次阿樸啡生物堿衍生物用于制備促進ampk活性的藥物的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明公開一種次阿樸啡生物堿衍生物用于制備具有活化磷酸化腺苷酸依賴蛋 白激酶（AMPK)功效的藥物的用途。
【背景技術】
[0002] 次阿樸啡生物堿一般存在于自然界的罌粟科或無患子科等植物中，其結構 屬于胺乙基菲（aminoethylphenanthrene)，而胺乙基菲在生物體內常藉由釀氨酸 (tyrosine)合成異喹啉的途徑產生。次阿樸啡生物堿藥理活性大多在于鎮痛、止咳或催 吐作用，而此類化合物亦證實具有治療心血管方面疾病的功效（Su et al.，美國專利號碼 US5, 594, 033)。
[0003] 憐酸化腺苷酸依賴蛋白激酶（AMP-dependent protein kinase, AMPK)是一種在細 胞內維持能量代謝調節的蛋白激酶，其特征是能與磷酸化腺苷酸（AMP)結合，透過AMP維 持ATP生成和消耗的平衡，維持能量代謝平衡。同時，AMPK亦可調控細胞生長和增殖、建 立和穩定細胞極性、調節動物壽命、調控生理節律等。近幾年以AMPK活化作用作為標的已 成為藥物開發的重點之一，因此新的AMPK活化劑為醫藥產業積極努力開發的方向。

【發明內容】

[0004] 本發明非可預期的發現一種次阿樸啡生物堿衍生物，例如N-烯丙基次波爾定堿 (N-allylsecoboldine)，具有促進AMPK活性的新穎用途。
[0005] 在一方面，本發明提供一種次阿樸啡生物堿衍生物用于制備具有活化磷酸化腺 苷酸依賴蛋白激酶（AMPK)功效的藥物的用途，其中該次阿樸啡生物堿衍生物具有下式I 或其醫藥上可接受的鹽：
[0007] 其中&、R2及R3各獨立為Η及烷基；R 4為H、烷基、丙烯基（_CH2CHCH2)或芐基。
[0008] 在本發明一實施例，該次阿樸啡生物堿衍生物為N-烯丙基次波爾定堿 (N-allylsecoboldine)或其醫藥上可接受的鹽。
[0009] 另一方面，本發明提供本發明具式I的次阿樸啡生物堿衍生物用于制備治療AMPK 相關疾病藥物的用途，其中該藥物系透過促進AMPK活性達治療之效。其中該AMPK相關疾 病包括癌癥。而該藥物亦具抗發炎或促進傷口愈合之效。
[0010] 本發明之該等及其它方面，可通過以下的較佳具體實施例的描述以及圖式，得以 更為明晰；即便其中可能會有變化或修飾，但不背離本發明所揭露的新穎觀念的精神及范 疇。
【附圖說明】
[0011] 本發明所呈現的較佳具體實施例圖式是以闡述本發明為目的。應被理解的是，本 發明并不局限于所示的較佳具體實施例。圖中及實施例中的數據是以平均值土標準偏差 (Mean+SD)表不，其中以成對t檢定（paired t-test)檢測，顯著差異表不為*:Ρ〈0· 05、 林:Ρ〈0· 01、#:Ρ = 0· 067。
[0012] 圖1顯示Ν-烯丙基次波爾定堿對于ΑΜΡΚ磷酸化的影響，其中分別以不同濃度 (1、3及10 μ M)的N-烯丙基次波爾定堿在C2C12細胞中進行AMPK活性檢測。
【具體實施方式】
[0013] 除非另有定義，所有本文所用的技術性及科學性術語，對于屬于本發明領域的具 有通常知識者而言，皆具有與其所習知者相同意義。
[0014] 除非文中有清楚指明者，于本文中所使用的單數形式「一」、「一種」、及「該」的涵 義均為包括「至少一種」的復數形式。因此，例如，當提及「一成分」時，包括復數個該等成 分及本領域技術人員所知的同等物。
[0015] 本文中所使用的「AMPK」一詞，是磷酸化腺苷酸依賴蛋白激酶（AMP-dependent protein kinase)的縮寫，是指一種調節細胞內能量代謝的蛋白激酶，為許多生物過程的 主要調控因子。AMPK的訊息路徑包含葡萄糖及脂質代謝，及影響相關基因與蛋白質的表 達。當AMPK活化后會激發其活性，進一步調節其AMPK訊息路徑下游的物質，調節肝臟、 骨骼肌、心臟、脂肪組織及胰腺代謝。因此，具促進AMPK活性的藥物可做為新陳代謝疾病 如糖尿病、癌癥、心血管疾病如動脈粥樣硬化和缺血性心臟病等多種疾病的潛在藥物，亦 可用于抗發炎反應或促進傷口愈合。
