百合花提取物在制備治療神經系統疾病及肌無力疾病藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種百合花提取物的新用途，即百合花提取物在制備治療老年癡呆、腦卒中、精神分裂癥等神經系統疾病，及重癥肌無力、進行性肌營養不良等肌無力疾病的藥物中的應用。本發明首次將百合花提取物用于制備治療老年癡呆、腦卒中、精神分裂癥等神經系統疾病，及重癥肌無力、進行性肌營養不良等肌無力疾病的藥物，能夠有效抑制老年癡呆、腦卒中、精神分裂癥、重癥肌無力、進行性肌營養不良。
【專利說明】百合花提取物在制備治療神經系統疾病及肌無力疾病藥物中的應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥【技術領域】，特別涉及百合花提取物在制備神經系統疾病及肌無力疾病藥物中的應用。
技術背景
[0002]神經系統疾病包括老年癡呆、腦卒中、精神分裂癥。老年癡呆是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病。臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、視空間技能損害、執行功能障礙以及人格和行為改變等全面性癡呆表現為特征，病因迄今未明。其患病率隨年齡增高而增高，在65歲以上人群中約為5%，85歲以上人群中約20%。本病常散發，女性多于男性，女性患者的病程常較男性患者長。隨著人口的老齡化，其發病率逐年上升，嚴重危害老年人的身心健康和生活質量，已成為嚴重的社會問題，引起各國政府和醫學界的普遍關注。目前主要有以下幾種治療藥物:(I)干擾Αβ形成和沉積的藥物；(2)膽堿能類藥物；(3)谷氨酸受體調控劑；(4)影響自由基代謝的藥物；(5)腦代謝調節劑。
[0003]腦卒中是一種突然起病的腦血液循環障礙性疾病是指在腦血管疾病的病人，因各種誘發因素引起腦內動脈狹窄，閉塞或破裂，而造成急性腦血液循環障礙，臨床上表現為一過性或永久性腦功能障礙的癥狀和體征。腦卒中是當前老年人致殘致癡的主要原因之一，據WHO公布的資料，在57個國家中，有40個國家把腦卒中的死亡率列入了前三位，其中在日本和中國卒中的死亡率已占首位。而缺血性腦卒中占腦卒中病人總數的60%-70%。目前臨床常用治療策略如下:(I)溶栓劑；(2)神經保護劑；(3)干細胞療法。
[0004]精神分裂癥是一組病因未明的功能性的精神疾病，多在青壯年緩慢或亞急性起病，臨床上往往表現為癥狀各異的綜合征，涉及感知覺、思維、情感和行為等多方面的障礙以及精神活動的不協調。2004年WHO的調查結果顯示，全球精神分裂癥患病率為4%。。衛生部提供的資料顯示，2002年我國重性精神疾病患者約1600萬人，其中精神分裂癥患者約780多萬人。精神分裂癥起病早，對患者的認知、生活和社會功能帶來嚴重影響，給患者家庭造成沉重負擔，并可能引發許多社會問題。目前用于臨床的抗精神病藥物主要分為兩大類:
(I)典型抗精神病藥；(2)非典型抗精神病藥。
[0005]肌無力疾病包括重癥肌無力、進行性肌營養不良。重癥肌無力是一種由神經-肌肉接頭處傳遞功能障礙所引起的自身免疫性疾病，臨床主要表現為部分或全身骨骼肌無力和易疲勞，活動后癥狀加重，經休息后癥狀減輕。患病率為77?150/100萬，年發病率為4?11/100萬。女性患病率大于男性，約3:2，各年齡段均有發病，兒童I?5歲居多。隨著人們對重癥肌無力發病機制研宄的深入，雖取得了巨大進展，但至今尚無公認的標準治療方案。目前常用治療藥物主要有:(I)膽堿酯酶抑制劑；(2)免疫抑制；(3)血漿置換；(4)靜脈注射免疫球蛋白；(5)中醫藥治療。
[0006]進行性肌營養不良癥是一組由遺傳因素所致的原發性骨骼肌疾病，其臨床主要表現為緩慢進行的肌肉萎縮，肌無力及不同程度的運動障礙。本病可由多種遺傳方式引起，其臨床表現各具有不同的特點，因而形成許多類型。對其病因的研宄已為世人所矚目，數十年來，相繼提出的有血管性，神經性，肌纖維再生錯亂和細胞膜缺陷等學說，但大量的研宄證據表明細胞膜缺陷在本病發生有重要地位，三分之一新生男嬰患兒是由于基因突變所引起。該病迄今尚無特效的治療方法，目前臨床上只能采取對癥療法及一般支持療法，包括應用維生素E、肌苷、加蘭他敏、三磷腺苷、苯丙酸諾龍以及中藥等。適當的功能鍛煉，進行各關節充分被動運動，針灸、推拿、按摩等均可延緩更嚴重的肌無力、肌萎縮和關節攣縮的發生。
[0007]然而，現有技術中并沒有將百合花提取物用于治療老年癡呆、腦卒中、精神分裂癥等神經系統疾病，及重癥肌無力、進行性肌營養不良等肌無力疾病的報道。


【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供一種百合花提取物的新用途，即百合花提取物在制備治療神經系統疾病及肌無力疾病藥物中的應用。
[0009] 申請人:在研宄中發現了百合花提取物具有改善神經系統疾病及肌無力疾病的作用，可以顯著提高患者的生存質量。
[0010]經試驗研宄發現，本發明的應用中，神經系統性疾病為老年癡呆、腦卒中和精神分裂癥；肌無力疾病為重癥肌無力和進行性肌營養不良；百合花提取物在改善上述疾病的過程中，是作為乙酰膽堿酯酶抑制劑使用的。
[0011]本發明的應用中，百合花提取物是將百合花經溶劑提取得得到的，所述溶劑為乙醇、蒸餾水或者石油醚。
