專利名稱：化合物穗花衫雙黃酮在制備降血糖藥物方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及了一種化合物穗花衫雙黃酮或者從中藥提取物中的化合物穗花衫雙黃酮在制備降血糖藥物的應用；尤其涉及一種該化合物穗花衫雙黃酮在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物方面的應用。

背景技術：
糖尿病是一種以高血糖為特征，代謝紊亂為表現，與胰島素分泌密切相關的全身性疾病，是由于遺傳和環境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，是最普通的內分泌疾病之一。因胰島素分泌絕對或相對不足以及靶組織對胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂。臨床上出現三多(多食、多飲、多尿)、一少(體重下降)、高血糖癥狀。根據病因的不同，糖尿病可分為胰島素依賴型糖尿病(1DDM，1型)和非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM，2型)。目前我國糖尿病患約1200萬，全球約1.5億，已成為威脅人類的第3位“健康殺手”，所以預防和治療糖尿病已成為全球性的保健問題。多年來糖尿病的治療主要以控制空腹血糖為目標，治療藥物長期以來主要集中于磺脲類與雙胍類藥物。近年來研究發現，餐后血糖也是糖尿病并發癥發生的主要危險因子，餐后血糖是一天中血糖水平最高的階段，其持續時間可達8小時之久或更長，長時間高水平的餐后血糖可加重糖尿病本身，使血糖進一步升高，如果在進餐時就能很好的控制高血糖，則可以避免其餐后血循環中的糖分堆積，因此，控制餐后血糖可以說是控制高血糖、防治糖尿病的重要舉措。現有的糖尿病治療藥物中，磺脲類藥物通過刺激胰島素的分泌而降低血糖；雙胍類藥物則通過增加外周組織對葡萄糖的利用而降低血糖，兩者對降低II型糖尿病病人空腹血糖均有較好療效，但對降低餐后血糖的作用卻非常有限。
食物中的絕大多數碳水化合物為淀粉與蔗糖等，淀粉先后經唾液及胰液中α-淀粉酶分解為寡糖，寡糖在小腸上皮細胞刷狀緣處被Q-葡萄糖苷酶分解為葡萄糖而被吸收后，導致餐后血糖高峰，因此，抑制α-葡萄糖苷酶的活性成為降低餐后血糖的一個有效途徑。
α-葡萄糖苷酶抑制劑是七十年代后期研究開發出的一類新型口服降血糖藥物，其作用機理在于競爭性的抑制α-葡萄糖苷酶，延緩和阻礙碳水化合物的消化，延遲來自雙糖、低聚糖及多糖的葡萄糖的吸收，有效推遲并減輕餐后血糖升高的時間及程度，長期服用還可以降低空腹血糖水平，此類藥物對I、II型糖尿病均適用。α-葡萄糖苷酶抑制劑不僅對糖尿病有確切的療效，而且對于肥胖癥、慢性乙肝、艾滋病及腫瘤都有一定的治療作用。目前用于臨床的此類藥物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。現有的此類藥物成本較高，生產廠家很少，并具有腸道副作用。傳統中藥及天然植物藥具有相對安全和價格低廉的特點，開發中藥及天然植物藥作為α-葡萄糖酶抑制劑可以提供更廣泛的糖尿病治療藥物來源。
卷柏為蕨類植物門卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)植物，約有700種，廣泛分布于全世界。我國約有50種，產于全國各地。2005年版《中華人民共和國藥典》收載了兩個品種卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring；墊裝卷柏Selaginella ulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.。卷柏是我國傳統中藥材，早在《本經》中就有記載，列為上品，功能活血通經，破血散結。卷柏全草入藥。卷柏作為民間傳統中藥材，藥用歷史悠久。由于傳統藥物的服用方法多為水煎煮法，現代藥理研究也多用水煎煮液整體研究，發現水煎液在抗腫瘤、免疫、止血等方面均有很好的藥理活性。但對其脂溶性部位研究較少，特別是在抑制α-葡萄糖苷酶方面的研究尚未見報道。
穗花杉雙黃酮(Amentoflavone)又名阿曼托雙黃酮，是一種從天然植物中分離純化得到的雙黃酮類化合物，分子式為C30H18O10，分子量538，植物來源廣泛，藥理活性明顯。在很多種中草藥如銀杏葉、貫葉連翹中均存在，而卷柏(包括卷柏、墊裝卷柏、中華卷柏和江南卷柏等)中穗花杉雙黃酮的含量又遠遠高于其他中草藥。文獻報道穗花杉雙黃酮具有抗病毒、抗炎、抗癲癇、神經細胞保護、促Ca2+釋放活性等活性，但對其在抑制α-葡萄糖苷酶方面的作用尚未見報道。


發明內容
本發明的目的在于提供一種化合物穗花衫雙黃酮在制備降血糖藥物方面的應用。
本發明的目的還在于提供一種從中藥卷柏中提取到的化合物穗花衫雙黃酮，該化合物可用于制備降血糖藥物，尤其是制備α-葡萄糖苷酶抑制劑活性藥物的應用。
