpsi至12，000psi;2，000psi至10，000psi;2，OOOpsi至8，000psi;2，000psi至6，000psi; 2,000卩8；[至4,000卩8；[;4,000卩8；[至20,000卩8；[;4,000卩8；[至18,000卩8；[;4,000卩8；[至16， OOOpsi;4，000psi至14,000psi;4，000psi至12，000psi;4，000psi至10，000psi;4，000psi至 8，000psi;4，000psi至6，000psi;6，000psi至20，000psi;6，000psi至18，000psi;6，000psi 至16，OOOpsi;6，OOOpsi至14，OOOpsi;6，OOOpsi至12，OOOpsi;6，OOOpsi至10，OOOpsi;6， OOOpsi至8，000psi;8，000psi至20，000psi;8，000psi至18，000psi;8，000psi至16，000psi; 8，OOOpsi至14，OOOpsi;8，OOOpsi至12，OOOpsi;8，OOOpsi至10，OOOpsi;10，OOOpsi至20， OOOpsi;10,OOOpsi至18,OOOpsi;10,OOOpsi至16,OOOpsi;10,OOOpsi至14,OOOpsi;10， OOOpsi至12，000psi;12,OOOpsi至20,OOOpsi;12,OOOpsi至18,OOOpsi;12,OOOpsi至16， OOOpsi; 12,OOOpsi至14,OOOpsi;14,OOOpsi至20,OOOpsi;14,OOOpsi至18,OOOpsi; 14， OOOpsi 至 16,000?8丨；16,000?8丨至20,000?8丨；16,000?3丨至18,000?8丨 ；或18,000?8丨至20， OOOpsi 0
[0039]在一些實施方案中，在均質化前將微生物細胞在高剪切混合機中混合。在一些實 施方案中，所述高剪切混合機以如下范圍的轉速操作：至少5，OOOrpm;至少7，500rpm;至少 10，OOOrpm;至少12，500rpm;至少15，OOOrpm; 5，OOOrpm至15，OOOrpm; 5，OOOrpm至12， 500rpm;5，000rpm至10，000rpm;5，000rpm至7，500rpm;7，500rpm至15，000rpm;7，500rpm至 12，500rpm;7，500rpm至10，000rpm;10，000rpm至15，000rpm;10，000rpm至12，500rpm;或12， 500rpm至15，OOOrpm。
[0040] 物理處理包括但不限于:加熱，其包括但不限于，電阻式(resistive)、對流、蒸汽、 流體浴、太陽能，及其組合。在一些實施方案中，在釜中加熱細胞，所述釜在其壁之內/之上 具有電阻線圈。在一些實施方案中，在液體浴中加熱細胞，所述液體浴具有穿過其間的管 子。
[0041] 化學處理包括但不限于：提高細胞的pH;降低細胞的pH;使細胞接觸化學品；及其 組合。
[0042] 在一些實施方案中，通過提高細胞的pH來裂解細胞。在一些實施方案中，通過添加 堿來提高pH。堿包括但不限于氫氧化物（例如1^0!1、似0!1、1(0!1工&(0!1)2，及其組合）、碳酸鹽 類（例如，Na 2C03，K2C03，MgC03，及其組合）、碳酸氫鹽類（例如，LiHC0 3，NaHC03，KHC03，及其組 合），及其組合。堿可以是固體形式(例如晶體，顆粒，與小丸）；液體形式(例如水溶液）；及其 組合。
[0043] 在一些實施方案中，所述堿具有1至12、1至10、1至8、1至6、1至5、2至12、2至10、2至 8、2至6、2至5、3至10、3至6、3至5、4至10、4至8、4至6、5至10、或5至8的pKb。本文所用的術語 "pK b"意指堿的堿締合常數(Kb)的負對數。Kb意指堿在水中的離子化的平衡常數，其中：
[0044]
[0045] 在一些實施方案中，pH選自約8或以上;約9或以上；約10或以上;約11或以上；以及 約12或以上。在其他實施方案中，pH選自：7至13;7至12;7至11;7至10 ;7至9;8至13;8至12;8 至11;8至10 ;8至9;9至12;9至11;9至10;10至12;以及10至11。
[0046] 在一些實施方案中，細胞的pH可以通過氯堿法來提升。在一些實施方案中，對含氯 化鈉和細胞的發酵液進行電解，其導致形成氫氧化鈉，這使該細胞的pH提高。在一些實施方 案中，發酵液包含氯化鈣或氯化鉀代替氯化鈉，或是除氯化鈉之外還有氯化鈣或氯化鉀，并 且電解分別導致形成氫氧化鈣或氫氧化鉀，由此提高該細胞的pH。
[0047] 在一些實施方案中，通過降低細胞的pH來裂解細胞。在一些實施方案中，通過添加 酸來降低pH。酸包括但不限于:硫酸;磷酸;鹽酸;氫溴酸;氫碘酸;次氯酸;亞氯酸;氯酸;高 氯酸;氟硫酸;硝酸;氟銻酸;氟硼酸;六氟磷酸;鉻酸;硼酸；乙酸;檸檬酸；甲酸;及其組合。 在一些實施方案中，pH選自約7或更低;約6.5或更低;約6或更低;約5.5或更低;約5或更低； 約4.5或更低；約4或更低；約3.5或更低；約3或更低；約2.5或更低；約2或更低；約1.5或更 低；約1或更低;和約〇 . 5或更低。在其他實施方案中，pH選自約0.5至約7;約0.5至約6.5;約 0.5至約6;約0.5至約5.5;約0.5至約5;約0.5至約4.5;約0.5至約4;約0.5至約3.5;約0.5至 約3;約0.5至約2.5;約0.5至約2;約0.5至約1.5;約0.5至約1;約1至約7;約1至約6.5;約1至 約6;約1至約5.5;約1至約5;約1至約4.5;約1至約4;約1至約3.5;約1至約3;約1至約2.5;約 1至約2;約1至約1.5;約1.5至約7;約1.5至約6.5;約1.5至約6;約1.5至約5.5;約1.5至約5; 約1.5至約4.5;約1.5至約4;約1.5至約3.5;約1.5至約3;約1.5至約2.5;約1.5至約2;約2至 約7;約2至約6.5;約2至約6;約2至約5.5;約2至約5;約2至約4.5;約2至約4;約2至約3.5;約 2至約3;約2至約2.5;約2.5至約7;約2.5至約6.5;約2.5至約6;約2.5至約5.5;約2.5至約5; 約2.5至約4.5;約2.5至約4;約2.5至約3.5;約2.5至約3;約3至約7;約3至約6.5;約3至約6; 約3至約5.5;約3至約5;約3至約4.5;約3至約4;約3至約3.5;約3.5至約7;約3.5至約6.5;約 3.5至約6;約3.5至約5.5;約3.5至約5;約3.5至約4.5;約3.5至約4;約4至約7;約4至約6.5; 約4至約6;約4至約5.5;約4至約5;約4至約4.5;約4.5至約7;約4.5至約6.5;約4.5至約6;約 4.5至約5.5;約4.5至約5;約5至約7;約5至約6.5;約5至約6;約5至約5.5;約5.5至約7;約 5.5至約6.5;約5.5至約6;約6至約7;約6至約6.5;和約6.5至約7。
[0048] 在一些實施方案中，添加如下量的酸來降低pH:按重量（或體積）計細胞培養液 (cell broth)的約2%至約10%，約2%至約9%，約2%至約8%，約2%至約7%，約2%至約 6%，約3%至約6%，約4%至約6%，約5%至約6%，約2%至約5%，約2%至約4%，約2%至 約3%，約3%至約5%，約3%至約4%，或約4%至約5%。
[0049] 酶處理意指使細胞接觸一種或多種酶。酶包括但不限于：蛋白酶、纖維素酶、半纖 維素酶、殼多糖酶、果膠酶，及其組合。蛋白酶的非限制性實例包括絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋 白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、Alacase，及其組合。 纖維素酶的非限制性實例包括蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、淀粉 酶、溶菌酶、神經氨酸酶、半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、透明質酸酶、普魯蘭 酶（pul lulanase)、葡糖腦苷脂酶、半乳糖基神經酰胺酶、乙酰基半乳糖胺酶 (&06丨7]^3]^〇1：083111；[11丨(^86)、巖藻糖苷酶、己糖胺酶、艾杜糖醛酸糖苷酶（丨(1111'011丨(1386)、 麥芽糖酶-葡糖淀粉酶，及其組合。殼多糖酶的非限制性實例包括殼三糖苷酶 (chitotriosidase)。果膠酶(pectinase)的非限制性實例包括果膠裂合酶(pectolyase)、 Pectozyme、聚半乳糖醛酸酶，及其組合。在一些實施方案中，一些酶通過加熱來活化。在一 些實施方案中，裂解不包括酶的使用。
[0050] 如本文所用的，"裂解細胞組合物"意指包含一個或多個裂解的細胞(包括細胞碎 片和細胞的其他內容物）、與微生物油(來自所述裂解的細胞)和任選的培養液(其含有液體 (如水）、營養物、和微生物細胞)組合的組合物。在一些實施方案中，微生物細胞包含于含水 的發酵液或培養基中。在一些實施方案中，裂解細胞組合物意指這樣的組合物，其包含一個 或多個裂解的細胞、細胞碎片、微生物油、該細胞的天然內容物，以及來自發酵液的水組份。 在一個實施方案中，該裂解細胞組合物包含液體、細胞碎片以及微生物油。在一些實施方案 中，裂解細胞組合物呈水包油乳液形式，其包含連續水相和分散油相的混合物。在一些實施 方案中，分散油相以按重量(或體積)計乳化的裂解細胞組合物的約1 %至約60 % ;約1 %至 約50% ;約1 %至約40% ;約1 %至約30% ;約1 %至約20%;約5%至約60% ;約5%至約50% ; 約5%至約40% ;約5 %至約30% ;約5%至約20% ;約10 %至約60% ;約10%至約50% ;約 10%至約40% ;約20%至約60% ;20%至50% ;20%至約40% ;約30%至約60%;約30%至約 50% ;或約40%至約60%的濃度存在。
