專利名稱：表面修飾的羧基被活化后的磁性納米晶體干粉及其制備方法
技術領域：
本發明涉及表面修飾的功能基團被活化后的磁性納米晶體干粉，特別涉及表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉及其制 備方法。通過將該干粉和生物分子在水溶液中混合，可直接得到磁性納米晶 體和生物分子的共價耦聯物。
背景技術：
磁性納米晶體廣泛應用于生物醫學領域，包括核磁共振成像造影劑， 細胞、蛋白、核酸的分離與標記，磁靶向藥物，腫瘤的磁熱治療劑等。要實 現磁性納米晶體的上述應用，有效地解決磁性納米晶體與生物分子之間的耦 聯是最關鍵的問題之一。目前，納米晶體與生物分子進行耦聯的方法主要有兩種(1)基于納米 晶體與生物分子之間的弱相互作用，包括靜電吸附，疏水相互作用，以及金 屬離子與組氨酸殘基之間的配位作用等；(2)利用納米晶體與生物分子之間 的化學反應制備得到共價耦聯物。與弱相互作用相比，井價耦聯方法所得到 的耦聯物的化學穩定性大大增強，因此有更廣泛的應用前景。目前，應用最廣泛的共價耦聯方法是釆用EDC (1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)和 Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)作為羧酸基團的活化劑，將羧酸基團轉 變為Sulfo-NHS酯，該Sulfo-NHS酯可以與胺基基團在溫和條件下形成酰胺鍵， 從而實現納米晶體與生物分子的共價耦聯(Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York, 1996， pl73國176; Adv. Mater.， 2006， 2553-2556)。這種方法 的優點是，可以在溫和的條件下很方便地制備得到納米晶體與生物分子的共 價耦聯物。在該方法的實際使用中， 一般是先將羧酸基團修飾在納米晶體表 面，然后再對其進行活化。然而，由于納米晶體活化產物容易水解，存在活 化效率低的缺點；另外，納米晶體活化產物的易水解性質還導致該活化產物無法長期保存，因此，采用EDC和Sulfo-NHS作為活化劑進行耦聯時，納米晶 體表面修飾的羧基的活化反應和活化產物與生物分子之間的耦聯反應必須連 續進行。本發明發展了上述技術，采用DCC (二環已基碳二亞胺)和NHS (N-羥 基琥珀酰亞胺)或DIC (N，N'-二異丙基碳二亞胺)和NHS為活化劑，以有機 溶劑作為反應介質，將納米晶體表面修飾的羧酸基團活化成N-羥基琥珀酰亞 胺酯。由于羧基的活化反應在有機溶劑中進行，避免了活化產物的水解，因 此，活化效率大大提高；另一方面，有機溶劑中的活化反應結束后，還可以 采用抽真空的方法將有機溶劑抽干，得到可以長期保存并便于運輸的活化產 物干粉，從而可將納米晶體表面修飾的羧基的活化步驟和活化產物與生物分 子之間的耦聯步驟分開進行，有利于實現納米材料在生物醫學研究及臨床診 斷中更廣泛的應用。發明內容本發明的目的之一是提供表面修飾的羧基被活化后的磁性納米晶體干粉。本發明的目的之二是提供表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯 的磁性納米晶體干粉。本發明的目的之三是提供表面修飾的羧基被活化后的磁性納米晶體干粉 的制備方法。本發明的目的之四是提供表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯 的磁性納米晶體干粉的制備方法。本發明的目的之五是提供的表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺 酯的磁性納米晶體干粉可通過與帶有胺基的生物分子在水溶液中混合，直接 得到磁性納米晶體和生物分子的共價耦聯物。本發明的目的之六是提供的表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺 酯的磁性納米晶體干粉經長期放置后仍能保持與帶有胺基的生物分子進行共 價耦聯的反應活性。本發明中所述的表面修飾有羧基的磁性納米晶體是利用現有技術制備得 到的，如按照中國專利03136273.7、 200710062721.5或文獻(Adv. Mater., 2006，/S， 2553-2556)所公開的方法合成出來的。本發明所述的表面修飾的羧基被活化后的磁性納米晶體干粉，該磁性納 米晶體表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。表面修飾的羧基被活 化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉進一步與帶有胺基的生物分子 在水溶液中混合均勻，即可實現它們之間的共價耦聯，直接得到磁性納米晶 體和生物分子的共價耦聯物，表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯 的磁性納米晶體干粉與帶有胺基的生物分子進行共價耦聯反應的摩爾投料比 為1:0.01 1:1000。所述的表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體千 粉在4'C干燥避光條件下存放一年時間以內，仍然保持與帶有胺基的生物分子 進行共價耦聯的反應活性。