為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種化合物穗花衫雙黃酮制備降血糖藥物的應用。
進一步地，該化合物穗花衫雙黃酮在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物方面的應用。
另外，本發明的技術方案還采用了一種中藥提取物中的化合物穗花衫雙黃酮制備降血糖藥物的應用。
更進一步地講，該化合物穗花衫雙黃酮在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物方面的應用。
所述的化合物穗花衫雙黃酮來自任何含有穗花衫雙黃酮的原料藥，優選來自中藥卷柏原料藥中的乙酸乙酯部位。
本發明的穗花衫雙黃酮優選從卷柏的提取物中提取得到的，卷柏在自然界中分布很廣泛，這就使得本發明的原料易得，成本很低。實驗表明利用卷柏有效部位——乙酸乙酯部位經過進一步提取得到的穗花衫雙黃酮具有很好的降血糖作用，尤其具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶作用。
乙酸乙酯部位進一步制備而得的單體化合物經鑒定為穗花衫雙黃酮，其結構式為
穗花衫雙黃酮(Amentoflavone) 本發明的單體化合物穗花衫雙黃酮及其所在的有效部位乙酸乙酯部位，體外實驗表明在抑制α-葡萄糖苷酶方面有較好的活性。



圖1為穗花衫雙黃酮標準品質量與峰面積的標準曲線圖。
圖2為乙酸乙酯含量測定色譜圖。

具體實施例方式 實施例1 本實施例為卷柏提取物——乙酸乙酯部位的提取方法，具體步驟如下取干燥卷柏全草，用丙酮與水按體積比為7∶3冷浸3次，每次7天，過濾，合并濾液減壓回收溶劑得濃縮物。將濃縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。
實施例2 本實施例為穗花衫雙黃酮的提取方法，制備方法為取實施例1制得的乙酸乙酯部位，進行硅膠常壓柱(200-300目)層析，石油醚-丙酮按體積比為10∶1、8∶2和7∶3進行梯度洗脫(每個梯度洗脫5個柱體積，速度為5ml/秒)，TLC檢測合并含有穗花衫雙黃酮部分，在Sephadex LH-20柱色譜以丙酮進行洗脫，得到穗花衫雙黃酮純品。
結構鑒定 化合物穗花衫雙黃酮，EIMS m/z538(M+)，270，121；1H-NMR(DMSO-d6)δ13.10(1H，s，5-OH)，13.00(1H，s，5″-OH)，6.83(1H，s，H-3)，6.21(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.48(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，8.03(1H，s，H-2′)，7.17(1H，d，J＝9.3Hz，H-5′)，8.01(1H，d，J＝9.3Hz，H-6′)，6.80(1H，s，H-3″)，6.42(1H，s，H-6″)，7.59(2H，d，J＝8.8Hz，H-2″′，6″′)，6.74(2H，d，J＝8.8Hz，H-3″′，5″′).13C-NMR(DMSO-d6)δ163.8(C-2)，102.9(C-3)，181.7(C-4)，161.5(C-5)，98.9(C-6)，164.1(C-7)，94.0(C-8)，157.4(C-9)，103.7(C-10)，121.0(C-1132.3(C-1′)，127.8(C-2′)，120.0(C-4′)，116.2(C-5′)，131.4(C-6′)，163.7(C-2″)，102.6(C-3″)，182.1(C-4″)，160.5(C-5″)，98.6(C-6″)，161.9(C-7″)，104.0(C-8″)，154.5(C-9″)，103.7(C-10″)，121.4(C-1″′)，128.2(C-2″′)，115.8(C-3″′)，161.0(C-4″′)，115.8(C-5″′)，128.2(C-6″′)。
實施例3 本實施例為穗花衫雙黃酮抑制α-糖苷酶活性試驗 方法微孔板法 原理α-D-葡萄糖苷酶催化水解4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-G)，產生硝基苯酚(PNP，黃色物質，在400m左右有最大吸收)，α-糖苷酶抑制劑可抑制α-葡萄糖苷酶與底物結合從而降低PNP的釋放量。以一定時間內反應體系中PNP的含量變化來計算提取物的酶抑制活性。
儀器Multiskan MK3酶標儀(熱電上海儀器有限公司)，96微孔板，各種規格移液器，LRH-150生化培養箱(上海一恒科技有限公司)。
試劑α-葡萄糖苷酶(Sigma公司，EC 3.2.1.20，from baker’s yeast，批號105K1313)，對-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Sigma公司，批號026K1516)，磷酸鹽緩沖液(PH 6.8)，阿卡波糖(拜糖平，Sigma公司，批號16869)，其他試劑均為分析純。