[0051] 在一些實施方案中，裂解微生物細胞導致自細胞或細胞生物質中的內源性材料形 成乳液，所述內源性材料包括但不限于蛋白質、磷脂、碳水化合物，及其組合。雖然不被任何 的具體理論的束縛，據信本發明的方法能將乳化的裂解細胞組合物破碎或去乳化，允許微 生物油從該裂解細胞組合物分離。術語"乳液"和"乳化的"意指兩個或更多個不互溶相或層 的混合物，其中一個相或層分散于另一個相或層中。術語"破碎(break)"、"破碎(break-up)"、"去乳化（demulsify)"、"去乳化作用（demulsification)"、"去乳化 (demulsifying)"，以及"破碎(breaking)"意指分離乳液的不互溶相或層的方法。例如，對 乳化的裂解細胞組合物進行破碎或去乳化是意指這樣的方法，通過該方法，乳化的裂解細 胞組合物從具有一個或多個相或層的乳液轉變為具有兩個或更多個相或層的組合物。例 如，在一些實施方案中，本發明的方法使乳化的裂解細胞組合物從單相破碎成二相或更多 相。在一些實施方案中，所述二相或更多相包括油相和水相。在一些實施方案中，本發明的 方法使乳化的裂解細胞組合物破碎成至少三相。在一些實施方案中，所述三相選自油相、水 相，以及固相。在一些實施方案中，所述相選自油相、乳化相、水相，以及固相。
[0052]在一些實施方案中，去乳化過程中形成的油珠的平均粒度選自：5微米至50微米;5 微米至45微米;5微米至40微米;5微米至35微米;5微米至30微米;5微米至25微米;5微米至 20微米;5微米至15微米；10微米至50微米；10微米至45微米；10微米至40微米；10微米至35 微米；10微米至30微米；10微米至25微米；10微米至20微米；10微米至15微米；15微米至50微 米；15微米至45微米；15微米至40微米；15微米至35微米；15微米至30微米；15微米至25微 米；15微米至20微米；20微米至50微米；20微米至45微米;20微米至40微米；20微米至35微 米；20微米至30微米；20微米至25微米；25微米至50微米;25微米至45微米；25微米至40微 米；25微米至35微米；25微米至30微米；30微米至50微米;30微米至45微米；30微米至40微 米;30微米至35微米；35微米至50微米；35微米至45微米;35微米至40微米;40微米至50微 米;40微米至45微米;和45微米至50微米。在另一個實施方案中，去乳化過程中形成的油珠 的平均粒度選自：至少10微米、至少15微米、至少20微米、至少25微米、至少30微米、至少35 微米、及至少40微米或更大。在另一個實施方案中，去乳化過程中形成的油珠的平均粒度選 自：至少10微米、至少15微米、至少20微米、及至少25微米。在一些實施方案中，平均粒度可 以使用例如Beckman Coulter LS 13 320粒度分析儀(Beckman Coulter,Brea,CA)來測量。 在一些實施方案中，平均粒度可以使用例如Malvern MS2000粒度分析儀（Malvern Instruments Ltd. Worcestershire,United Kingdom)來測量。
[0053] 在一些實施方案中，添加乳化劑至裂解細胞組合物。在一些實施方案中，所述乳化 劑取代由內源性材料形成的乳液，因為PUFA具有比內源性材料(例如蛋白質、磷脂，以及碳 水化合物)更強的乳化劑親和性。在一些實施方案中，由該乳化劑形成的乳液比內源性材料 形成的乳液更加穩定。在一些實施方案中，由該乳化劑形成的乳液比內源性材料形成的乳 液更容易使用本文的方法來進行去乳化。
[0054] 在一些實施方案中，所述乳化劑是去污劑。在一些實施方案中，所述乳化劑為表面 活性劑。在一些實施方案中，在裂解之前、過程中，或之后添加乳化劑。在一個實施方案中， 在裂解之后添加乳化劑。在一些實施方案中，將乳化劑添加至裂解細胞組合物。本文中所用 的術語"乳化劑"意指使乳液穩定的物質。乳化劑選自離子性乳化劑、非離子性乳化劑，及其 組合。在一些實施方案中，所述乳化劑是離子性乳化劑。
[0055] 在一些實施方案中，離子性乳化劑選自陰離子乳化劑、陽離子乳化劑，及其組合。 在一些實施方案中，陰離子乳化劑可以是陰離子硫酸鹽乳化劑，例如烷基硫酸鹽(例如月桂 基硫酸銨、月桂基硫酸鈉(SLS)/十二烷基硫酸鈉(SDS)，及其組合），烷基醚硫酸鹽(例如月 桂醇聚醚（laureth)硫酸鈉/月桂基醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉，及其組合），及其組合； 陰離子磺酸鹽乳化劑，例如多庫酯鹽(docusate)(例如磺基琥珀酸二辛酯鈉、磺酸鹽氟表面 活性劑(例如全氟辛烷磺酸鹽和全氟丁烷磺酸鹽）、烷基苯磺酸鹽，及其組合）；陰離子磷酸 鹽乳化劑(例如烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽，及其組合）；陰離子羧酸鹽乳化劑(例如 烷基羧酸鹽(如硬脂酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉 (sodiumlauroyl sarcosinate)、羧酸鹽氟表面 活性劑(例如全氟壬酸鹽、全氟辛酸鹽，及其組合）），及其組合）；及其組合。在一些實施方案 中，乳化劑是陰離子乳化劑。在一個實施方案中，陰離子乳化劑選自陰離子硫酸鹽乳化劑、 陰離子磺酸鹽乳化劑、陰離子磷酸鹽乳化劑、陰離子羧酸鹽乳化劑，及其組合。在另一個實 施方案中，陰離子乳化劑是陰離子硫酸鹽乳化劑。在又一個實施方案中，陰離子硫酸鹽乳化 劑選自月桂基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、月桂醇聚醚硫酸鈉、月桂基醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚 醚硫酸鈉，及其組合。在又一個實施方案中，陰離子硫酸鹽乳化劑是十二烷基硫酸鈉。
[0056]在一些實施方案中，陽離子乳化劑可以是pH依賴性伯胺;pH依賴性仲胺;pH依賴性 叔胺;奧替尼啶二鹽酸鹽(octenidine dihydrochloride);永久性帶電荷季銨陽離子(例如 烷基三甲基銨鹽（例如鯨錯基三甲基溴化銨（〇6七}41：1'；[11161：117131]11]1011；[11111131'0111丨(16)((7^13)/ 十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethyl ammonium bromide)、鯨錯基三甲基氯化銨 ((^△0，及其組合），鯨錯基氯化吡啶化714(1；[11；[11111)(0?0、苯扎氯銨(>6112311^011；[11111 chloride，BAC)、節索氯銨（benzethonium chloride,ΒΖΤ)、5_溴_5_硝基-1，3_二噁燒、二甲 基雙十八烷基氯化銨、雙十八烷基二甲基溴化銨(D0DAB)，及其組合）；及其組合。
[0057]在一些實施方案中，乳化劑的分子量選自500克/摩爾或更低、450克/摩爾或更低、 400克/摩爾或更低、350克/摩爾或更低、和300克/摩爾或更低。在進一步的實施方案中，乳 化劑的分子量選自250克/摩爾至500克/摩爾、250克/摩爾至450克/摩爾、250克/摩爾至400 克/摩爾、250克/摩爾至350克/摩爾、250克/摩爾至300克/摩爾、300克/摩爾至500克/摩爾、 300克/摩爾至450克/摩爾、300克/摩爾至400克/摩爾、300克/摩爾至350克/摩爾、350克/摩 爾至500克/摩爾、350克/摩爾至450克/摩爾、350克/摩爾至400克/摩爾、400克/摩爾至500 克/摩爾、400克/摩爾至450克/摩爾、和450克/摩爾至500克/摩爾。例如，SDS的分子量是288 克/摩爾，而CTAB的分子量是364克/摩爾。在又一個實施方案中，乳化劑的分子量選自250 克/摩爾至450克/摩爾、250克/摩爾至400克/摩爾、250克/摩爾至350克/摩爾，以及250克/ 摩爾至300克/摩爾。
[0058] 在一些實施方案中，乳化劑作為粉末添加。在一些實施方案中，乳化劑在溶液中添 加，所述溶液具有如下量的乳化劑濃度:5%至50%、5%至45%、5%至40%、5%至35%、5% 至 30%、10%至 50%、10%至 45%、10%至 40%、10%至 35%、10%至 30%、15%至 50%、15% 至 45%、15%至40%、15%至35%、15%至30%、20%至50%、20%至45%、20%至40%、20% 至 35%、20%至30%、25%至50%、25%至45%、25%至40%、25%至35%、25%至30%、30% 至 50%、30%至45%、30%至40%、和30%至35%。