[0012]進一步，本發明的應用中，溶劑為乙醇，百合花提取物為百合花醇提物；
[0013]百合花醇提物是按如下方法制得的:
[0014]將百合花按固液比為1:5-15加入濃度為50-95%的乙醇，提取1_3次，每次提取l_3h，提取液合并，過濾，濃縮，即得百合花醇提物。
[0015]進一步，本發明的應用中，溶劑為蒸餾水，百合花提取物為百合花水提物；
[0016]百合花水提物是按如下方法制得的:
[0017]將百合花按固液比為1:5-15加入蒸餾水，提取1-3次，每次提取l_3h，提取液合并，過濾，濃縮，即得百合花水提物。
[0018]進一步，本發明的應用中，溶劑為石油醚，百合花提取物為百合花石油醚提取物；
[0019]百合花石油醚提取物是按如下方法制得的:
[0020]將百合花按固液比為1:5-15加入石油醚，提取1-3次，每次提取l_3h，提取液合并，過濾，濃縮，然后加乙醇稀釋，即得百合花石油醚提物。
[0021]本發明的應用中，將百合花提取物制成口服制劑，口服制劑由以下重量份的成分制得:
[0022]80-120重量份的百合花制得的百合花提取物；
[0023]30-40重量份的淀粉；
[0024]70-80重量份的糊精；
[0025]1-3重量份的硬脂酸鎂；
[0026]4-8重量份的滑石粉；
[0027]8-12重量份的乙醇。
[0028]進一步，口服制劑由以下重量份的成分制得:
[0029]100重量份的百合花制得的百合花提取物；
[0030]35重量份的淀粉；
[0031]75重量份的糊精；
[0032]2重量份的硬脂酸鎂；
[0033]6重量份的滑石粉；
[0034]10重量份的乙醇。
[0035]進一步，口服制劑為片劑或膠囊劑。
[0036]口服制劑為片劑時，按如下方法制得:
[0037]I)按照重量份數比為80-120:30-40:70-80:1-3:4-8:8-12準備百合花、淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇；
[0038]2)將步驟I)得到的百合花制成百合花提取物；
[0039]3)將步驟2)得到的百合花提取物進一步濃縮成密度為1.20-1.25的浸膏，加入步驟I)得到的淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇，攪拌混合制軟粒；
[0040]4)將步驟3)得到的軟粒壓片，即得片劑，每片含百合花提取物lOOmg。
[0041]口服制劑為膠囊劑時，按如下方法制得:
[0042]I)按照重量份數比為80-120:30-40:70-80:1-3:4-8:8-12準備百合花、淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇；
[0043]2)將步驟I)得到的百合花制成百合花提取物；
[0044]3)將步驟2)得到的百合花提取物進一步濃縮成密度為1.20-1.25的浸膏，加入步驟I)得到的淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇，攪拌混合制軟粒；
[0045]4)將步驟3)得到的軟粒灌裝膠囊，即得膠囊劑，每顆膠囊含百合花提取物lOOmg。
[0046]本發明的應用中，將百合花提取物制成注射制劑，注射制劑由以下重量份的成分制得:
[0047]80-120重量份的百合花制得的百合花提取物；
[0048]與百合花的固液比為1:5-15的注射用水。
[0049]進一步，注射制劑由以下重量份的成分制得:
[0050]100重量份的百合花制得的百合花提取物；
[0051]與百合花的固液比為1:10的注射用水。
[0052]進一步，注射制劑按如下方法制得:
[0053]I)稱取百合花；
[0054]2)將步驟I)得到的百合花制成百合花提取物；
[0055]3)將將步驟2)得到的百合花提取物冷藏后去雜質，過濾，加入注射用水得溶液，所述步驟I)得到的百合花與所述溶液的固液比為1:5-15，將所述溶液冷藏過夜，解凍，抽濾，濾液調節PH到5.8?6.2，然后加入活性炭脫色，室溫下靜置，精濾，灌封，滅菌分裝，地注射劑，每支注射劑含百合花醇提物200mg。
[0056]經過大量的動物試驗確定了百合花提取物的有效使用劑量。
[0057]百合花提取物的用量為0.1-0.5g/kgo
[0058]百合花提取物的用量為0.1-0.5g/kg時，對各種疾病的改善效果更好。
[0059]本發明首次將百合花提取物用于制備治療老年癡呆、腦卒中、精神分裂癥、重癥肌無力、進行性肌營養不良的藥物中，能夠有效改善老年癡呆、腦卒中、精神分裂癥、重癥肌無力、進行性肌營養不良等癥狀；提高患者的生活質量。

【具體實施方式】
[0060]下面結合實施例對本發明作進一步說明:
[0061]實施例1百合花醇提物
[0062]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加95%乙醇100ml提取2次，每次提取2h，提取液合并，過濾，濃縮至100ml，即得百合花醇提物。
[0063]實施例2百合花醇提物
[0064]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加50%乙醇500ml提取3h，提取液過濾，濃縮至100ml，即得百合花醇提物。