檢測方法 112L磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)，加入20μL(濃度為0.2U/mL)α-葡萄糖苷酶，8μL樣品溶液，37℃恒溫15min，加入20μL 2.5mmol/L PNPG，37℃恒溫反應15min。再加入80μL(濃度為0.2mol/L)的終止劑Na2CO3溶液，于405nm波長下測OD值。實驗共設4個組，每組三孔，分別為a.陰性對照組；b.空白組；c.樣品測定組；d.樣品對照組。按下面方法計算抑制率，并用Origin軟件求出相應IC50值。
抑制率計算
分別利用上述測定方法測定了穗花衫雙黃酮、卷柏乙酸乙酯部位和陽性對照阿卡波糖的IC50。
實驗結果如表1所示。
表1 IC50測定結果
對比穗花衫雙黃酮和卷柏乙酸乙酯部位和陽性對照的IC50可知，穗花衫雙黃酮和卷柏乙酸乙酯部位抑制α-D-葡萄糖苷酶活性均明顯好于陽性對照。對乙酸乙酯部位中穗花衫雙黃酮的含量測定，發現穗花衫雙黃酮在乙酸乙酯部位的含量為31.64％，由此可知乙酸乙酯部位的主要有效成分是穗花衫雙黃酮。以下是對乙酸乙酯部位中穗花衫雙黃酮的含量測定。
HPLC法測定 儀器與試劑 儀器島津LC-2010高效液相色譜儀，UV-2010A檢測器，自動進樣器，四元低壓梯度泵，CLASS-vp色譜工作站，AL-104型電子天平(梅特勒-托利多)，KQ3200型超聲波清洗器。
試劑甲醇(色譜純，廠家)，高純水，磷酸為分析純，穗花山雙黃酮標準品為天然產物研究所自制，純度98％。
色譜條件 RP-18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，Merck公司生產；流動相甲醇∶0.1％磷酸水溶液(65∶35)，流速0.8mL/min；檢測波長337nm；柱溫25℃，定量方法為外標峰面積法。
標準曲線的制定 精密稱取標準品1.2mg于10mL容量瓶中，搖勻備用。取一定量用過濾器(0.45μm)過濾得0.12mg/mL標準品溶液，分別進樣1μL、3μL、5μL、7μL、10μL，將所得峰面積對雙黃酮質量進行線性回歸，得標準曲線Y＝5E+06X-10436，r＝1.000，線性范圍為0.12μg～1.2μg。結果見表2，據表2做標準曲線，見圖1。
表2 標準品濃度μg峰面積 0.12 593562 0.36 1793563 0.60 2993563 0.84 4193563 1.20 5993563 樣品測定精密稱取3mg 酸乙酯有效部位至于10mL容量瓶中，加入甲醇8mL，超聲使溶解，定容至10mL，過濾(0.45μm)的樣品溶液。平行6份。含量測定色譜圖見圖2，其中A為標準品色譜圖，B為樣品色譜圖。
結果平均含量為31.64％，RSD＝0.75％。
本發明還分別測定了卷柏、墊裝卷柏、江南卷柏、中華卷柏等卷柏屬卷柏中穗花衫雙黃酮的含量，結果如表3所示。
表3不同種卷柏屬植物中穗花衫雙黃酮的含量
最后所應說明的是以上實施例僅用以說明，而非限制本發明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍當中。
權利要求
1、化合物穗花衫雙黃酮在制備降血糖藥物方面的應用。
2、根據權利要求1所述的應用，其特征在于該化合物穗花衫雙黃酮在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物方面的應用。
3、中藥提取物中的化合物穗花衫雙黃酮在制備降血糖藥物方面的應用。
4、根據權利要求3所述的應用，其特征在于該化合物穗花衫雙黃酮在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物方面的應用。
5、根據權利要求1-4中任一條所述的應用，其特征在于所述的化合物穗花衫雙黃酮來自中藥卷柏的提取物。
全文摘要
本發明公開了一種化合物穗花衫雙黃酮在制備降血糖藥物方面的應用，尤其在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物方面的應用。還公開了從中藥提取物中提取的化合物穗花衫雙黃酮在制備降血糖藥物方面的應用。實驗表明本發明的化合物穗花衫雙黃酮以及利用卷柏有效部位——乙酸乙酯部位經過進一步提取得到的穗花衫雙黃酮具有很好的降血糖作用，尤其具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶作用。
文檔編號A61K31/352GK101606927SQ20081005005
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月18日 優先權日2008年6月18日
發明者康文藝, 麗 張, 賀光東 申請人:河南大學