[0059] 在一些實施方案中，乳化劑(例如以粉末形式或于溶液中）以選自如下的量添加 ： 按重量(或體積)計發酵液或裂解細胞組合物的〇 .2%至10%、0.2%至9.5%、0.2%至9%、 0.2%至8.5%、0.2%至8%、0.2%至7.5%、0.2%至7%、0.2%至6.5%、0.2%至6%、0.2% 至5.5%、0.2%至5%、0.2%至4.5%、0.2%至4%、0.2%至3.5%、0.2%至3%、0.2%至 2.5%、0.2%至2%、0.2%至1.5%、0.2%至1%、0.2%至0.5%、0.5%至10%、0.5%至 9.5%、0.5%至9%、0.5%至8.5%、0.5%至8%、0.5%至7.5%、0.5%至7%、0.5%至 6.5%、0.5%至6%、0.5%至5.5%、0.5%至5%、0.5%至4.5%、0.5%至4%、0.5%至 3.5%、0.5%至3%、0.5%至2.5%、0.5%至2%、0.5%至1.5%、0.5%至1%、1%至10%、 1% 至9.5%、1% 至9%、1% 至8.5%、1% 至8%、1% 至 7.5%、1% 至7%、1% 至6.5%、1% 至 6%、1%至5.5%、1%至5%、1%至4.5%、1%至4%、1%至3.5%、1%至3%、1%至2.5%、 1 %至2%、1 %至 1.5%、1.5%至 10%、1.5%至 9.5%、1.5% 至 9%、1.5%至 8.5%、1.5% 至 8%、1.5%至 7.5%、1.5%至7 %、1.5%至6.5%、1.5%至6%、1.5%至 5.5%、1.5%至5 %、 1.5%至4.5%、1.5%至4%、1.5%至3.5%、1.5%至3%、1.5%至2.5%、1.5%至2%、2%至 10%、2%至9.5%、2%至9%、2%至8.5%、2%至8%、2%至7.5%、2%至7%、2%至6.5%、 2% 至6 %、2% 至5.5%、2% 至5 %、2% 至4.5%、2% 至4%、2% 至3.5%、2% 至3 %、2% 至 2.5%、2.5% 至 10 %、2.5% 至9.5%、2.5% 至9 %、2.5% 至8.5%、2.5% 至8 %、2.5% 至 7.5%、2.5% 至7 %、2.5% 至6.5%、2.5% 至6 %、2.5% 至5.5%、2.5% 至5 %、2.5% 至 4.5%、2.5%至4%、2.5%至3.5%、2.5%至3%、3%至10%、3%至9.5%、3%至9%、3%至 8.5%、3%至8%、3%至7.5%、3%至7%、3%至6.5%、3%至6%、3%至5.5%、3%至5%、 3%至4.5%、3%至4%、和3%至3.5%。在另一個實施方案中，乳化劑(例如以粉末形式或于 溶液中）以選自如下的量添加:按重量(或體積)計選自發酵液或裂解細胞組合物的〇. 2 %至 5%、0.5%至5%、1 %至5%、1.5%至5%、2%至5%、2.5%至5%、和3%至5%。在又一個實 施方案中，乳化劑以如下的量添加:按重量計是裂解細胞組合物的〇. 2%至10%。
[0060]在一些實施方案中，乳化劑降低發酵液或裂解細胞組合物的界面張力（即表面張 力）。如本文所使用的，術語"界面張力"或"表面張力"意指作用于二相之間的界面處一米長 的假想線（imaginary line one meter in length)上的力。在一些實施方案中，由乳化劑 所形成的乳液的界面張力比由內源性材料所形成的乳液更低。在一些實施方案中，界面張 力可以按達因/厘米(dynes/cm)來測量。
[0061 ]在一些實施方案中，乳化劑增加發酵液或裂解細胞組合物的ζ電位 (zetapotential)絕對值（即提高正ζ電位或是降低負ζ電位）。在一些實施方案中，添加陰離 子乳化劑能導致發酵液或裂解細胞組合物的ζ電位下移（即降低正ζ電位或是提高負ζ電 位）。在一些實施方案中，添加陽離子乳化劑能導致發酵液或裂解細胞組合物的ζ電位上移 (即提高正ζ電位或是降低負ζ電位）。如本文所用的，術語"ζ電位"意指乳液中粒子之間的電 動電位。在一些實施方案中，ζ電位可以按mV來測量。在一些實施方案中，由乳化劑所形成的 乳液的ζ電位的絕對值比內源性材料形成的乳液更高。
[0062] 在一些實施方案中，添加離子性乳化劑產生水包油乳液。在一些實施方案中，水包 油乳液包括但不限于，油、水、以及離子性乳化劑。
[0063] 在一些實施方案中，所述方法還包括提升裂解細胞組合物的pH。在一些實施方案 中，通過向裂解細胞組合物添加堿來提升pH。可以用于將裂解細胞組合物去乳化的堿與上 文所述的那些相同。在一些實施方案中，pH選自約8或以上;約9或以上；約10或以上；約11或 以上；以及約12或以上。在其他實施方案中，所述pH選自如下的pH:7至13;7至12;7至11;7至 10 ;7至9;8至13;8至12;8至11;8至10 ;8至9;9至12;9至11;9至10;10至12;和10至11。
[0064] 在一些實施方案中，所述方法還包括向裂解細胞組合物添加鹽。術語"鹽"意指離 子性化合物，其通過用金屬(例如，堿金屬、堿土金屬，及過渡金屬)或帶正電荷的化合物(例 如NH4+)代替來自酸的氫離子而形成。在一些實施方案中，鹽類可以是堿金屬鹽、堿土金屬 鹽、硫酸鹽，或其組合。鹽中存在的帶負電荷的離子的種類包括但不限于：鹵化物、硫酸根、 硫酸氫根、亞硫酸根，磷酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、碳酸根、碳酸氫根，及其組合。在一些 實施方案中，鹽選自：氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、氯化鈣、硫酸鉀、硫酸鎂、谷氨酸一鈉、硫酸 銨、氯化鉀、氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鋁、乙酸銨，及其組合。在一些實施方案中，鹽不包括NaOH。 鹽可以作為固體(例如以結晶、無定形的、團狀的(pelletized)，和/或顆粒形式)和/或含例 如水的溶液(例如稀釋溶液、飽和溶液，或過飽和溶液)添加。
[0065] 在一些實施方案中，以如下量添加鹽:5g/l至25g/l、5g/l至10g/l、10g/l至15g/l、 15g/l至20g/l、20g/l至25g/l、或10g/l至20g/l。
[0066] 在其他實施方案中，鹽以如下量添加至裂解細胞組合物:按重量(或體積)計是裂 解細胞組合物的20 %或更少，15 %或更少，10 %或更少，7.5 %或更少，5 %或更少，或2 %或 更少。在一些實施方案中，鹽以如下量添加至該裂解細胞組合物:按重量(或體積)計細胞裂 解組合物（例如總培養液重量(或體積））的約0.05 %至約20 %、約0.1 %至約20 %、約0.1 % 至約15 %、約0.1 %至約10 %、約0.5%至約20%、約0.5 %至約15 %、約0.5%至約10 %、約 0.5%至約5%、約0.5%至約4%、約0.5%至約3%、約0.5%至約2.5%、約0.5%至約2%、約 0.5%至約1.5%、約0.5%至約1 %、約1 %至約20%、約1 %至約15%、約1 %至約10%、約1 % 至約5%、約1 %至約4%、1 %至約3%、約1 %至約2.5%、約1 %至約2%、約1 %至約1.5%、約 1.5%至約5%、約1.5%至約4%、約1.5%至約3%、約1.5%至約2.5%、約1.5%至約2%、約 2%至20%、約2%至約15%、約2%至約10%、約2%至約5%、約2%至約4%、約2%至約3%、 約2 %至約2.5%、約2.5%至約5%、約2.5 %至約4%、約2.5 %至約3%、約3%至約5 %、約 3 %至約4%、約4%至約5 %、約5 %至約20 %、約5 %至約15 %、約5 %至約10 %、約10 %至約 20 %、約10 %至約15 %、或約15 %至約20 %。例如，當裂解細胞組合物重量為1，000kg時，以 按重量(或體積)計0.5%至20%的量添加的鹽需要添加5kg至200kg的鹽至該裂解細胞組合 物。在一些實施方案中，鹽以如下量添加至該裂解細胞組合物:按重量(或體積)計所述裂解 細胞組合物的約〇 . 05 %至約20 %、按重量（或體積）約0.1 %至約20 %、按重量（或體積）約 0.5 %至約15 %，或按重量(或體積)約2 %至約10 %。
[0067] 在一些實施方案中，所述方法還包括在裂解細胞之前、過程中或之后進行加熱。在 一些實施方案中，所述加熱在添加乳化劑之前、添加乳化劑過程中、或添加乳化劑之后、添 加鹽之前、添加鹽過程中、或添加鹽之后、或其組合來進行。在一些實施方案中，所述方法包 括將裂解細胞組合物和/或細胞加熱到至少l〇°C、至少20°C、至少25°C、至少30°C、至少35 。(：、至少40 °C、至少45 °C、至少50 °C、至少55 °C、至少60°C、至少65 °C、至少70°C、至少75 °C、至 少80 °C、至少85 °C、至少90 °C、至少95 °C、或至少100 °C。在其他實施方案中，所述方法包括將 裂解細胞組合物和/或細胞加熱到約10 °C至約100 °C、約10 °C至約90 °C、約10°C至約80 °C、約 10°C至約70°C、約20°C至約 100 °C、約20°C °C至約90 °C、約20°C 至約80°C、約20°C至約70 °C、 約 30 °C 至約 100 °C、約 30 °C 至約 90 °C、約 30 °C 至約 80 °C、約 30 °C 至約 70 °C、約 40 °C 至約 100 °C、 約40 °C至約90°C、約40°C至約80 °C、約50°C 至約 100 °C、約50°C 至約90°C、約50°C至約80 °C、 約 50 °C 至約 70 °C、約 60 °C 至約 100 °C、約 60 °C 至約 90 °C、約 60 °C 至約 80 °C、約 70 °C 至約 100 °C、 約70 °C至約90°C、約80°C至約100°C、約80°C至約90 °C、或約90°C至約100°C °C。在進一步的 實施方案中，所述方法包括將裂解細胞組合物加熱到約70 °C至約100 °C、約70°C至約90°C、 約80 °C至約100 °C、約80 °C至約90 °C、或約90°C至約100°C。在更進一步的實施方案中，所述 方法包括將裂解細胞組合物加熱到至少70°C、至少75°C、至少80°C、至少85°C、至少90°C、至 少95°C、或至少100°C。