[0065]實施例3百合花醇提物
[0066]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加75%乙醇1500ml提取3次，每次提取lh，提取液合并，過濾，濃縮至100ml，即得百合花醇提物。
[0067]實施例4百合花水提物
[0068]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加蒸餾水1000ml煎煮2次，每次煎煮2h，煎煮液合并，過濾，濃縮，即得百合花水提物。
[0069]實施例5百合花水提物
[0070]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加蒸餾水500ml煎煮3h，煎煮液過濾，濃縮，即得百合花水提物。
[0071]實施例6百合花水提物
[0072]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加蒸餾水1500ml煎煮3次，每次煎煮lh，煎煮液合并，過濾，濃縮，即得百合花水提物。
[0073]實施例7百合花石油醚提取物
[0074]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加石油醚1000ml提取2次，每次2h，提取液合并，過濾，濃縮至50ml，加乙醇稀釋至300ml，即得百合花石油醚提取物。
[0075]實施例8百合花石油醚提取物
[0076]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加石油醚500ml提取3h，過濾，濃縮至50ml，加乙醇稀釋至300ml，即得百合花石油醚提取物。
[0077]實施例9百合花石油醚提取物
[0078]制備方法:稱取百合花100g，粉碎，加石油醚1500ml提取2次，每次2h，提取液合并，過濾，濃縮至50ml，加乙醇稀釋至300ml，即得百合花石油醚提取物。
[0079]實施例10片劑
[0080]處方:100g百合花制得的百合花醇提物；
[0081]35g 淀粉；
[0082]75g 糊精；
[0083]2g硬脂酸鎂；
[0084]6g滑石粉；
[0085]1g 乙醇。
[0086]制備方法:
[0087]I)按處方量準備各原料；
[0088]2)將處方量的百合花按照實施例1的方法制成百合花醇提物；
[0089]3)將步驟2)得到的百合花醇提物進一步濃縮成密度為1.20的浸膏，加入處方量的淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇，攪拌混合制軟粒；
[0090]4)將步驟3)得到的軟粒壓片，即得片劑，每片含百合花提取物lOOmg。
[0091]實施例11片劑
[0092]處方:80g百合花制得的百合花水提物；
[0093]30g 淀粉；
[0094]70g 糊精；
[0095]3g硬脂酸鎂；
[0096]8g滑石粉；
[0097]12g 乙醇。
[0098]制備方法:
[0099]I)按處方量準備各原料；
[0100]2)將處方量的百合花按照實施例5的方法制成百合花水提物；
[0101]3)將步驟2)得到的百合花水提物進一步濃縮成密度為1.25的浸膏，加入處方量的淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇，攪拌混合制軟粒；
[0102]4)將步驟3)得到的軟粒壓片，即得片劑，每片含百合花提取物lOOmg。
[0103]實施例12片劑
[0104]處方:120g百合花制得的百合花石油醚提取物；
[0105]40g 淀粉；
[0106]80g 糊精；
[0107]Ig硬脂酸鎂；
[0108]4g滑石粉；
[0109]8g 乙醇。
[0110]制備方法:
[0111]I)按處方量準備各原料；
[0112]2)將處方量的百合花按照實施例9的方法制成百合花石油醚提取物；
[0113]3)將步驟2)得到的百合花石油醚提取物進一步濃縮成密度為1.25的浸膏，加入處方量的淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇，攪拌混合制軟粒；
[0114]4)將步驟3)得到的軟粒壓片，即得片劑，每片含百合花提取物lOOmg。
[0115]實施例13膠囊劑
[0116]處方:100g百合花制得的百合花水提物；
[0117]35g 淀粉；
[0118]75g 糊精；
[0119]2g硬脂酸鎂；
[0120]6g滑石粉；
[0121]1g 乙醇。
[0122]制備方法:
[0123]I)按處方量準備各原料；
[0124]2)將處方量的百合花按照實施例4的方法制成百合花水提物；
[0125]3)將步驟2)得到的百合花醇提物進一步濃縮成密度為1.20的浸膏，加入處方量的淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇，攪拌混合制軟粒；
[0126]4)將步驟3)得到的軟粒灌裝膠囊，即得膠囊劑，每顆膠囊含百合花提取物lOOmg。
[0127]實施例14膠囊劑
[0128]處方:80g百合花制得的百合花醇提物；
