專利名稱：：具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質的制備方法
技術領域：
：本發明涉及蠅類小分子活性物質的研究領域，具體涉及具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質的制備方法。
背景技術：
：家蠅的科學名字為MuscadomesticaLinnaeus，為昆蟲綱，雙翅目，家蠅科。早在明朝時期，家蠅幼蟲就被用于臨床治療膿皰、癤及消化器官的細菌感染等。近年來在多種創傷的治療中試用廣泛，可用于治療靜脈潰瘍(PaulAG,AhmadNWandLeeHLetal.MaggotdebridementtherapywithLuciliacuprina:acomparisonwithconventionaldebridementindiabeticfootulcers.2009；6(1):39_46·)、外傷及手術創傷(SchoutenHff,KnippelsMCandFrankenRJetal.Maggotsinthewound,debridement,disinfectionandwoundhealing2009;153:A624.)、燒傷(NamiasN,VarelaJEandVarasRPetal.Biodebridement-.acasereportofmaggottherapyforlimbsalvageafterfourth-degreeburns,J.BurnCareRehabil.2000；21:254_257·)等。研究認為這是蠅蛆具有抑制促炎癥反應的作用。近期研究顯示，蠅蛆的勻漿液可促進小鼠創傷模型傷口神經的再生。2003年，美國NietschKH等就為蠅蛆提取物治療外傷申請了專利(NietschKH,PoothRandMethlhornHetal.PubNo.:US2003/0124199A1.)。近年來國內針對蠅蛆申請的專利主要集中在飼料原料或飼料添加劑、植物生物農藥或植物促長劑、藥用蛋白質或殼聚糖等。如申請號為02114764.7的中國專利，公開了蠅蛆作為能預防對蝦病毒病和促進生長發育的對蝦飼料添加劑的應用；申請號為03142623.9的中國專利將人工培養的蠅蛆作為雞鴨飼料；申請號為200410015664.1的中國專利將蠅蛆、大蒜、百合等作為養鱉飼料的添加劑；申請號為200610018479.7的中國專利申請以蠅蛆作為主要原料，通過加入抗生素等組成一種生物農藥用于防治病蟲害；申請號為200510026384.5的中國專利公開了一種降血脂功能的昆蟲蛋白的制備方法。當前有關家蠅體內活性物質的研究，多以誘導家蠅幼蟲為對象。通過減壓蒸餾、離子交換層析和凝膠過濾等步驟從其血淋巴中提取純化抗菌物質。研究表明①分離出的抗菌物質多為堿性或近中性蛋白質，且由多種成分組成。②具有廣譜的殺滅細菌、真菌、病毒、原蟲和抑腫瘤細胞作用。③具有抗炎、抗氧化的作用。目前已對家蠅不同抗菌肽基因采用不同策略和技術路線進行了克隆，夏平安等構建了家蠅基因組文庫(夏平安，劉維全，江禹等.家蠅基因組文庫的構建.中國獸醫學報，2003，23(5):421-423.)，王來元等構建了家蠅成蟲cDNA文庫(王來元，王金星，趙小凡等.家蠅cDNA文庫的構建.動物醫學研究，2001，22(2)=89-92.)，金小寶和朱家勇等構建了家蠅幼蟲全長cDNA文庫，為家蠅抗菌肽基因研究提供了基因資源庫(金小寶，王婷婷，朱家勇.家蠅幼蟲脂肪體cDNA文庫的構建及其初步鑒定.中國人畜共患病雜志，2005;21(1):52-55.)。在家蠅抗菌肽基因的克隆表達方面，許琴英和朱家勇等對家蠅抗菌肽基因Defensin進行原核表達及產物的初步活性鑒定(許琴英，朱家勇.家蠅幼蟲Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表達.中國熱帶醫學，2005，5(1):4-6.)。王艷和朱家勇等對家蠅生長發育各階段抗菌肽基因表達情況進行了研究(YanWang,Xiao-baoJin,Jia-yongZhu.ExpressionpatternofantibacterialgenesintheMuscadomestic.SCIENCEINCHINASeriesC，2009，52(9):823_830.)