[0068] 在一些實施方案中，將裂解細胞組合物加熱足夠的時間以將所述裂解細胞組合物 去乳化。
[0069] 在一些實施方案中，細胞和/或裂解細胞組合物可以在密閉系統中或具有蒸發器 的系統中進行加熱。在一些實施方案中，細胞和/或裂解細胞組合物可以在具有蒸發器的系 統中進行加熱，從而通過蒸發來去除該細胞和/或該裂解細胞組合物中存在的一部分水。在 一些實施方案中，方法包括在具有蒸發器的系統中加熱細胞和/或裂解細胞組合物，以去除 按重量(或體積)計多至1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的該 細胞和/或裂解細胞組合物中存在的水。在一些實施方案中，方法包括在具有蒸發器的系統 中加熱細胞和/或裂解細胞組合物，以去除按重量(或體積)計1 %至50%、1 %至45%、1 %至 40%、1%至35%、1%至30%、1%至25%、1%至20%、1%至15%、1%至10%、1%至5%、5% 至 50%、5%至45%、5% 至40%、5% 至 35%、5% 至 30%、5% 至 25%、5% 至 20%、5% 至 15%、 5%至10%、10% 至 50%、10%至 45 %、10% 至 40%、10%至 35 %、10% 至 30%、10%至 25%、 10%至 20%、10%至 15%、15%至 50%、15%至 45%、15%至 40%、15%至 35%、15%至 30%、 15% 至 25%、15%至20%、20%至50%、20%至45%、20%至40%、20%至35%、20%至30%、 20% 至 25%、25%至50%、25%至45%、25%至40%、25%至35%、25%至30%、30%至50%、 30% 至 45%、30%至40%、30%至35%、35%至50%、35%至45%、35%至40%、40%至50%、 40%至45%、或45%至50%的水。
[0070] 在一些實施方案中，所述方法還包括（i)在裂解細胞之前、過程中、或之后攪拌； (i)在將裂解細胞組合物去乳化之前、過程中、或之后攪拌；或其組合。術語"攪拌 (agitating)"和"攪拌(agitation)"意指通過施加力來影響細胞和/或裂解細胞組合物中 的運動的方法。在一些實施方案中，所述方法包括通過攪動、混合、共混、振蕩、振動，或其組 合來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物。
[0071] 在一些實施方案中，攪拌器是分散型攪拌器，其將堿和/或鹽分散于所述細胞和/ 或裂解細胞組成物之中。在一些實施方案中，攪拌器具有加熱板。在一些實施方案中，攪拌 器具有供攪動用的外罩。在一些實施方案中，攪拌器具有一個或多個葉輪。如本文使用的， "葉輪"意指這樣的裝置，其經安排以在旋轉時使細胞組合物或裂解細胞組合物運動。適合 供本發明使用的葉輪包括直葉片葉輪、拉什頓葉片葉輪(Rushton blade impeller)、軸向 流式葉輪、徑向流式葉輪、凹面葉片盤葉輪、高效葉輪、螺旋槳(propellers)、槳(paddles)、 禍輪(turbines)，及其組合。
[0072] 在一些實施方案中，本發明的方法包括分別以0.1hp/l，000gal至10hp/l，000gal、 0.5hp/l，000gal至8hp/l，000gal、lhp/l，000gal至6hp/l，000gal、或2hp/l，000gal至5hp/ 1，000gal的組合物，來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物。在一些實施方案中，所述方法包括 以0.1hp/1000gal至10hp/1000gal的組合物來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物。
[0073]在一些實施方案中，本發明包括以如下轉速進行攪拌：10rpm或更低、20rpm或更 低、50rpm或更低、lOOrprn或更低、150rpm或更低、200rpm或更低、250rpm或更低、300rpm或更 低、350rpm 或更低、400rpm 或更低、10rpm 至 400rpm、10rpm 至 350rpm、10rpm 至 300rpm、10rpm 至250rpm、lOrpm至200rpm、lOrpm至150rpm、lOrpm至lOOrprn、lOrpm至50rpm、lOrpm至20rpm、 20rpm至400rpm、20rpm至350rpm、20rpm至300rpm、20rpm至250rpm、20rpm至200rpm、20rpm至 150rpm、20rpm至lOOrprn、20rpm至50rpm、50rpm至400rpm、50rpm至350rpm、50rpm至300rpm、 50rpm至250rpm、50rpm至200rpm、50rpm至150rpm、50rpm至1OOrpm、1OOrpm至400rpm、lOOrpm 至350rpm、lOOrpm至300rpm、lOOrpm至250rpm、lOOrpm至200rpm、lOOrpm至150rpm、150rpm至 400rpm、150rpm至350rpm、150rpm至300rpm、150rpm至250rpm、150rpm至200rpm、200rpm至 400rpm、200rpm至350rpm、200rpm至300rpm、200rpm至250rpm、250rpm至400rpm、250rpm至 350rpm、250rpm 至 300rpm、300rpm 至400rpm、300rpm 至 350rpm、或 350rpm 至400rpm。在一些實 施方案中，攪拌以350rpm或更低的轉速進行。
[0074] 在一些實施方案中，所述方法包括用攪拌器來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物，所 述攪拌器具有90英尺/分鐘至1，200英尺/分鐘、200英尺/分鐘至1，000英尺/分鐘、300英尺/ 分鐘至800英尺/分鐘、400英尺/分鐘至700英尺/分鐘、或500英尺/分鐘至600英尺/分鐘的 葉輪尖端速率。在一些實施方案中，所述方法包括用攪拌器來攪拌，所述攪拌器具有200英 尺/分鐘至1000英尺/分鐘的葉輪尖端速率。
[0075] 在一些實施方案中，方法包括使用攪拌器來攪拌細胞和/或裂解細胞組合物，所述 攪拌器具有如下葉輪尖端速率:5厘米/秒至900厘米/秒、5厘米/秒至750厘米/秒、5厘米/秒 至500厘米/秒、5厘米/秒至350厘米/秒、5厘米/秒至300厘米/秒、5厘米/秒至250厘米/秒、5 厘米/秒至200厘米/秒、5厘米/秒至150厘米/秒、5厘米/秒至100厘米/秒、5厘米/秒至50厘 米/秒、5厘米/秒至25厘米/秒、25厘米/秒至900厘米/秒、25厘米/秒至750厘米/秒、25厘米/ 秒至500厘米/秒、25厘米/秒至350厘米/秒、25厘米/秒至300厘米/秒、25厘米/秒至250厘 米/秒、25厘米/秒至200厘米/秒、25厘米/秒至150厘米/秒、25厘米/秒至100厘米/秒、25厘 米/秒至50厘米/秒、50厘米/秒至900厘米/秒、50厘米/秒至750厘米/秒、50厘米/秒至500厘 米/秒、50厘米/秒至350厘米/秒、50厘米/秒至300厘米/秒、50厘米/秒至250厘米/秒、50厘 米/秒至200厘米/秒、50厘米/秒至150厘米/秒、50厘米/秒至100厘米/秒、100厘米/秒至900 厘米/秒、100厘米/秒至750厘米/秒、100厘米/秒至500厘米/秒、100厘米/秒至350厘米/秒、 100厘米/秒至300厘米/秒、100厘米/秒至250厘米/秒、100厘米/秒至200厘米/秒、100厘米/ 秒至150厘米/秒、150厘米/秒至900厘米/秒、150厘米/秒至750厘米/秒、150厘米/秒至500 厘米/秒、150厘米/秒至350厘米/秒、150厘米/秒至300厘米/秒、150厘米/秒至250厘米/秒、 150厘米/秒至200厘米/秒、200厘米/秒至900厘米/秒、200厘米/秒至750厘米/秒、200厘米/ 秒至500厘米/秒、200厘米/秒至350厘米/秒、200厘米/秒至300厘米/秒、200厘米/秒至250 厘米/秒、250厘米/秒至900厘米/秒、250厘米/秒至750厘米/秒、250厘米/秒至500厘米/秒、 250厘米/秒至350厘米/秒、250厘米/秒至300厘米/秒、300厘米/秒至900厘米/秒、300厘米/ 秒至750厘米/秒、300厘米/秒至500厘米/秒、300厘米/秒至350厘米/秒、350厘米/秒至900 厘米/秒、350厘米/秒至850厘米/秒、350厘米/秒至800厘米/秒、350厘米/秒至750厘米/秒、 350厘米/秒至700厘米/秒、350厘米/秒至650厘米/秒、350厘米/秒至600厘米/秒、350厘米/ 秒至550厘米/秒、350厘米/秒至500厘米/秒、350厘米/秒至450厘米/秒、350厘米/秒至400 厘米/秒、400厘米/秒至900厘米/秒、400厘米/秒至850厘米/秒、400厘米/秒至800厘米/秒、 400厘米/秒至750厘米/秒、400厘米/秒至700厘米/秒、400厘米/秒至650厘米/秒、400厘米/ 秒至600厘米/秒、400厘米/秒至550厘米/秒、400厘米/秒至500厘米/秒、400厘米/秒至450 厘米/秒、450厘米/秒至900厘米/秒、450厘米/秒至850厘米/秒、450厘米/秒至800厘米/秒、 450厘米/秒至750厘米/秒、450厘米/秒至700厘米/秒、450厘米/秒至650厘米/秒、450厘米/ 秒至600厘米/秒、450厘米/秒至550厘米/秒、450厘米/秒至500厘米/秒、500厘米/秒至900 厘米/秒、500厘米/秒至850厘米/秒、500厘米/秒至800厘米/秒、500厘米/秒至750厘米/秒、 500厘米/秒至700厘米/秒、500厘米/秒至650厘米/秒、500厘米/秒至600厘米/秒、500厘米/ 秒至550厘米/秒、550厘米/秒至900厘米/秒、550厘米/秒至850厘米/秒、550厘米/秒至800 厘米/秒、550厘米/秒至750厘米/秒、550厘米/秒至700厘米/秒、550厘米/秒至650厘米/秒、 550厘米/秒至600厘米/秒、600厘米/秒至900厘米/秒、600厘米/秒至850厘米/秒、600厘米/ 秒至800厘米/秒、600厘米/秒至750厘米/秒、600厘米/秒至700厘米/秒、600厘米/秒至650 厘米/秒、650厘米/秒至900厘米/秒、650厘米/秒至850厘米/秒、650厘米/秒至800厘米/秒、 650厘米/秒至750厘米/秒、650厘米/秒至700厘米/秒、700厘米/秒至900厘米/秒、700厘米/ 秒至850厘米/秒、700厘米/秒至800厘米/秒、700厘米/秒至750厘米/秒、750厘米/秒至900 厘米/秒、750厘米/秒至850厘米/秒、750厘米/秒至800厘米/秒、800厘米/秒至900厘米/秒、 800厘米/秒至850厘米/秒、或850厘米/秒至900厘米/秒。術語"葉輪尖端速率"，意指當葉輪 環繞其中心軸旋轉時，其最外部分的速率。