[0129]30g 淀粉；
[0130]70g 糊精；
[0131]3g硬脂酸鎂；
[0132]8g滑石粉；
[0133]12g 乙醇。
[0134]制備方法:
[0135]I)按處方量準備各原料；
[0136]2)將處方量的百合花按照實施例2的方法制成百合花醇提物；
[0137]3)將步驟2)得到的百合花醇提物進一步濃縮成密度為1.25的浸膏，加入處方量的淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇，攪拌混合制軟粒；
[0138]4)將步驟3)得到的軟粒灌裝膠囊，即得膠囊劑，每顆膠囊含百合花提取物lOOmg。
[0139]實施例15膠囊劑
[0140]處方:120g百合花制得的百合花石油醚提取物；
[0141]40g 淀粉；
[0142]80g 糊精；
[0143]Ig硬脂酸鎂；
[0144]4g滑石粉；
[0145]8g 乙醇。
[0146]制備方法:
[0147]I)按處方量準備各原料；
[0148]2)將處方量的百合花按照實施例8的方法制成百合花石油醚提取物；
[0149]3)將步驟2)得到的百合花石油醚提取物進一步濃縮成密度為1.20的浸膏，加入處方量的淀粉、糊精、硬脂酸鎂、滑石粉、和70%乙醇，攪拌混合制軟粒；
[0150]4)將步驟3)得到的軟粒灌裝膠囊，即得膠囊劑，每顆膠囊含百合花提取物lOOmg。
[0151]實施例16注射制劑
[0152]處方:100g百合花制得的百合花石油醚提取物；
[0153]1000ml 注射用水。
[0154]制備方法:
[0155]I)按處方量準備各原料；
[0156]2)將處方量的百合花按照實施例7的方法制成百合花石油醚提取物；
[0157]3)將步驟2)得到的百合花石油醚提取物冷藏后去雜質，過濾，加入處方量的注射用水得溶液，將所述溶液冷藏過夜，解凍，抽濾，濾液調節PH到6.0，然后加入活性炭脫色，室溫下靜置，精濾，灌封，滅菌分裝，地注射劑，每支注射劑含百合花醇提物200mg。
[0158]實施例17注射制劑
[0159]處方:80g百合花制得的百合花醇提物；
[0160]1200ml 注射用水。
[0161]制備方法:
[0162]I)按處方量準備各原料；
[0163]2)將處方量的百合花按照實施例3的方法制成百合花醇提物；
[0164]3)將步驟2)得到的百合花醇提物冷藏后去雜質，過濾，加入處方量的注射用水得溶液，將所述溶液冷藏過夜，解凍，抽濾，濾液調節PH到5.8，然后加入活性炭脫色，室溫下靜置，精濾，灌封，滅菌分裝，地注射劑，每支注射劑含百合花醇提物200mg。
[0165]實施例18注射制劑
[0166]處方:120g百合花制得的百合花石油醚提取物；
[0167]600ml注射用水。
[0168]制備方法:
[0169]I)按處方量準備各原料；
[0170]2)將處方量的百合花按照實施例6的方法制成百合花水提物；
[0171]3)將步驟2)得到的百合花水提物冷藏后去雜質，過濾，加入處方量的注射用水得溶液，將所述溶液冷藏過夜，解凍，抽濾，濾液調節PH到6.2，然后加入活性炭脫色，室溫下靜置，精濾，灌封，滅菌分裝，地注射劑，每支注射劑含百合花醇提物200mg。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0172]圖1為三種不同的百合花提取物對乙酰膽堿酯酶的體外抑制作用；
[0173]圖2為試驗例2中各組小鼠在定位航行試驗中尋找原平臺的運動軌跡；
[0174]圖3為試驗例3中三種不同的百合花提取物、依達拉奉對缺血大鼠腦梗死保護作用的比較。
[0175]藥效學試驗
[0176]試驗例I百合花提取物對乙酰膽堿酯酶的體外抑制試驗
[0177]一、材料和動物
[0178]1、受試樣品:
[0179]樣品Al:50mg/ml的百合花水提物；
[0180]樣品A2:100mg/ml的百合花水提物；
[0181]樣品A3:50mg/ml的百合花醇提物；
[0182]樣品A4:100mg/ml的百合花醇提物；
[0183]樣品A5:50mg/ml的百合花石油醚提取物；
[0184]樣品A6:100mg/ml的百合花石油醚提取物；
[0185]對照品B:0.01mg/ml加蘭他敏(陽性藥)。
[0186]2、試驗體系:140 μ L 0.lmol/L PBS (pH 8.0)。
[0187]二、試驗方法:
[0188]采用改良的Ellman體外酶活性篩選方法進行，利用經典的反應體系140 μ L0.lmol/L PBS (pH 8.0)，20 μ L待測樣品溶液(分別為樣品Al、樣品A2、樣品A3、樣品Α4、樣品Α5、樣品Α6、對照品B)，20 μ L乙酰膽堿酯酶溶液，依次加入96孔板中，震蕩混勻，4°C培養20分鐘。然后加10 μ L 0.0lM的DTNB，最后通過加10 μ L 0.075Μ的ATCI開始反應。37°C培養20分鐘后，用酶標儀在405nm下測量吸光度(A)并根據下式計算抑制率。
[0189]抑制率) = [1-(A試驗-A試驗對照)/(A空白-A空白對照)]X 100%。
[0190]三、試驗效果