發明內容本發明的目的在于根據現有昆蟲小分子活性物質的制備過程中存在的活性物質含量低、對昆蟲發育的影響較大的缺陷，提供具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質的制備方法，該方法制得的小分子活性物質在30KD以下，制備過程中無需將幼蟲和飼料分離，通過誘導使活性物質含量提高，安全有效。本發明目的通過以下技術方案予以實現本發明具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質的制備方法包括如下步驟(1)飼養成蠅，誘集成蠅產卵，以飼料喂養幼蟲后，去除飼料殘渣；(2)對幼蟲進行誘導；(3)誘導后48h，收集幼蟲，洗凈、消毒處理，破碎蟲體細胞，高速勻漿、離心，將上清分離、超濾，濾液經冷凍干燥得到具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質。作為一種優選方案，本發明制備方法步驟(1)中，所述飼養成蠅的方式為籠養，采用氨水混合果汁誘集成蠅產卵于集卵器，以奶粉、麥麩、酵母配置的飼料喂養幼蟲；利用幼蟲的負趨光性，去除大部分的飼料殘渣，再結合空氣動力學原理去除剩余殘渣。作為一種優選方案，本發明制備方法中，步驟(2)中所述進行誘導的幼蟲為3日齡幼蟲；所述誘導方法是冰冷刺激誘導、熱刺激誘導、冷熱刺激誘導、紫外照射誘導或超聲誘導；結合幼蟲的存活率、化蛹率、蛋白含量及SDS-PAGE電泳結果最優選為冷熱刺激誘導的方法，具體包括如下步驟將3日齡幼蟲置于冰上放置1520min，再在室溫下放置3040min，重復35次。作為一種優選方案，本發明制備方法中，步驟(3)中所述幼蟲洗凈是用蒸餾水洗凈；所述消毒處理是用75體積％乙醇進行消毒；所述破碎蟲體細胞是通過反復液氮凍融的方法；所述超濾是將離心所得的上清液用分子量為30KD的超濾膜超濾，經過超濾，得到分子量小于30KD的蠅類小分子活性物質。通過本發明方法制得的蠅類小分子活性物質具有調節血脂的功效，可用于制備治療高血脂等疾病的藥物，還可用于醫藥、飼料加工、食品工業、日用化工等多個領域。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)通過本發明方法可有效富集小分子活性物質，獲得蠅類小分子活性物質的含量和產量都顯著提高，受幼蟲的發育和產量影響較小，有效避免強烈刺激所引起的蠅蛆提前化蛹而影響蠅蛆產量；(2)本發明方法采用冷熱刺激誘導條件，在一般的養殖場地基本都可以完成，只需將幼蟲和飼料簡單分離，可操作性強，適于規模化生產；(3)本發明采用冷熱刺激的誘導方法與微生物聯合針刺誘導相比，對幼蟲的損傷小，幾乎不影響幼蟲的生長發育，且中間過程不添加任何有毒有害物質，安全有效，對環境無污染，制得的活性物質為天然綠色產品，可應用于多個領域；圖1為本發明制備方法收集到的幼蟲形態；圖2為不同誘導條件對幼蟲蛋白含量影響的電泳分析比較，其中，1為正常對照組，2為冰冷誘導組，3為熱誘導組，4為冷熱誘導組，5為紫外誘導組，6為超聲誘導組，7為蛋白質marker；圖3為蠅蛆活性物質對小鼠肝臟病理改變的影響，其中，1為陰性對照組，2為實驗處理組，3為陽性對照組。具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例11.家蠅及幼蟲的飼養將獲贈于廣東省疾病預防與控制中心的3齡家蠅幼蟲化蛹后放入蠅籠內，且在蛹的上層鋪撒一層較為濕潤的麥麩，一方面保證蛹的活力，另外羽化的時候方便成蠅脫去蛹殼。每個蠅籠內以8001000頭，在2430°C培養羽化后，籠內分別放入裝有葡萄糖和水的培養皿，供成蟲食用。每天保持光照時間12h左右。羽化后3天在籠中放入集卵器，集卵器中松散地放置誘集產卵的物質即用萬分之一碳酸氨水與果汁混合拌麥麩、奶粉、酵母，半干捏之成團觸之即散，以便于成蠅鉆入產卵。卵孵化后即為幼蟲，幼蟲飼料配方麥麩1000g；奶粉50g；酵母粉15g；用適量的水混勻，以攥握時有水滲出而不流出為宜，調節PH值以6.57.0。幼蟲發育到3齡后，進行誘導。