[0016] 本文中所使用的「烷基」一詞，是指含1-20個碳原子的直鏈或支鏈單價烴，例如 具有1-10個碳的烷基，較佳為具有1-6個碳的烷基，更佳為具有1-3個碳的烷基。烷基 的實施例包括，但不局限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基，和第三丁基。
[0017] 本發明提供一種次阿樸啡生物堿衍生物用于制備具有活化磷酸化腺苷酸依賴蛋 白激酶（AMPK)功效的藥物的用途，其中該次阿樸啡生物堿衍生物具有下式I或其醫藥上 可接受的鹽：
[0019] 其中&、R2及R3各獨立為Η及烷基；R 4為H、烷基、丙烯基（_CH2CHCH2)或芐基。
[0020] 根據本發明之一具體實施例，其中式I取代基氏=R2 = H、R3 = Me(甲基） 及& = CH2CHCH2(丙烯基）時，該次阿樸啡生物堿衍生物為N-烯丙基次波爾定堿 (N-allylsecoboldine)，其具有下列化學式：
[0022] 在一具體實施例中，本發明具式I的次阿樸啡生物堿衍生物具有促進AMPK活性 達治療的功效，遂具有用于制備AMPK相關疾病藥物的用途，例如可用于治療癌癥。而該 藥物亦具有抗發炎或促進傷口愈合之效。
[0023] 根據本發明，該具式I的次阿樸啡生物堿衍生物可調制成任何一般制藥技術所知 或習用的藥品型式，并可依任何制藥習知技術配合常用的載劑或醫藥上可接受的載劑制 成含有醫療有效量的組成物。
[0024] 本文所使用的「載劑」或「醫藥上可接受的載劑」一詞是指包括但不限于制藥上可 接受的賦形劑、填充劑、稀釋劑或類似物，包括制藥業一般知識者所熟知者。
[0025] 本文所使用的「醫藥上可接受的鹽」一詞是指是對于人類或哺乳動物服用具安全 性且有效的鹽類化合物，并具有其所需的生物活性。醫藥上可接受鹽類為本領域技術人士 所熟知的，包括但不限于本發明使用的酸性鹽類，例如與鹽酸、氫溴酸、碘酸、硝酸、硫酸、 硫酸氫鈉、磷酸、醋酸、乳酸、水楊酸、檸檬酸、酒石酸、泛酸、重酒石酸、抗壞血酸、丁二酸、馬 來酸、富馬酸、葡萄糖酸、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、甲基磺酸、對甲苯磺酸合成的鹽類。
[0026] 以上述發明說明以及下列實施例說明本發明，但并非用以限制本發明的范圍。
[0027] 實施例1:本發明具式I的次阿樸啡生物堿衍生物的制備
[0028] 將lg波爾定（boldine)溶于30mL的N，N-二甲基甲酰胺 (N，N-Dimethylformamide, DMF)溶液中，接著與 1. 2mL 溴丙烯（allyl bromide) 在100-1KTC下反應2小時，所得產物經純化后即可獲得N-烯丙基次波爾定堿 (N-allylsecoboldine)。上述制備方法系遵循中華民國臺灣專利第105255號實例所述的 制備方法，該案之全文以引用的方式并入本文中。
[0029] 實施例2: N-烯丙基次波爾定堿于促進AMPK活性的評估
[0030] C2C12骨骼肌原母細胞株系購自臺灣財團法人食品工業發展研究所。（：2(： 12細 胞株為由成年C3H小鼠的腿骨骼肌于95 %氧氣、5 %二氧化碳及37 °C細胞培養箱中所 培養出來的細胞株，該細胞培養于含4. 5mg/mL葡萄糖、10 %胎牛血清（fetal bovine serum, FBS ;Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA)、及抗生素溶液（終濃度 penicillinlOOIU/ mL,鏈霉素（streptomycin) 100 μ g/mL)的 DMEM(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA)培養 基中。當C2C12肌母細胞增殖至培養皿的七分滿后，以2%馬血清（horse serum ;Gibco/ Invitrogen, Carlsbad, CA)取代胎牛血清，以將C2C12肌母細胞誘導成具多細胞核的肌細 胞。四天后C2C12肌母細胞分化成肌細胞，細胞于實驗前24小時將培養液換成不具血清的 DMEM以降低細胞的代謝活動。