[0191]如圖1所示，百合花水提物50mg/ml、100mg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率分別為35.86%,73.08% ;百合花醇提物50mg/ml、100mg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率分別為74.17%,91.73% ;百合花石油醚提取物50mg/ml、100mg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率分別為78.64%,79.47% ;加蘭他敏(陽性藥)0.01mg/ml乙酰膽堿酯酶抑制率為46.28 0Z0o表明百合花水提、醇提、石油醚提取物均有一定的抗乙酰膽堿酯酶作用，其中醇提物抑制活性最強。
[0192]試驗例2百合花提取物對老年癡呆的改善試驗
[0193]一、材料和動物
[0194]1、受試樣品:
[0195]樣品1:百合花醇提物；
[0196]樣品2:百合花水提物；
[0197]樣品3:百合花石油醚提取物；
[0198]對照品:加蘭他敏(臨床用老年癡呆藥物)。
[0199]2、動物:小鼠為SPF級SD雄性大鼠，體重200-220g ;武漢大學動物試驗中心提供，動物合格證號為N0.00014833，生產許可證號:SCXK (鄂)2008-2004。鼠飼料，購于武漢大學試驗動物中心。
[0200]二、試驗方法:
[0201]1.動物模型建立:
[0202]小鼠隨機分組:正常組，即對照組I ;模型組，即對照組2 ;模型+加蘭他敏組，即對照組3 ;模型+百合花醇提物組，即試驗組I ;模型+百合花水提物組，即試驗組2 ;模型+百合花石油醚提取物組，即試驗組3。
[0203]除正常組外，其余各組均經口給藥，每日I次，連續21天；且第16天開始，除正常組外的各組均于實驗前30min給予腹腔注射3mg/kg氫溴酸東莨菪堿，制備小鼠學習記憶障礙癡呆模型。
[0204]2.Morris水迷宮測試！Morris水迷宮主體為直徑100cm，高35cm的圓形水池，水池內加入奶粉使水不透明，且將迷宮均分為4個象限，水溫保持在(25±2)°C。另有一個白色圓形平臺(直徑9cm，高29cm)，置于某一象限中央，位于水面下l-2cm，迷宮上方安置著連接顯示系統的攝像機，同步記錄小鼠運動軌跡。測試方法參照文獻進行。第16天開始進行定位航行實驗，歷時5天，每天I次。將小鼠面向池壁放入水中，記錄其在120s內找到平臺的時間(逃避潛伏期)。超過120s找不到平臺，可引導其找到平臺并在平臺上滯留10s，逃避潛伏期記成120s。第21天上午進行空間探索實驗，撤除平臺，將小鼠隨機從某一象限面向池壁放入水中，記錄120s內小鼠尋找原平臺的運動軌跡。
[0205]3.生物化學檢測:行為學實驗測試結束后，處死小鼠，迅速取出腦組織，用生理鹽水制成10%勻漿，放入低溫離心機中，3000r/min 4°C離心lOmin，取上清液裝入試管中冷凍備用，按照試劑盒說明書進行ACh、AChE的測定。
[0206]試驗組1:模型小鼠，經口給予百合花醇提物0.5g/kg，連續21天，于第16天開始進行Morris水迷宮測試，并記錄其逃避潛伏期及尋找原平臺的運動軌跡。行為學試驗測試結束后，按照生物化學檢測方法，進行乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)的測定；
[0207]試驗組2:除將給予百合花醇提物0.5g/kg替換為給予百合花水提物0.5g/kg外，其余均與試驗組I相同；
[0208]試驗組3:除將給予百合花醇提物0.5g/kg替換為給予百合花石油醚提取物0.5g/kg外，其余均與試驗組I相同；
[0209]對照組1:正常小鼠，不給予藥物，進行Morris水迷宮測試，并記錄其逃避潛伏期及尋找原平臺的運動軌跡。行為學試驗測試結束后，按照生物化學檢測方法，進行乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿醋酶(AChE)的測定；
[0210]對照組2:模型小鼠，不給予藥物，進行Morris水迷宮測試，并記錄其逃避潛伏期及尋找原平臺的運動軌跡。行為學試驗測試結束后，按照生物化學檢測方法，進行乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿醋酶(AChE)的測定；
[0211]對照組3:除將給予百合花醇提物0.5g/kg替換為給予加蘭他敏2mg/kg外，其余均與試驗組I相同。
[0212]三、試驗結果
[0213]結果顯示，對照組I中，正常小鼠，逃避潛伏期為17.38±7.97s，ACh含量為39.39±2.50pmol/mg prot, AChE 活性為 0.67±0.19U/mg prot ；
[0214]對照組2中，未給藥的模型小鼠，逃避潛伏期為34.25±5.52s，ACh含量為25.61 ±3.20pmol/mg prot, AChE 活性為 1.35±0.24U/mg prot ；
[0215]試驗組I中，模型小鼠給予百合花醇提物0.5g/kg，逃避潛伏期為23.25±5.85s，ACh 含量為 35.12±3.87pmol/mg prot, AChE 活性為 0.81 ±0.38U/mg prot ；
[0216]試驗組2中，模型小鼠給予百合花水提物0.5g/kg，逃避潛伏期為25.62±4.89s，ACh 含量為 33.08±6.llpmol/mg prot，AChE 活性為 1.07±0.41U/mg prot ；