然后連同幼蟲和飼料在上方光照照射15min，使幼蟲鉆爬到飼料的下方，此時可以將上方大部分消化過的飼料去除，然后將下方的幼蟲及少部分的飼料一起放入托盤中在風扇下吹30min，可將剩余的飼料全部吹凈，該方法方便易行。研究結果平均每個幼蟲飼育器內可獲得新鮮幼蟲200g左右，幼蟲長約1.5cm，平均每只重約22.4士2.21mg,蟲體呈淡乳黃色，活動力強，幼蟲的收集與處理方法切實可行。收集到的幼蟲形態如圖1所示。2.幼蟲的批量誘導a冰冷刺激誘導將3齡幼蟲置于冰上放置15min，室溫下放置30min，重復三次，然后在正常飼養條件下飼養48h，將幼蟲收集后，饑餓處理5h，以排出幼蟲體內的排泄物，幼蟲采用蒸餾水洗凈，75體積％乙醇消毒處理，反復液氮凍融破碎蟲體細胞，高速組織勻漿，離心。上清進行超濾分離，采用超濾膜分子量為30KD，將收集的截留液冷凍干燥得產品。b熱刺激誘導將3齡幼蟲置于恒溫水浴鍋中45°C水浴lOmin，室溫放置30min，重復3次，然后在正常條件下飼養48h，將幼蟲收集后，饑餓處理5h，以排出幼蟲體內的排泄物，幼蟲采用蒸餾水洗凈，75體積％乙醇消毒處理，反復液氮凍融破碎蟲體細胞，高速組織勻漿，離心。上清進行超濾分離，采用超濾膜分子量為30KD，將收集的截留液冷凍干燥得產品。c冷熱刺激誘導將3齡幼蟲先在冰上放置5min，然后在45°C水浴3min，重復3次，間隔30min，然后在正常條件下飼養48h，將幼蟲收集后，饑餓處理5h，以排出幼蟲體內的排泄物，幼蟲采用蒸餾水洗凈，75體積％乙醇消毒處理，反復液氮凍融破碎蟲體細胞，高速組織勻漿，離心。上清進行超濾分離，采用超濾膜分子量為30KD，將收集的截留液冷凍干燥得產品。d紫外照射誘導先將3齡幼蟲與飼料分離，紫外燈下放置，照射30min。然后在正常條件下飼養48h，將幼蟲收集后，饑餓處理5h，以排出幼蟲體內的排泄物，幼蟲采用蒸餾水洗凈，75體積％乙醇消毒處理，反復液氮凍融破碎蟲體細胞，高速組織勻漿，離心。上清進行超濾分離，采用超濾膜分子量為30KD，將收集的截留液冷凍干燥得產品。e超聲誘導將3齡幼蟲收集后，放入燒杯中，加入蒸餾水，以沒過蟲體為佳，在超聲細胞破碎儀中以功率150W、超聲時間5s、間歇時間IOs處理5min。然后在正常條件下飼養48h，將幼蟲收集后，饑餓處理5h，以排出幼蟲體內的排泄物，幼蟲采用蒸餾水洗凈，75體積％乙醇消毒處理，反復液氮凍融破碎蟲體細胞，高速組織勻漿，離心。上清進行超濾分離，采用超濾膜分子量為30KD，將收集的截留液冷凍干燥得產品。研究結果各組蛹化率與正常對照組比較，冰冷刺激誘導組、熱刺激誘導組、超聲刺激誘導組均有極顯著性差異(P<0.01)，紫外刺激誘導組有顯著性差異(P<0.05)，冷熱刺激誘導組沒有顯著性差異，冷熱刺激誘導組與紫外刺激誘導組比較有顯著性差異(P<0.05)；各組的幼蟲成活率與正常組比較，冰冷刺激誘導組、熱刺激誘導組、超聲刺激誘導組均有極顯著性差異(P<0.01)，紫外刺激誘導組有顯著性差異(P<0.05)，冷熱刺激誘導組與紫外刺激誘導組比較有顯著性差異(P<0.05)，見表1。綜合蛹化率及成活率兩個指標可以看出以冷熱刺激方式為最優。表1幼蟲的蛹化率及成活率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注a表示與正常對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；b表示與正常對照組比較有極顯著性差異(P<0.01)；C表示冷熱刺激誘導組與其他誘導組比較有顯著性差異(P<0.05)。3.誘導效果評價a蛋白含量測定①標準蛋白質溶液配制稱取IOmg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成100μg/ml的溶液。②考馬斯亮藍G-250試劑配制稱取IOOmg考馬斯亮藍G-250，溶于50ml95體積％乙醇中，加入85%(m/v)的磷酸100ml，最后用蒸餾水定容到1000ml。③樣品溶液以收集到的上清液稀釋10倍作為樣品。