所述的帶有胺基的生物分子選自氨基酸、多肽、蛋白、碳水化合物或核 酸的胺基衍生物中的一種。所述的表面修飾羧基的磁性納米晶體選自粒徑為1 60 nm的表面修飾有 羧基的磁性過渡金屬及其氧化物、磁性鑭系稀土金屬氧化物，過渡和稀土金 屬摻雜型磁性氧化物，包括鐵、鈷、鎳、錳或它們的氧化物，氧化釓、氧化 鋱、氧化鏑、氧化鈥、氧化鉺及氧化銩，或上述這些金屬摻雜型磁性氧化物。本發明中所述的磁性納米晶，其最重要的結構特征是納米晶體表面修飾 有聚乙二醇(PEG)或聚乙二醇鏈段。PEG修飾使得磁性納米晶體既可以溶于 水，又可以溶于有機溶劑，從而保證磁性納米晶體表面攜帶的羧酸基團可以 在有機相中進行活化。本發明中磁性納米晶體表面修飾羧基的活化可通過加入活化劑的方法， 在有機溶劑中進行活化反應，將羧基活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。本發明所述的表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉的制備方法包括以下步驟(1)將表面修飾有羧基的磁性納米晶體溶于有機溶劑中形成溶液，然后 分別加入活化劑N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的有機溶劑溶液和活化劑二環已 基碳二亞胺(DCC)或活化劑N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)的有機溶劑溶 液，將磁性納米晶體表面修飾的羧基進行活化，室溫下(15'C 30'C)反應 40分鐘 18小時，或在4'C下反應2 24小時；其中，表面修飾有羧基的磁性 納米晶體與二環己基碳二亞胺或N，N'-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2 1:2000， 二環己基碳二亞胺或N,N"-二異丙基碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的 摩爾比為1:0.9 1:10;或將表面修飾有羧基的磁性納米晶體和活化劑N-羥基琥珀酰亞胺溶于有 機溶劑中形成溶液，然后逐滴加入活化劑二環已基碳二亞胺或活化劑N,N'-二 異丙基碳二亞胺的有機溶劑溶液，將磁性納米晶體表面修飾的羧基進行活化， 室溫下(15'C 30'C)反應40分鐘 18小時，或在4'C下反應2 24小時；其 中，表面修飾有羧基的磁性納米晶體與二環已基碳二亞胺或N,N^二異丙基碳 二亞胺的摩爾比為1:2 1:2000， 二環已基碳二亞胺或N,W-二異丙基碳二亞胺 與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1:0.9 1.:10;(2)將歩驟(1)中的反應液離心，取上層清液，將沉淀用有機溶劑洗滌 后棄去沉淀物，合并上雇清液和洗滌液，真空抽干有機溶劑，得到表面修飾 的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉。所述的有機溶劑選自二氯甲垸、氯仿、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙二醇二 甲醚、二氧六環、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜中的一種或其中任意兩 種的混合物。本發明所述的表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉與帶有胺基的生物分子的共價耦聯，其步驟如下將表面修飾的羧 基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉與帶有胺基的生物分子 在水溶液中混合均勻，室溫下(15'C 30'C)反應30分鐘 4小時，或在4'C 下反應2小時 24小時，即可制備得到磁性納米晶體與生物分子的共價耦聯 物。其中，表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干 粉與帶有胺基的生物分子在所形成的耦聯物中的摩爾比為1:0.01 1:1000。所述的帶有胺基的生物分子選自氨基酸、多肽、蛋白、碳水化合物或核 酸的胺基衍生物中的一種。本發明采用DCC和NHS或DIC和NHS作為羧酸基團的活化劑，通過在有機 溶劑中將磁性納米晶體表面修飾的羧酸基團活化，制備了表面帶有N-羥基琥 珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉。將該干粉和生物分子在水溶液中混合，可 直接生成磁性納米晶體和生物分子的共價耦聯物。該表面修飾的羧基被活化 成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉經長期放置后仍然保持與生物分 子進行共價耦聯的反應活性。該表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉可以長期保存并便于運輸，與生物分子之間的共價耦 聯簡便易行，適于規模化和商業化生產。