[0217]試驗組3中，模型小鼠給予百合花石油醚提取物0.5g/kg，逃避潛伏期為29.33±6.74，ACh 含量為 30.95±5.llpmol/mg prot, AChE 活性為 1.18±0.32U/mg prot ；
[0218]對照組3中，模型小鼠給予加蘭他敏2mg/kg，逃避潛伏期為19.84±4.23s,ACh含量為 37.85± 1.83pmol/mg prot，AChE 活性為 0.72±0.56U/mg proto
[0219]各組小鼠在第五天的游泳路徑，如圖2所示。表明百合花提取物能夠顯著改善東莨菪堿所致小鼠的記憶獲得性障礙作用，并能有效拮抗東莨菪堿引起的腦內乙酰膽堿酯酶活力增高。通過對乙酰膽堿酯酶活性的抑制，從而達到抗老年癡呆的作用。
[0220]試驗例3百合花提取物對腦卒中的改善試驗
[0221]一、材料和動物
[0222]1、受試樣品:
[0223]樣品1:百合花醇提物；
[0224]樣品2:百合花水提物；
[0225]樣品3:百合花石油醚提取物；
[0226]對照品:依達拉奉(臨床用抗腦卒中藥物)。
[0227]2、動物:小鼠為SPF級SD雄性大鼠，體重200_220g ;武漢大學動物試驗中心提供，動物合格證號為N0.00014833，生產許可證號:SCXK (鄂)2008-2004。鼠飼料，購于武漢大學試驗動物中心。
[0228]二、試驗方法:
[0229]1.動物模型建立:
[0230]大鼠隨機分組:假手術組，即對照組I ;模型組，即對照組2 ;模型+依達拉奉組，即對照組3 ;模型+百合花醇提物組，即試驗組I ;模型+百合花水提物組，即試驗組2 ;模型+百合花石油醚提取物組，即試驗組3。
[0231 ] 依據改良線栓MCAo模型建立腦缺血模型，除假手術組外，其余各組大鼠用10 %水合氯醛(3.5ml/kg)靜脈注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，在CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部約4_處剪一小口，將拴線插入CCA后進入ICA，直至顱底，越過MCA的起始部，到達大腦前動脈(ACA)的近端，這時用繞在CCA遠心端的細線輕輕系牢拴線。縫合傷口，單籠飼養觀察。2h后拔線栓實現再灌注。
[0232]假手術組大鼠用10%水合氯醛(3.5ml/kg)靜脈注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)后縫合上后即可。
[0233]2.檢測指標:
[0234](I)神經行為學評分:
[0235]麻醉蘇醒后，由一不了解分組情況的觀察者進行神經行為學評分。將動物放回鼠籠，自由飲食.腦缺血再灌注后24h，由不了解分組情況的第二位觀察者評估記錄神經行為學評分，按Zea-Longa等的6級評分法:0級，無功能障礙；1級，不能伸展左側前肢；2級，向左側旋轉；3級，向左側傾倒；4級，無自主活動伴意識抑制；5級，死亡。
[0236](2) TTC 染色:
[0237]動物于栓塞后24h，麻醉，取腦。一 20度冰箱中速凍30分鐘左右，切片:切成8-10片，每隔1.5mm切一片。切片置于2% TTC染色劑(2g溶于10mlPBS緩沖液)中，用錫箔紙蓋住后，放入370°C溫箱30min，不時翻動腦片，使均勻接觸到染色液。染色后掃描儀掃描切片，用image pro plus圖像處理軟件計算梗死體積；
[0238]梗死體積=[(VC - VL) /V C]，VC是對照半球體積，VL是損傷半球非梗死體積。
[0239]試驗組1:模型小鼠，經口給予百合花醇提物0.5g/kg，于缺血后2小時，一次給予上述藥物，采用6分法進行行為學評分。于24h后，處死動物，取腦，TTC染色后，計算梗死體積；
[0240]試驗組2:除將給予百合花醇提物0.5g/kg替換為給予百合花水提物0.5g/kg外，其余均與試驗組I相同；
[0241 ] 試驗組3:除將給予百合花醇提物0.5g/kg替換為給予百合花石油醚提取物0.5g/kg外，其余均與試驗組I相同；
[0242]對照組1:假手術組小鼠，不給予藥物，其他與試驗組I相同；
[0243]對照組2:模型小鼠，不給予藥物，其他與試驗組I相同；
[0244]對照組3:除將給予百合花水提物0.5g/kg替換為給予依達拉奉6mg/kg外，其余均與試驗組I相同。
[0245]三、試驗結果
[0246]結果顯示，對照組I中，未給藥的假手術組小鼠，梗死體積為0.0110±0.004，行為學評分為0.85±0.11 ;
[0247]對照組2中，未給藥的模型小鼠，梗死體積為0.3241±0.079，行為學評分為
3.43±0.52 ；
[0248]對照組3中，模型小鼠給予依達拉奉6mg/kg，，梗死體積為0.1428±0.066，行為學評分為 2.35 ± 0.14 ；
[0249]試驗組I中，模型小鼠給予百合花醇提物0.5g/kg，梗死體積為0.1012±0.044，行為學評分為2.09 ± 0.45 ；
[0250]試驗組2中，模型小鼠給予百合花水提物0.5g/kg，梗死體積為0.0765±0.032，行為學評分為1.46±0.23 ；