④繪制標準曲線在595nm處比色，讀取各管吸光值，以牛血清白蛋白含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。將每組的截留液準確吸取1.0ml，于一支干燥潔凈的試管中，加入考馬斯亮藍G-250試劑5ml，搖勻，室溫靜置2min，以標準曲線1號管為對照，在595nm處比色，記錄吸光值，重復3次。b蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳①用Iwt%瓊脂將長玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12體積％分離膠(4.9ml蒸餾水，6.Oml30體積％丙烯酰胺，3.8mll.5mol/LTris-HCl，150μ1IOwt%SDS,150μ1IOwt%過硫酸銨，6μ1TEMED)，灌到至短玻璃板4cm,用水封住，冷凝30分后將水倒出，吸干，灌滿5體積％濃縮膠(5.5ml蒸餾水，1.3ml30體積％丙烯酰胺，1.Oml1.5mol/LTris-HCL,80μ1IOwt%SDS,80μ110wt%過硫酸銨，8μ1TEMED)后立即插入梳子，冷凝30min后取出梳子，將1X電泳緩沖液倒入電泳槽，并淹沒短玻璃板。②取30μ1上清液與30μ1樣品緩沖液混合，于100°C水浴加熱3min使蛋白變性，用微量進樣器以50μ1的量注入點樣孔，不加樣槽注入樣品緩沖液。③以濃縮膠中100V，分離膠中180V電壓進行電泳，至距底線Icm時關閉電源。④將電泳后的凝膠取出，置于培養皿中，用蒸餾水沖去殘留緩沖液，加入染色液將凝膠完全浸泡其中，放入微波爐內，高火檔照射20s，停留lmin，再照射10s，反復幾次至凝膠上色后倒出染色液，用蒸餾水沖去殘留染色液，加入脫色液，高火檔照射20s，倒出脫色液，再加入新鮮脫色液照射20s，重復56次，直至背景清晰透明，于凝膠分析儀上成像分析。研究結果由考馬斯亮藍分光光度法測定的蛋白含量結果可以看出，各種方法誘導的幼蟲的蛋白含量與正常對照組比較都有提高，其中冰冷刺激誘導組、熱刺激誘導組、紫外刺激誘導組、超聲刺激誘導組均有顯著性差異(P<0.05)，冷熱刺激誘導組則具有極顯著性差異(P<0.01)。冷熱刺激誘導組與其他組比較具有極顯著性差異(P<0.01)，見表2。說明冷熱刺激誘導組的蛋白含量高于其他各組。表2各組蛋白含量測定結果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>冷熱剌激誘導647±26.8bc紫外剌激誘導556±57.9a超聲刺激誘導566±26.4a正常對照組519±26.3注a表示與正常對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；b表示與正常對照組比較有極顯著性差異(P<0.01)；C表示冷熱刺激誘導組與其他誘導組比較有極顯著性差異(P<0.01)。聚丙烯酰胺凝膠電泳結果可以看出，經過誘導處理后各組蛋白表達量都較正常對照組要高，尤其是6.5KD以下小分子蛋白含量升高比較明顯。正常對照組在6.5KD以下也有條帶，同時也說明家蠅幼蟲在正常狀態小分子蛋白有一定量的組成性表達，從條帶上看2、3、4、5泳道的顏色較深。見圖2。由表3不同組電泳光密度值可以看出，各誘導刺激組光密度值均高于正常對照組，均具有極顯著性差異(P<0.01)，冷熱刺激誘導組與其他誘導組比較有顯著性差異(P<0.05)。表3電泳條帶光密度分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注b表示與正常對照組比較有極顯著性差異P<0.01，c表示冷熱刺激誘導組與其他誘導組比較有顯著性差異(P<0.05)綜合以上各個因素均以冷熱刺激誘導方式為最優。實施例2高血脂模型構建小鼠飼以高膽固醇飼料的方法建立小鼠的高血脂模型。設立陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(辛伐他汀25mg/kg)、蠅類小分子活性物質組(200mg/kg)，以灌胃的方式給藥。實驗進行40天后，股動脈取血處死全部動物。