[0031] 將C2C12肌細胞分別以1 μ Μ、3 μ Μ及10 μ Μ的N-烯丙基次波爾定堿處理5分鐘 及15分鐘，然后將C2C12肌細胞用PBS緩沖液清洗并加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩 沖液（20mM Tris-HCl ρΗ7· 4, lOOmM NaCl, ImM EDTA, ImM EGTA, 0· 1 % SDS, 0· 5 % 脫氧膽酸 鈉 （sodium deoxycholate), 1% NP-40 及 100X 蛋白酶抑制劑混合物（protease inhibitor cocktail))。收集細胞并置于冰上離心，然后將樣本的上清液調整為相同濃度。
[0032] 將樣本上清液以8% SDS-PAGE進行垂直電泳分離，然后將分離后的蛋白質轉印到 PVDF轉印膜上。轉印完成后取出PVDF轉印膜并加入以5%脫脂牛奶的TBST(TriS-buffered saline with Tween-20)所配制成的阻斷緩沖液（blocking buffer)于室溫下阻斷1小時， 然后將PVDF轉印膜分別置入含一級單株抗體Phospho-ΑΜΡΚα (Thrl72) (Cell signaling) (1:1000)與 ΑΜΡΚα (Cell signaling) (1:1000)的 5% BSA 與 TBST 溶液中，并于 4°C 進 行初級免疫結合反應。之后將PVDF轉印膜以TBST清洗三次后，再加入含二級抗體goat anti-rabbit IgG (Perkin elmer)的TBST(1:10000)，于室溫下進行次級反應一小時。最后 以 TBST 清洗三次后，加入 ECL(enhanced chemiluminescence)呈色。
[0033] 結果
[0034] 如圖1所示，分別以3μΜ及10μΜ之N-烯丙基次波爾定堿處理C2C12細胞5分 鐘后，其增進AMPK磷酸化之功效分別為對照組的2. 34及2. 51倍，而在處理C2C12細胞15 分鐘后，其亦可增進AMPK磷酸化的功效分別達對照組的1. 38及2. 79倍，顯示N-烯丙基 次波爾定堿在促進AMPK活性上具有優異的功效。
[0035] 由實施例結果可知，次阿樸啡生物堿衍生物在促進AMPK活性上具有優異的功效。 其中N-烯丙基次波爾定堿于增進AMPK活性上，3 μ Μ的N-烯丙基次波爾定堿于5分鐘時 即具有相當佳的功效，而10 μ Μ的Ν-烯丙基次波爾定堿則于15分鐘時呈現最佳功效。
【主權項】
1. 一種次阿樸啡生物堿衍生物用于制備具有活化磷酸化腺苷酸依賴蛋白激酶（AMPK) 功效的藥物的用途，其中該次阿樸啡生物堿衍生物具有下式I或其醫藥上可接受的鹽：其中&、R2及R3各獨立為Η及烷基；R4為H、烷基、丙烯基（_CH2CHCH2)或芐基。2. 如權利要求1所述的用途，其中該次阿樸啡生物堿衍生物為N-烯丙基次波爾定堿 (N-allylsecoboldine)或其醫藥上可接受的鹽。3. -種次阿樸啡生物堿衍生物用于制備治療AMPK相關疾病的藥物的用途，其中該具 式I或其醫藥上可接受的鹽的次阿樸啡生物堿衍生物為權利要求1至2中任一項的定義。4. 如權利要求3所述的用途，其中該AMPK相關疾病為癌癥。5. 如權利要求1所述的用途，其中該藥物具有抗發炎或促進傷口愈合之功效。
【專利摘要】本發明公開一種次阿樸啡生物堿衍生物用于制備具有活化磷酸化腺苷酸依賴蛋白激酶(AMPK)功效的藥物的用途,其中該次阿樸啡生物堿衍生物可為N-烯丙基次波爾定堿(N-allylsecoboldine)。其中該藥物可以活化AMPK,因而可用于調節細胞生長及代謝,及治療AMPK相關疾病。
【IPC分類】A61K31/137, A61P17/02, A61P35/00, C07C213/02, A61P29/00, C07C217/60
【公開號】CN105287461
【申請號】CN201410240262
【發明人】李水盛, 蘇銘嘉, 葉集煥, 蔡政諺, 阮琪惇, 徐兆民
【申請人】資元堂生物科技股份有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2014年5月30日
【公告號】WO2015180481A1