[0076] 在一些實施方案中，攪拌（以及任選的如本文所述的額外步驟)是在含有葉輪的容 器中進行的，其中所述葉輪直徑與該容器體積之比是0.1至0.5、0.1至0.4、0.2至0.5、0.2至 0·4、0·3至0.5、或0.3至0.4。
[0077] 在一些實施方案中，攪拌（以及任選的如本文所述的額外步驟)是在含有葉輪的容 器中進行的，其中所述葉輪直徑對該容器內徑之比是至少0.25、至少0.34、至少0.65、0.25 至 0.65、0.25至0.33、0.3至0.6、0.3至0.5、0.3至0.4、0.34至0.65、0.34至0.6、0.34至0.55、 0.37至0.55、0.4至0.65、0.4至0.6、0.4至0.5、或0.42至0.55。
[0078] 在一些實施方案中，攪拌包括將細胞和/或裂解細胞組合物混合從而使該細胞和/ 或裂解細胞組合物處于由如下雷諾數(Reynolds)描述的流動條件下：10至10,000、1，000至 10,000、1，500至10,000、或2,000至10,000。在一些實施方案中，攪拌過程中裂解的細胞乳 液具有2,000或更多、3,000或更多、或5,000或更多、或2,000至10,000、3,000至10,000、或 5,000至10,000的雷諾數。
[0079] 在一些實施方案中，攪拌器皿可以具有2個葉輪。在一些實施方案中，所述葉輪是 拉什頓葉片葉輪。在一些實施方案中，所述葉輪是以至少與最小的葉輪直徑相等的距離彼 此分離。在一些實施方案中，所述葉輪尖端至尖端為30英寸至40英寸、33英寸至37英寸、33 英寸、34英寸、35英寸、36英寸或37英寸。在一些實施方案中，所述攪拌器皿具有至少10,000 升、至少20，000升、至少30，000升、至少40，000升或至少50，000升的容積。在一些實施方案 中，所述攪拌器皿具有90英寸至110英寸、95英寸至105英寸、98英寸、99英寸、100英寸、101 英寸、或102英寸的內徑。在一些實施方案中，第一葉輪位于距攪拌器皿底部15英寸至20英 寸、16英寸至19英寸、或17英寸至18英寸，而第二葉輪位于第一個葉輪之上60英寸至80英 寸、65英寸至75英寸、68英寸、69英寸、70英寸、71英寸、72英寸、73英寸、74英寸、或75英寸。 在一些實施方案中，以至少50rpm、至少60rpm、或至少70rpm攪拌裂解細胞組合物。在一些實 施方案中，以50rpm至70rpm、50rpm至60rpm、或60rpm至70rpm攪拌裂解細胞組合物。
[0080] 在一些實施方案中，所述方法還包括攪拌所述裂解細胞組合物。在一些實施方案 中，攪拌裂解細胞組合物的方法使該裂解細胞組合物去乳化。
[0081] 在一些實施方案中，使裂解細胞組合物經受乳化劑、堿、鹽、熱以及攪拌中的一種 或多種以形成去乳化的裂解細胞組合物。
[0082] 在一些實施方案中，所述方法包括將含有微生物油的未洗滌的裂解細胞去乳化以 形成未洗滌的去乳化的溶解細胞組合物;然后從所述未洗滌的去乳化的裂解細胞組合物分 離所述油。未洗滌的去乳化的裂解細胞組合意指這樣的方法，其中例如不用水或緩沖液洗 滌(其隨后通過例如離心除去)裂解細胞組合物。洗滌裂解細胞組合物可減少從細胞獲得的 油的總產量/收率。
[0083] 在可供選擇的實施方案中，所述裂解細胞組合物的洗滌次數可以減少1次、2次、3 次或更多次。在一些實施方案中，洗滌不超過1次、2次，或3次。
[0084] 在一些實施方案中，形成裂解細胞組合物、添加乳化劑至裂解細胞組合物、使裂解 細胞組合物接觸堿或提升裂解細胞組合物的pH、使裂解細胞組合物接觸鹽、加熱裂解細胞 組合物、以及攪拌裂解細胞組合物的各種組合可以在單一器皿中進行。在一些實施方案中， 形成細胞、使細胞接觸堿或提升細胞的pH、添加乳化劑至裂解細胞組合物、使細胞接觸鹽、 加熱細胞，以及攪拌細胞的各種組合可以在單一器皿中進行。在一些實施方案中，所述單一 器皿包括發酵器皿。在一些實施方案中，所述發酵器皿可具有20，000升、至少50，000升、至 少100,000升、至少120,000升、至少150,000升、至少200,000升、或至少220,000升的容積。 在一些實施方案中，所述發酵器皿可具有2〇,〇〇〇升至220,000升、20,000升至100,000升、 20,000升至 50,000 升、50,000升至 220,000 升、50,000升至 150,000 升、50,000升至 100,000 升、100,000升至 220,000升、100,000升至 150,000 升、100,000升至 120,000升、150,000 升至 220，000升、150，000升至 200，000升、或 200，000升至 220，000升的容積。
[0085] 在一些實施方案中，可將在器皿中形成的一定量的細胞和/或裂解細胞組合物轉 移至一個或多個攪拌器皿中。在一些實施方案中，所述攪拌器皿可具有至少20，000升、至少 30，000升、至少40，000升或至少50，000升的容積。在一些實施方案中，所述攪拌器皿可具有 20,000升至 50,000 升、20,000 升至 40,000升、20,000升至 30,000 升、30,000升至 50,000升、 30，000升至40，000升或40，000升至50，000升的容積。
[0086] -般而言，本文所述的方法不利用有機溶劑來從微生物細胞獲得、分離，或者以其 他方式回收微生物油。在一些實施方案中，從微生物細胞獲得微生物油時不使用有機溶劑。 在另一個實施方案中，在本文所述方法的過程中，不將有機溶劑以足以獲得微生物油的量 或濃度的添加至細胞、裂解細胞組合物，和/或油。有機溶劑包括極性溶劑、非極性溶劑、水 混溶溶劑、水不混溶溶劑，及其組合。
[0087] 在一些實施方案中，所述方法還包括從去乳化的裂解細胞組合物分離油。在一些 實施方案中，所述方法包括通過將去乳化的裂解細胞組合物離心而從該去乳化的裂解細胞 組合物分離油。在一些實施方案中，通過允許去乳化的裂解細胞組合物靜置而從該去乳化 的裂解細胞組合物分離油，其中所述油是使用重力從該去乳化的裂解細胞組合物分離的 (例如作為分離層）。在一些實施方案中，分離通過親脂性膜實現。在一些實施方案中，所述 分離包括在10°C至100°c的溫度離心。在一些實施方案中，通過如下從去乳化的裂解細胞組 合物分離所述油:首先提升pH(例如通過添加如上所述的堿），然后離心該去乳化的裂解細 胞組合物以獲得該油。
[0088] 在一些實施方案中，所述方法包括從去乳化的裂解細胞組合物分離油，所述分離 是通過在至少l〇°C、至少20°C、至少25°C、至少30°C、至少35°C、至少40°C、至少45°C、至少50 。(：、至少55 °C、至少60 °C、至少65 °C、至少70 °C、至少75°C、至少80 °C、至少85°C、至少90 °C、至 少95°C、或至少100°C的溫度離心所述去乳化的裂解細胞組合物來進行的。在一些實施方案 中，所述方法包括從去乳化的裂解細胞組合物分離油，所述分離是通過在l〇°C至100°C、10 。(：至 90°C、10°C 至 80°C、20°C 至 100°C、20°C 至 90°C、20°C 至 80°C、25°C 至 100°C、25°C 至 90°C、 25 °C 至80 °C、25 °C 至75 °C、30 °C 至 100 °C、30 °C 至90 °C、30 °C 至80 °C、40 °C 至 100 °C、40 °C 至90 °(：、40°(：至80°(：、50°(：至100°(：、50°(：至90°(：、50°(：至80°(：、50°(：至70°(：、60°(：至100°(：、60°(：至 90°(：、60°(：至80°(：、60°(：至70°(：、70°(：至100°(：、70°(：至90°(：、70°(：至80°(：、80°(：至100°(：、80 1€ 至90°C、或90°C至100°C的溫度離心所述去乳化的裂解細胞組合物來進行的。