分離血清，檢測血清中總膽固醇、總甘油三酯、低密度載脂蛋白和高密度載脂蛋白。同時，檢測肝臟的病理變化情況。實驗結果停藥5天后的各組血脂含量如表5，各組血清血脂水平統計結果可以看出，蠅類小分子活性物質組與陰性對照組比較血清血脂指標均有極顯著性差異(P<0.01)。表明本發明制備方法得到的蠅類小分子活性物質可較好的調節血脂。肝臟病理檢測顯示陰性對照組大鼠肝組織肝小葉界限不清，肝細胞索排列紊亂，大部分肝竇消失，多數肝細胞出現嚴重的脂肪變性，肝細胞極度腫脹呈圓形，胞漿內看見大小不等、數量不一的脂滴空泡(脂肪變性)；實驗處理組除肝小葉和肝血竇結構清晰，細胞排列整齊，部分大鼠肝細胞可見輕度水變性，但細胞內無明顯脂滴空泡，細胞核形態、結構正常。與陰性對照組比較，較好的抑制了肝臟脂肪變性。表5血清血脂情況<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注b表示與陰性對照組比較有極顯著性差異P<0.01。權利要求具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)飼養成蠅，誘集成蠅產卵，以飼料喂養幼蟲后，去除飼料殘渣；(2)對幼蟲進行誘導；(3)誘導后48h，收集幼蟲，洗凈、消毒處理，破碎蟲體細胞，高速勻漿、離心，將上清分離、超濾，濾液經冷凍干燥得到具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質。2.根據權利要求1所述蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述誘集成蠅產卵是通過氨水混合果汁來誘集的。3.根據權利要求1所述蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述進行誘導的幼蟲為3日齡幼蟲。4.根據權利要求1所述蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述誘導方法是冰冷刺激誘導、熱刺激誘導、冷熱刺激誘導、紫外照射誘導或超聲誘導。5.根據權利要求4所述蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述誘導方法是冷熱刺激誘導。6.根據權利要求5所述蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于所述冷熱刺激誘導具體包括如下步驟將3日齡幼蟲置于冰上放置1520min，再在室溫下放置3040min，重復35次。7.根據權利要求1所述蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述幼蟲用蒸餾水洗凈。8.根據權利要求1所述蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述消毒處理是用75體積％乙醇進行消毒。9.根據權利要求1所述蠅類小分子活性物質的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述超濾是將離心所得的上清液用分子量為30KD的超濾膜超濾。全文摘要本發明公開了具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質的制備方法。本發明制備方法包括如下步驟(1)飼養成蠅，誘集成蠅產卵，以飼料喂養幼蟲后，去除飼料殘渣；(2)對幼蟲進行誘導；(3)誘導后48h，收集幼蟲，洗凈、消毒處理，破碎蟲體細胞，高速勻漿、離心，將上清分離、超濾，濾液經冷凍干燥得到具有降血脂功能的蠅類小分子活性物質。本發明制備方法可有效富集蠅類小分子活性物質，受幼蟲的發育和產量影響較小，在一般的養殖場地即可完成，安全有效，對環境無污染，可操作性強，適于規模化生產。文檔編號A61P3/06GK101829151SQ20101017635公開日2010年9月15日申請日期2010年5月11日優先權日2010年5月11日發明者丁靜,吳鵬,朱家勇,褚夫江,金小寶,馬艷申請人:廣東藥學院