[0251]試驗組3中，模型小鼠給予百合花石油醚提取物0.5g/kg，梗死體積為
0.1872±0.067，行為學評分為 2.67±0.34。
[0252]各組小鼠腦梗死體積，如圖3所示。表明百合花提取物可改善腦卒中，且百合花水提物和百合花醇提物的作用明顯優于其他現有文獻報道的化合物或現有臨床使用藥物。
[0253]試驗例4百合花提取物對精神分裂癥的改善試驗
[0254]—、材料和動物
[0255]1、受試樣品:
[0256]樣品1:百合花醇提物；
[0257]樣品2:百合花水提物；
[0258]樣品3:百合花石油醚提取物；
[0259]對照品:氯丙嗪(臨床用抗精神分裂癥藥物)。
[0260]2、動物:采用苯丙胺誘導的精神分裂模型的小鼠。小鼠為SPF級SD雄性大鼠，體重200-220g ;武漢大學動物試驗中心提供，動物合格證號為N0.00014833，生產許可證號:SCXK(鄂)2008-2004。鼠飼料，購于武漢大學試驗動物中心。
[0261]二、試驗方法:
[0262]試驗組1:采用苯丙胺誘導的精神分裂模型的小鼠，經口給予百合花醇提物0.5g/kg，連續7天，進行曠場試驗及5分法刻板行為評分；
[0263]試驗組2:除將給予百合花醇提物0.5g/kg替換為給予百合花水提物0.5g/kg外，其余均與試驗組I相同；
[0264]試驗組3:除將給予百合花醇提物0.5g/kg替換為給予百合花石油醚提取物0.5g/kg外，其余均與試驗組I相同；
[0265]對照組1:正常小鼠，不給予藥物，其他與試驗組I相同；
[0266]對照組2:采用苯丙胺誘導的精神分裂模型的小鼠，不給予藥物，其他與試驗組I相同；
[0267]對照組3:除將經口給予百合花醇提物0.5g/kg替換為腹腔注射氯丙嗪4mg/kg夕卜，其余均與試驗組I相同。
[0268]三、試驗結果
[0269]結果顯示，對照組I中，正常小鼠，穿格次數為231.48±28.53，刻板行為評分為
1.45±0.42 ；
[0270]對照組2中，未給藥的模型小鼠，穿格次數為331.48±18.53，刻板行為評分為
2.85±0.12 ；
[0271]試驗組I中，模型小鼠給予百合花醇提物0.5g/kg，穿格次數為257.16±25.14，刻板行為評分為2.05 ± 0.36 ；
[0272]試驗組2中，模型小鼠給予百合花水提物0.5g/kg，穿格次數為242.33±23.48，刻板行為評分為1.86±0.27 ；
[0273]試驗組3中，模型小鼠給予百合花石油醚提取物0.5g/kg，穿格次數為286.75 ±30.01，刻板行為評分為 2.42 ± 0.55 ；
[0274]對照組3中，模型小鼠給予依達拉奉6mg/kg，穿格次數為240.33± 13.99，刻板行為評分為1.78±0.10。
[0275]表明百合花提取物能增加自主性活動，減輕刻板行為，改善精神分裂癥狀。
[0276]試驗例5百合花提取物對重癥肌無力的改善試驗
[0277]一、材料和動物
[0278]1、受試樣品:
[0279]樣品1:百合花醇提物；
[0280]樣品2:百合花水提物；
[0281]樣品3:百合花石油醚提取物。
[0282]2、動物:采用試驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型的小鼠。小鼠為SPF級SD雄性大鼠，體重200-220g ;武漢大學動物試驗中心提供，動物合格證號為N0.00014833，生產許可證號:SCXK(鄂)2008-2004。鼠飼料，購于武漢大學試驗動物中心。
[0283]二、試驗方法:
[0284]試驗組11:采用試驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型的小鼠，于免疫后第10天，每日灌胃給藥治療，給予百合花醇提物0.lg/kg，直至大鼠發病高峰期第40天。使用流式細胞儀檢測大鼠淋巴結中TNF-a+淋巴細胞的百分比；酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清中R97-116IgG2a和IgG2b抗體的水平；
[0285]試驗組12:百合花醇提物的用量為0.5g/kg，其他均與試驗組I相同；
[0286]試驗組21:除將給予百合花醇提物0.lg/kg替換為給予百合花水提物0.lg/kg夕卜，其余均與試驗組I相同；
[0287]試驗組22:除將給予百合花醇提物0.lg/kg替換為給予百合花水提物0.5g/kg夕卜，其余均與試驗組I相同；
[0288]試驗組31:除將給予百合花醇提物0.lg/kg替換為給予百合花石油醚提取物0.lg/kg外，其余均與試驗組I相同；
[0289]試驗組32:除將給予百合花醇提物0.lg/kg替換為給予百合花石油醚提取物0.5g/kg外，其余均與試驗組I相同；
[0290]對照組1:采用試驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型的小鼠，不給予藥物，其他與試驗組I相同；
[0291]對照組2:采用正常小鼠，不給予藥物，其他與試驗組I相同。
[0292]三、試驗結果
[0293]結果顯示，