[0089] 在一些實施方案中，離心是以1千克每分鐘（kg/分鐘）至500kg/分鐘、lkg/分鐘至 400kg/分鐘、lkg/分鐘至300kg/分鐘、lkg/分鐘至200kg/分鐘、lkg/分鐘至100kg/分鐘、 lkg/分鐘至75kg/分鐘、lkg/分鐘至50kg/分鐘、lkg/分鐘至40kg/分鐘、lkg/分鐘至30kg/分 鐘、lkg/分鐘至25kg/分鐘、lkg/分鐘至10kg/分鐘、10kg/分鐘至500kg/分鐘、10kg/分鐘至 400kg/分鐘、10kg/分鐘至300kg/分鐘、10kg/分鐘至200kg/分鐘、10kg/分鐘至100kg/分鐘、 10kg/分鐘至75kg/分鐘、10kg/分鐘至50kg/分鐘、10kg/分鐘至40kg/分鐘、10kg/分鐘至 30kg/分鐘、20kg/分鐘至500kg/分鐘、20kg/分鐘至400kg/分鐘、20kg/分鐘至300kg/分鐘、 20kg/分鐘至200kg/分鐘、20kg/分鐘至100kg/分鐘、20kg/分鐘至75kg/分鐘、20kg/分鐘至 50kg/分鐘、20kg/分鐘至40kg/分鐘、25kg/分鐘至500kg/分鐘、25kg/分鐘至400kg/分鐘、 25kg/分鐘至300kg/分鐘、25kg/分鐘至200kg/分鐘、25kg/分鐘至100kg/分鐘、25kg/分鐘至 75kg/分鐘、25kg/分鐘至50kg/分鐘、30kg/分鐘至60kg/分鐘、30kg/分鐘至50kg/分鐘、 30kg/分鐘至40kg/分鐘、50kg/分鐘至500kg/分鐘、100kg/分鐘至500kg/分鐘、或200kg/分 鐘至500kg/分鐘的（去乳化的裂解細胞組合物進入離心機的)進料速率進行的。
[0090] 在一些實施方案中，所述方法包括以l，000g至25,00(^、1，00(^至20,00(^、1，000 8 至10,00(^、2,00(^至25,00(^、2,00(^至20,00(^、2,00(^至15,00(^、3,00(^至25,00(^、3， 000g至20，000g、5,000g至25,000g、5,000gS20,000g、5,000gSl5,000g、5,000gSl0, 000g、5,000g至8,000g、10,000g至25,000g、15,000g至25,000g、或至少1,000g、至少 2,000、 g、至少4,000g、至少5,000g、至少7,000g、至少8,000g、至少10,000g、至少15,000g、至少20, 〇〇〇g、或至少25，000g的離心力對去乳化的裂解細胞組合物進行離心。如本文所用的，"g"意 指標準重力或約9.8m/s 2。在一些實施方案中，所述方法包括以4，OOOrpm至14，000rpm、4， OOOrpm至10，OOOrpm、6，OOOrpm至14，OOOrpm、6，OOOrpm至12，OOOrpm、8，000至14，OOOrpm、8， OOOrpm至12，OOOrpm、或8，OOOrpm至10，OOOrpm離心去乳化的裂解細胞組合物。
[0091 ] 在一些實施方案中，可以通過例如傾析、撇除（skimming)、真空處理、栗送、吸取 (sucking off )、抽取(drawing off )、虹吸（siphoning)，或以其他方式從分離的組合物表 面回收微生物油來回收所述油。
[0092]在一些實施方案中，所述方法包括將回收的油進行干燥以從該油去除水。在一些 實施方案中，干燥該油可包括但不限于加熱該油以蒸發水。在一些實施方案中，干燥后所述 油具有按油的重量（或體積）百分比計為低于3%、低于2.5%、低于2%、低于1.5%、低于 1 %、低于0.5%、低于0.1 %、或0%的水含量。在一些實施方案中，干燥后所述油具有按油的 重量(或體積）百分比計為〇%至3%、0%至2.5%、0%至2%、0%至1.5%、0%至1%、0%至 0.5%、0.1%至3%、0.1%至2.5%、0.1%至2%、0.1%至1.5%、0.1%至1%、0.1%至 0.5%、0.5%至3%、0.5%至2.5%、0.5%至2%、0.5%至1.5%、0.5%至1%、1%至3%、1% 至2.5%、1 %至2%、1 %至1.5%、1.5%至3%、1.5%至2.5%、1.5%至2%、2%至3%、2%至 2.5%、或2.5%至3%的水含量。
[0093]本發明公開了可以通過本文所述任一種方法從微生物細胞獲得的微生物油。在一 些實施方案中，所述油包含按重量(或體積)計至少30%的花生四烯酸。在一些實施方案中， 所述油包含按重量(或體積)計至少30%的二十二碳六烯酸。
[0094]茴香胺值(AV)根據A0CS官方方法Cd 18-90來確定。在一個實施方案中，本文所述 的油具有低于約50;低于約40;低于約30;低于約20;低于約15;或低于約10的AV。在一些實 施方案中，所述油具有低于約50的AV。術語茴香胺值意指次級反應產物(例如油的氧化過程 中產生的醛和酮）的測量值。
[0095]過氧化物值(PV)根據A0CS官方方法Cd 8-53來確定。在一個實施方案中，本文所述 的油具有低于約20meq/kg;低于約10meq/kg;或低于約5meq/kg的PV。在一些實施方案中，所 述油具有低于5meq/kg的PV。術語過氧化物值意指初級反應產物(例如油的氧化過程中產生 的過氧化物和氫過氧化物)的測量值。如本文所用，過氧化物值以meq/kg測量。
[0096] 在一些實施方案中，所述油具有lOOppm或更低、95ppm或更低、90ppm或更低、85ppm 或更低、80ppm或更低、75ppm或更低、70ppm或更低、65ppm或更低、60ppm或更低、55ppm或更 低、50ppm或更低、45ppm或更低、40ppm或更低、35ppm或更低、30ppm或更低、25ppm或更低、 20ppm或更低、15ppm或更低、lOppm或更低、9ppm或更低、8ppm或更低、7ppm或更低、6ppm或更 低、5ppm或更低、4ppm或更低、3ppm或更低、2ppm或更低、或lppm或更低的磷含量。在一些實 施方案中，所述油具有約8ppm或更低的磷含量。
[0097] 在一些實施方案中，所述油包含一種或多種PUFA。在一些實施方案中，所述油包含 至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50 %、至少60 %、至少70 %或至少80 %的PUFA(按PUFA重量計）。在一些實施方案中，所述油 包含至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、 至少50 %、至少60 %、至少70 %或至少80 %的DHA(按DHA重量計），和/或至少10 %、至少 15%、或至少20%的0?六11-6(按0?4 11-6重量計），和/或至少10%、至少15%、或至少20%的 EPA(按EPA重量計），和/或至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、 至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、或至 少80%的ARA(按ARA重量計）。在一些實施方案中，所述油包含低于50%、低于40%、低于 30%、低于20%、低于15%、低于10%、或低于5%的EPA(按EPA重量計）。在一些實施方案中， 所述油包含低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、或低于5%的 DHA(按DHA重量計）。在一些實施方案中，油包含按重量(或體積)計低于10%、低于5%、低于 2%、低于1 %、或低于0.5%的固醇類。
[0098] 在一些實施方案中，油包含按重量(或體積)計至少50%、至少60%、至少70%、至 少 80%、至少90%、至少95%、或50%至95%、50%至90%、50%至85%、50%至80%、50%至 75%、60%至95%、60%至90%、60%至85%、70%至95%、70%至90%、70%至85%、75%至 95%、75%至90%、或75%至85%的甘油三酯。
[0099]在一些實施方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少10 %、至少20%、至 少30 %、至少35%、至少40 %、至少50%、至少60 %、至少70%或至少80 %的DHA。在一些實施 方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少10%、至少20%、至少30%、至少35%、至 少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、或至少 80%的ARA。在一些實施方案中，所述甘油三酯包含按重量(或體積)計至少50%、至少40%、 至少30%、至少20%、至少15%、至少10%、或至少5%的EPA。
[0100] 在一些實施方案中，通過本文所述方法的任一種獲得和/或回收的微生物油是粗 制油。在另一個實施方案中，本文所述的油是精制油。"粗制油"是從微生物細胞獲得的、未 經進一步加工的油。"精制油"是通過用精制、漂白，和/或脫臭的標準流程處理粗制油所獲 得的油。參見例如，美國專利No. 5，130，242。在一些實施方案中，精制包括但不限于:苛性精 制法(causticref ining)、脫膠、酸處理、堿處理、冷卻、加熱、漂白、脫臭、脫酸，及其組合。
[0101] 在一些實施方案中，所述方法包括濃縮包含微生物細胞的發酵液。在一些實施方 案中，該方法包括濃縮裂解細胞組合物。如本文使用的，"濃縮"意指從組合物去除水。濃縮 可以包括但不限于，蒸發、化學干燥、離心等等，及其組合。在一些實施方案中，將細胞組合 物或裂解細胞組合物濃縮以提供按裂解細胞組合物的重量(或體積)計至少4 %，至少5 %， 至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，或至少30%的油濃度。在一些實施方案中，將細 胞組合物或裂解細胞組合物濃縮以提供按裂解細胞組合物的重量(或體積)計4 %至40%、 4% 至30%、4%至20%、4%至15%、5%至40%、5%至30%、5%至20%、10%至40%、10%至 30%、10%至20%、15%至40%、15%至30%、20%至40%、20%至30%、25%至40%、或30% 至40 %的油濃度。
[0102 ]供本發明使用的微生物細胞的有效培養條件包括但不限于，允許生產油的有效的 培養基、生物反應器、溫度、PH、以及氧條件。有效的培養基是指任何這樣的培養基，其中通 常培養微生物細胞，例如破囊壺菌目微生物細胞。此類培養基通常包含水性基質，其具有可 同化的碳源、氮源、與磷酸鹽源，以及適當的鹽、礦物質、金屬，及其他營養物，如維生素。供 本發明使用的微生物細胞可以培養于常規的發酵生物反應器、搖瓶、試管、微滴定盤，以及 培養皿(petri plate)內。
[0103] 在一些實施方案中，微生物細胞包含按重量(或體積)計至少30%的油，按重量(或 體積)計至少35 %的油，按重量（或體積）計至少40 %的油，按重量（或體積)計至少50 %的 油，按重量(或體積)計至少60 %的油，按重量(或體積)計至少70 %的油，或按重量(或體積） 計至少80%的油。在一些實施方案中，供本發明使用的微生物細胞能夠產生至少0.1克每升 每小時（g/L/h)的 DHA，至少 0 · 2g/L/h 的 DHA，至少 0 · 3g/L/h 的 DHA，或至少 0 · 4g/L/h 的 DHA。在 一些實施方案中，供本發明使用的微生物細胞能夠產生至少0.01克每升每小時(g/L/h)的 ARA，至少0.05g/L/h的ARA，至少0. lg/L/h的ARA，至少0.2g/L/h的ARA，至少0.3g/L/h的ARA， 或至少0.4g/L/h的ARA。
[0104] 在一些實施方案中，根據本文所述方法的任一種而獲得的油、用過的生物質，或其 組合可以直接地用作食品或食品成分，如下列兒童食品，嬰兒配方、飲料、醬汁、基于乳品的 食品（例如奶、酸乳、奶酪與冰淇淋）、油類(例如烹調油(cooking oil)或色拉調味汁(salad dressing))，以及烘焙食物;營養補充劑(例如以膠囊或片劑形式）；用于任何非人動物的飼 料或飼料補充劑(例如其產物(例如肉、奶、或蛋)供人消耗的動物）；食物補充劑；以及藥物 (于直接或附加療法應用中）。術語"動物"意指屬于動物界(kingdom Animalia)的任何生 物，且包括任何人類動物，和由其得到產品（例如奶、蛋、禽肉、牛肉、豬肉或羊肉）的非人動 物。在一些實施方案中，該油和/或生物質可以用于海產食品中。海產食品來源于，但不限于 魚、奸與貝類。術語"產物"包括由此類動物得到的任何產品，包括但不限于肉、蛋、奶或其他 產物。當將該油和/或生物質喂予此類動物時，多不飽和油可并入此類動物的肉、奶、蛋或其 它產品中以增加這些油中它們的含量。 實施例
[0105] 實施例1
[0106] 將含有微生物細胞(被孢霉屬）的細胞培養液(250mL)通過剪切混合器30秒，然后 通過使培養液經過 Microfluidics M_110Y微流化器(mi crofluidizer) (Microfluidics， Newton，MA)兩次而將其機械均質化以裂解細胞。第一次和第二次經過所述微流化器是以 10,000psi進行的。以按重量計裂解細胞組合物的1%的量將十二烷基硫酸鈉(SDS)粉末添 加至所述裂解細胞組合物。將裂解細胞組合物加熱至90°C，同時以180rpm的速度攪拌3小 時。通過添加按重量計裂解細胞組合物的2%至4%的NaOH的12.5%w/w溶液將裂解細胞組 合物的pH調整至8.42。以按重量計裂解細胞組合物的2%的量添加固體NaCl，并將組合物于 90°C以180rpm攪拌30小時。在攪拌過程中，允許裂解細胞組合物的pH下降并通過添加按重 量計裂解細胞組合物的2 %至4 %的NaOH的12.5 % w/w溶液將pH調整至8。以8，000g將裂解細 胞組合物離心5分鐘以提供粗制油，其產出69.7 %的ARA(按ARA重量計）。所述粗制油的茴香 胺值(AV)為27.9。
[0107] 實施例2
[0108]將含有微生物細胞(被孢霉屬）的細胞培養液(250mL)通過剪切混合器30秒，然后 通過使培養液經過Microfluidics M-110Y微流化器(Microfluidics，Newton，MA)兩次而將 其機械均質化以裂解細胞。第一次和第二次經過所述微流化器是以l〇,〇〇〇psi進行的。通過 添加按重量計裂解細胞組合物的4 %至8 %的NaOH的12.5 % w/w溶液將所述裂解細胞組合物 的pH調整至10.02。以按重量計裂解細胞組合物的1 %的量添加 SDS粉末，并將所述組合物加 熱至90 °C，同時以180rpm的速度攪拌3小時。允許裂解細胞組合物的pH降低至8.5，在該點處 以按重量計裂解細胞組合物的2 %的量添加固體NaCl，并將組合物于90°C以180rpm攪拌40 小時。在攪拌過程中，允許裂解細胞組合物的pH下降并通過添加按重量計裂解細胞組合物 的2 %至4 %的NaOH的12.5 % w/w溶液將pH調整至8。以8，000g將裂解細胞組合物離心5分鐘 以提供粗制油，其產出78.9 %的ARA(按ARA重量計）。所述粗制油的茴香胺值(AV)為11.2。
[0109] 實施例3
[0110] 通過將含有微生物細胞(被孢霉屬）的細胞培養液(716kg)經過GEA Niro均質機 (GEA Niro Soavi North America,Bedford，NH)兩次來將培養液機械均質化以裂解細胞， 從而形成裂解細胞組合物。第一次和第二次經過所述微流化器是以l〇,〇〇〇psi進行的。以按 重量計裂解細胞組合物的1 %的量添加 SDS粉末，并將所述組合物加熱至90 °C，同時以 180rpm的速度攪拌3小時。通過添加1.3kg的NaOH的50%w/w溶液將裂解細胞組合物的pH調 整至約8.5。以按重量計裂解細胞組合物的2%的量添加固體NaCl，并于90°C將所述組合物 攪拌60小時。在攪拌過程中，允許裂解細胞組合物的pH下降并隨后通過添加按重量計裂解 細胞組合物的〇 . 5 %至1 %的NaOH的50 % w/w溶液將pH調整至8。按40kg/分鐘的進料速率以 6，OOOrpm將所述組合物離心（使用WestfaliaRSE-110離心機(Westfalia Separator AG， Germany))以提供粗制油，其產出85 %的ARA(按ARA重量計）。所述粗制油具有48 · 9的AV和 3.2ppm的磷含量。
[0111] 實施例4
[0112] 將含有微生物細胞(被孢霉屬）的細胞培養液（l，600kg)通過剪切混合器60秒，然 后通過使培養液經過Microfluidics M_110Y微流化器(Microfluidics，Newton，MA)兩次來 將培養液機械均質化以裂解細胞，從而形成裂解細胞組合物。第一次和第二次經過所述微 流化器是以10，〇〇〇psi進行的。通過添加按重量計裂解細胞組合物的1 %的NaOH的50%w/w 溶液將裂解細胞組合物的pH調整至約10。以按重量計裂解細胞組合物的3 %的量添加 SDS的 30 %w/w溶液，并將所述組合物加熱至90 °C，同時以180rpm的速度攪拌3小時。允許裂解細胞 組合物的pH降至約8.5，在該點處以按重量計裂解細胞組合物的2%的量添加固體NaCl，并 將組合物于90°C以180rpm攪拌100小時。在攪拌過程中，允許裂解細胞組合物的pH下降并通 過添加按重量計裂解細胞組合物的0.5 %至1 %的NaOH的50 % w/w溶液將pH調整至8。按8L/ 分鐘的進料速率以ll，〇〇〇rpm將所述組合物離心（使用Seital SR 1010離心機（Seital srl，Italy))以提供粗制油，其產出66.9%的ARA(按ARA重量計）。所述粗制油具有14.6的AV 和lppm的磷含量。
[0113] 實施例5
[0114]將含有微生物細胞(被孢霉屬）的細胞培養液(250g)通過剪切混合器30秒，然后通 過使培養液經過Microfluidics M-110Y微流化器(Microfluidics，Newton，MA)兩次而將其 機械均質化以裂解細胞。第一次和第二次經過所述微流化器是以l〇,〇〇〇psi進行的。通過添 加 NaOH的12.5%w/w溶液將裂解細胞組合物的pH調整至10。以按重量計裂解細胞組合物的 1 %的量向裂解細胞組合物添加 Tween 80 (聚山梨醇酯80 )，并將組合物加熱至90 °C，同時以 250rpm的速度攪拌3小時。允許裂解細胞組合物的pH降至8.3,在該點處以按重量計裂解細 胞組合物的2%的量添加固體NaCl，并于90°C以250rpm將所述組合物攪拌20小時。在20小時 攪拌全程過程中取樣，并以8,000g離心5分鐘。沒有油分離的跡象。通過以按重量計裂解細 胞組合物的2%的量添加 Tween 80(聚山梨醇酯80)來重復實驗。沒有油分離的跡象。據信， SDS促進油從實施例1-4的裂解細胞組合物分離，因為SDS是離子性乳化劑(Tween 80是非離 子性乳化劑)并且具有比Tween 80 (1310g/mo 1)更小的分子量(288g/mo 1)。
[0115] 實施例6
[0116] 將含有微生物細胞（裂殖壺菌屬菌種（Schizochytrium sp .))的細胞培養液 (300g)于60 °C巴氏消毒1小時。以180RPM的速度攪拌細胞培養液并加熱至60 °C。通過以基于 培養基重量0.5 %的量添加50wt%Na0H溶液（其將未洗滌的培養液pH調整至7-7.5)和 Ale_a.lase?.2.4FG (可從Novozymes(Franklinton，NC)得到）來裂解細胞。培養液反應2小時， 然后通過添加12.5wt %NaOH溶液將pH調整至10-11。同時，以按重量計裂解細胞組合物的 2 %的量添加 SDS粉末，并將所述組合物加熱至80-90 °C 2-5小時。在維持時間之后，以按重量 計裂解細胞組合物的2 %的量添加固體N a C1，并將所述組合物加熱至9 0 °C 19小時。以 8000RPM將裂解細胞組合物離心(Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供 粗制油，其產出51.44 %的DHA(按DHA重量計）。