[0294]對照組I中，未給藥的模型小鼠，TNF-a+淋巴細胞的百分比為(4.91±0.31) %，R97-116IgG2a 抗體水平為 0.192 ±0.004，R97_116IgG2b 抗體水平為 0.536 ±0.044 ；
[0295]對照組2中，正常小鼠，TNF-a+淋巴細胞的百分比為(2.75±0.22) %，R97-116IgG2a 抗體水平為 0.143±0.002，R97_116IgG2b 抗體水平為 0.189±0.032 ；
[0296]試驗組11中，模型小鼠給予百合花醇提物0.lg/kg, TNF-a+淋巴細胞的百分比為(4.45±0.35)%，R97-116IgG2a 抗體水平為 0.187±0.006，R97_116IgG2b 抗體水平為0.473±0.021 ；
[0297]試驗組12中，模型小鼠給予百合花醇提物0.5g/kg，TNF-a+淋巴細胞的百分比為(3.53±0.61)%，R97-116IgG2a 抗體水平為 0.166±0.010，R97_116IgG2b 抗體水平為0.312±0.018 ；
[0298]試驗組21中，模型小鼠給予百合花水提物0.lg/kg, TNF-a+淋巴細胞的百分比為(4.77±0.55)%，R97-116IgG2a 抗體水平為 0.190±0.003，R97_116IgG2b 抗體水平為0.485±0.030 ；
[0299]試驗組22中，模型小鼠給予百合花水提物0.5g/kg，TNF_a+淋巴細胞的百分比為(3.69±0.41) %，R97-116IgG2a 抗體水平為 0.171±0.008，R97_116IgG2b 抗體水平為0.338±0.025 ；
[0300]試驗組31中，模型小鼠給予百合花石油醚提取物0.lg/kg, TNF-a+淋巴細胞的百分比為(4.12±0.36) %，R97-116IgG2a抗體水平為 0.179±0.005，R97_116IgG2b 抗體水平為 0.442±0.015 ；
[0301]試驗組32中，模型小鼠給予百合花石油醚提取物0.5g/kg，TNF-a+淋巴細胞的百分比為(3.08±0.43) %，R97-116IgG2a抗體水平為 0.156±0.007，R97_116IgG2b 抗體水平為 0.258±0.017。
[0302]表明百合花提取物可明顯緩解重癥肌無力大鼠的癥狀。
【權利要求】
1.百合花提取物在制備治療神經系統疾病及肌無力疾病藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述神經系統性疾病為老年癡呆、腦卒中和精神分裂癥；所述肌無力疾病為重癥肌無力和進行性肌營養不良；所述百合花提取物是作為乙酰膽堿酯酶抑制劑使用的。
3.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述百合花提取物是將百合花經溶劑提取得到的，所述溶劑為乙醇、蒸餾水或者石油醚。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述溶劑為乙醇，所述百合花提取物為百合花醇提物； 所述百合花醇提物是按如下方法制得的: 將百合花按固液比為1:5-15加入濃度為50-95%的乙醇，提取1-3次，每次提取l_3h，提取液合并，過濾，濃縮，即得百合花醇提物。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述溶劑為蒸餾水，所述百合花提取物為百合花水提物； 所述百合花水提物是按如下方法制得的: 將百合花按固液比為1:5-15加入蒸餾水，煎煮1-3次，每次煎煮l_3h，煎煮液合并，過濾，濃縮，即得百合花水提物。
6.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述溶劑為石油醚，所述百合花提取物為百合花石油醚提取物； 所述百合花石油醚提取物是按如下方法制得的: 將百合花按固液比為1:5-15加入石油醚，提取1-3次，每次提取l_3h，提取液合并，過濾，濃縮，然后加乙醇稀釋，即得百合花石油醚提物。
7.如權利要求4-6任一項所述的應用，其特征在于，將所述百合花提取物制成口服制劑，所述口服制劑由以下重量份的成分制得: 80-120重量份的百合花制得的百合花提取物； 30-40重量份的淀粉； 70-80重量份的糊精； 1-3重量份的硬脂酸鎂； 4-8重量份的滑石粉； 8-12重量份的乙醇。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述口服制劑為片劑或膠囊劑。
9.如權利要求4-6任一項所述的應用，其特征在于，將所述百合花提取物制成注射制劑，所述注射制劑由以下重量份的成分制得: 80-120重量份的百合花制得的百合花提取物； 與百合花的固液比為1:5-15的注射用水。
10.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述百合花提取物的用藥劑量為.0.1-0.5g/kgo
【文檔編號】A61P25/00GK104435581SQ201410773769
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月15日 優先權日:2014年12月15日
【發明者】丁虹, 陶莉, 王玉婷, 杜思達 申請人:武漢華納聯合藥業有限公司