[0117] 實施例7
[0118]將含有微生物細胞(裂殖壺菌屬菌種）的細胞培養液（300g)于60°C巴氏消毒1小 時。通過以10,OOOpsi使未洗滌的細胞培養液經過Microfluidics M-110Y微流化器 (Microfluidics，Newton，MA)-次而將其機械均質化以裂解細胞。當以180RPM的速度攪拌 裂解細胞組合物時，通過添加12.5wt %NaOH溶液將所述組合物的pH調整至10-11。同時，以 按重量計裂解細胞組合物的2%的量添加 SDS粉末，并將所述組合物加熱至80-90°C2-5小 時。在維持時間之后，以按重量計裂解細胞組合物的2%的量添加固體NaCl，并將所述組合 物加熱至9 0 °C并保持數小時。以8 0 0 0 R P Μ將裂解細胞組合物離心（T h e r m 〇 ScientificSorvell ST40R離心機）5分鐘以提供粗制油，其產出59.32%的0骱(按0骱重量 計)。
[0119] 實施例8
[0120]將含有微生物細胞(裂殖壺菌屬菌種）的細胞培養液（300g)于60°C巴氏消毒1小 時。以180RPM的速度攪拌細胞培養液并加熱至60°C。通過以基于培養基重量0.5 %的量添加 5 0 w t % N a 0 Η溶液（其將未洗滌的培養液p Η調整至7 - 7.5 )和A丨c a I a s e? 2.4 F G (可從 1'1〇￥〇2}〇116 8(?抑111^1;[111:011，1'10得到）來裂解細胞。當維持攪拌時，通過添加12.5￥1:%似0!1溶 液將裂解細胞組合物的pH調整至10-11。同時，以按重量計裂解細胞組合物的1 %的量添加 SDS粉末，并將所述組合物加熱至80-90°C 1.5小時。在維持時間之后，以按重量計裂解細胞 組合物的2%的量添加固體NaCl，并將所述組合物加熱至90°C并保持數小時。以8000RPM將 裂解細胞組合物離心(Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以提供粗制油。
[0121] 實施例9
[0122] 將含有微生物細胞(裂殖壺菌屬菌種）的細胞培養液（300g)于60°C巴氏消毒1小 時。以180RPM的速度攪拌細胞培養液并加熱至60°C。通過以基于培養基重量0.5 %的量添加 50wt % NaOH溶液（其將未洗滌的培養液pH調整至7-7.5 )和Alcalase? 2.4FG (可從 1'1〇￥〇2}〇116 8(?抑111^1;[111:011，1'10得到）來裂解細胞。當維持攪拌時，通過添加12.5￥1:%似0!1溶 液將裂解細胞組合物的pH調整至10-11。同時，以按重量計裂解細胞組合物的0.5 %的量添 加 SDS粉末，并將所述組合物加熱至80-90°C 2小時。在維持時間之后，以按重量計裂解細胞 組合物的2%的量添加固體他(：1，并將所述組合物加熱至90°(：并保持18小時。以80001?^將 裂解細胞組合物離心（Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機)5分鐘以產出80%粗制 油，其產出85%的DHA(按DHA重量計）。
[0123] 實施例10
[0124] 將含有微生物細胞(裂殖壺菌屬菌種）的細胞培養液（300g)于60°C巴氏消毒1小 時。以180RPM的速度攪拌細胞培養液并加熱至60°C。通過以基于培養基重量0.5 %的量添加 50wt % NaOH溶液（其將未洗滌的培養液pH調整至7-7.5 )和Alealase? 2.4FG (可從 1'1〇￥〇2}〇116 8(?抑111^1;[111:〇11，1'1〇得到）來裂解細胞。當維持攪拌時，通過添加12.5￥1:%似0!1溶 液將裂解細胞組合物的pH調整至10-11。同時，以按重量計裂解細胞組合物的1 %的量添加 SDS粉末，并將所述組合物加熱至90°C。在90°C2.5小時后，以8000RPM將所述組合物離心 (Thermo Scientific Sorvell ST40R離心機）5分鐘以提供粗制油，其產出92%的DHA(按 DHA重量計）。
【主權項】
1. 一種用于從一個或多個微生物細胞獲得包含一種或多種多不飽和脂肪酸的微生物 油的方法，其中該方法包括： (a) 裂解包含所述微生物油的細胞以形成裂解細胞組合物； (b) 將所述裂解細胞組合物去乳化以形成去乳化的裂解細胞組合物； (c) 從所述去乳化的裂解細胞組合物分離所述油；以及 (d) 回收所述油； 其中（b)包括在步驟(a)之前、過程中、或之后添加乳化劑。2. 權利要求1的方法，其中（a)或(b)中至少一個還包括將所述細胞或組合物加熱到至 少 70。。。3. 權利要求1或2的方法，其中（a)或(b)中至少一個還包括將所述細胞或組合物加熱到 約 70°C 至約 100°C。4. 前述任一權利要求的方法，其中(b)還包括添加堿至所述裂解細胞組合物。5. 前述任一權利要求的方法，其中（b)還包括將所述裂解細胞組合物的pH提升至約8或 更尚。6. 前述任一權利要求的方法，其中（b)還包括以按重量計所述裂解細胞組合物的約 0.05 %至約20 %的量添加鹽。7. 前述任一權利要求的方法，其中(b)還包括攪拌所述裂解細胞組合物。8. 前述任一權利要求的方法，其中(a)還包括攪拌所述細胞。9. 前述任一權利要求的方法，其中(a)的細胞是未經洗滌的。10. 前述任一權利要求的方法，其中(a)的細胞包含于發酵液中。11. 前述任一權利要求的方法，其中（c)包括將去乳化的裂解細胞組合物離心。12. 前述任一權利要求的方法，其中所述多不飽和脂肪酸選自ω-3脂肪酸，ω-6脂肪 酸，及其混合物。13. 前述任一權利要求的方法，其中所述多不飽和脂肪酸選自二十二碳六烯酸(DHA)、 二十碳五烯酸(ΕΡΑ)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(ARA)、γ -亞麻酸(GLA)、二高-γ -亞麻酸(DGLA)、十八碳四稀酸(stearidonic acid,SDA)，及其混合物。14. 權利要求13的方法，其中所述多不飽和脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。15. 權利要求13的方法，其中所述多不飽和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)。16. 前述任一權利要求的方法，其中所述微生物細胞是藻類、酵母、真菌、原生生物，或 細菌細胞。17. 前述任一權利要求的方法，其中所述微生物細胞來自被孢霉屬(Mort i ere 1 la )、隱 甲藻屬（Crypthecodinium)，或破囊壺菌目（Thraustochytriales) ·18. 權利要求16的方法，其中所述微生物細胞來自破囊壺菌目。19. 權利要求17的方法，其中所述微生物細胞來自破囊壺菌屬(Thraustochytrium)、裂 殖壺菌屬（Schizochytrium)，或其混合物。20. 權利要求16的方法，其中所述微生物細胞來自高山被孢霉(Mortierella Alpina)。21. 前述任一權利要求的方法，其中所述裂解細胞組合物包含液體、細胞碎片以及微生 物油。22. 前述任一權利要求的方法，其中不使用有機溶劑而從所述細胞獲得所述油。23. 前述任一權利要求的方法，其中所述去乳化的裂解細胞組合物的平均粒度是至少 10微米。24. 前述任一權利要求的方法，其中所述乳化劑是離子性乳化劑。25. 權利要求24的方法，其中所述離子性乳化劑是陰離子乳化劑，其選自陰離子硫酸鹽 乳化劑、陰離子磺酸鹽乳化劑、陰離子磷酸鹽乳化劑、陰離子羧酸鹽乳化劑，及其組合。26. 權利要求25的方法，其中所述陰離子乳化劑是陰離子硫酸鹽乳化劑。27. 權利要求25的方法，其中所述離子性乳化劑選自月桂基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、 月桂醇聚醚硫酸鈉 （sodium laureth sulfate)、月桂基醚硫酸鈉、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉 (sodium myreth sulfate)，及其組合。28. 前述任一權利要求的方法，其中以按重量計所述裂解細胞組合物的0.2%至10 %的 量添加所述乳化劑。29. 權利要求6-28任一項的方法，其中所述鹽選自下組：堿金屬鹽、堿土金屬鹽、硫酸 鹽，及其組合。30. 前述任一權利要求的方法，其中(d)的油是粗制油。31. 權利要求30的方法，其中(d)還包括精制所述粗制油以獲得精制油。32. 前述任一權利要求的方法，其中所述油包含按重量計至少30 %的花生四烯酸。33. 前述任一權利要求的方法，其中所述油包含按重量計至少30 %的二十二碳六烯酸。34. 前述任一權利要求的方法，其中所述油具有低于約50的茴香胺值。35. 前述任一權利要求的方法，其中所述油具有約8ppm或更低的磷含量。36. 前述任一權利要求的方法，其中所述油具有低于約5meq/kg的過氧化物值。37. 通過前述任一權利要求的方法獲得的油。
【文檔編號】C11B3/00GK105939710SQ201480074727
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月19日
【發明人】D·麥克萊門茨, N·塔巴耶內賈德, S·切林科, M·巴克, N·F·萊寧格爾
【申請人】帝斯曼知識產權資產管理有限公司