圖l.本發明實施例1中Fe304磁性納米晶體在活化反應進行前的電鏡照片。 圖2.本發明實施例l中表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的 Fe304磁性納米晶體干粉在磁場作用下的照片。圖3.本發明實施例l制備的表面帶有N-羥基琥珀酰亞胺酯基團的Fe304磁性納米晶體干粉在磷酸鹽緩沖液中形成的水溶液在磁場作用下的照片。 圖4.本發明實施例2中耦聯物及其對照在電泳結束后的蛋白染色照片。 Fe304與抗CEA嵌合抗體rch 24的耦聯物； 2#: Fe304與抗CEA嵌合抗體rch24的混和物； 3#: Fe304;4#:抗CEA嵌合抗體rch24。圖5.本發明實施例7中Fe304與抗CEA嵌合抗體rch 24的共價耦聯物與腫瘤 細胞孵育后的T2加權像以及對照實驗結果。從左向右，回波時間依次為25ms， 75ms， 125 ms， 175 ms。其中，第一排樣品是與Fe3(V(rch 24 mAb)耦聯物共 同孵育后得到的腫瘤細胞樣品；第二排是與Fe304-IgG耦聯物共同孵育后得到 的腫瘤細胞樣品第三排是與Fe304納米晶體共同孵育后得到的腫瘤細胞樣品; 第四排是腫瘤細胞的對照樣品。圖6..本發明實施例ll中所用乳糖的分子結構式。圖7.本發明實施例13中所用維生素H的分子結構式。附圖標記 l.磁鐵具體實施方式
實施例l將1.06 g乙酰丙酮鐵、12 g雙羧基PEG2000 (按文獻^sfu Afa欣，2005，〃滯，1001方法制備)、3.87mL油胺溶解于50mL苯醚中，然后將上述溶液 轉入IOO mL的三口燒瓶中，通入氮氣除氧30分鐘，回流反應液20小時， 將反應體系冷卻至室溫，用乙醚沉淀出表面帶有羧基的生物相容性磁性納米 晶體并洗滌三次，離心分離得到生物相容性Fe304磁性納米晶體。將所得納 米微粒溶于去離子水中，透析24小時,將所得溶液用乙醚和丙酮的混合液(體 積比為3:1)進行沉淀和洗滌，真空干燥后即可得到表面帶有羧酸基團的磁 性納米晶體。該磁性納米晶體既可以溶于氯仿等有機溶劑，又可以溶于水既 生理鹽水。釆用上述方法及中國專利200710062721.5中記載的方法，可制備 出以下實施例中使用的各種表面修飾有羧基的磁性納米晶體。實施例2將0.32 g表面修飾有羧基的Fe304磁性納米晶體(10 nm)和N-羥基琥珀酰 亞胺(17.3 mg, 0.15 mmol， Aldrich 130672，純度大于98%)溶于50mL二甲基 甲酰胺中，然后向該溶液中逐滴加入l mL二環已基碳二亞胺(30.9 mg, 0.15 mmol， Fluka 36650，純度大于99%)的二甲基甲酰胺溶液，室溫下(25'C) 反應12小時，離心，取上層清液，將沉淀用二甲基甲酰胺洗滌三次后棄去沉 淀物，合并上層清液和洗滌液，真空抽干有機溶劑，得到磁性納米晶體干粉， 該干粉表面修飾的羧基已被活化為N-羥基琥珀酰亞胺酯。圖l為Fe304磁性納 米晶體在活化反應進行前的電鏡照片。圖2為表面修飾的羧基被活化成N-羥基 琥珀酰亞胺酯的Fe304磁性納米晶體干粉在磁場作用下的照片。實施例3稱10 mg實施例l中得到的干粉,加入IO mL 1 mg/mL的抗CEA嵌合抗體rch 24磷酸鹽緩沖液(PBS， pH=7.4)，混勻，室溫條件下(20'C)反應4小時，得 到Fe304與抗CEA嵌合抗體rch24的共價耦聯物。圖3為實施例l中得到的表面修 飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的Fe304磁性納米晶體干粉與抗CEA 嵌合抗體rch 24共價耦聯前在磷酸鹽緩沖液中形成的水溶液在磁場作用下的 照片。耦聯反應結束后，采用5。/。(w/v)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測耦聯 反應。圖4為耦聯物及其對照在電泳結束后的蛋白染色照片。l弁是Fe304與抗體 的耦聯物；2弁是Fe304與抗體的混合物；3#是 6304; 4#是抗體。通過比較抗體 染色后的條帶發現，Fe304與抗體混合物中抗體在泳道中的遷移速度與純抗體幾乎沒有差別，而耦聯物中抗體的遷移速度比純抗體要快得多，這是由于帶大量負電荷的Fe304納米粒子耦聯在抗體表面造成的；同時，通過比較耦聯物 和混合物中抗體的遷移速度可以推斷，耦聯物中抗體與Fe304是通過共價鍵進 行耦聯，而不是非特異性相互作用。實施例4將1.18 g表面修飾有羧基的磁性納米鈷晶體(20nm)和N-羥基琥珀酰亞胺 (67.9 mg， 0.59mmo1)溶于30 mL四氫呋喃中，然后向該溶液中逐滴加入2 mL 二環已基碳二亞胺(134 mg, 0.65mmo1)的四氫呋喃溶液，4 'C反應24小時， 離心，取上層清液，將沉淀用四氫味喃洗^三次后棄去沉淀物，合并上層清 液和洗滌液，真空抽干有機溶劑，得到磁性納米晶體干粉，該干粉表面修飾 的羧基已被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。稱10mg該干粉，加入2mLL-賴氨酸 (1.64 mg)的PBS(pH-7.4)溶液，混勻，4 'C反應2小時，得到鈷納米晶體與 L-賴氨酸的共價耦聯物。利用紫外一可見吸收光譜方法，通過采用茚三酮顯 色反應檢測未耦聯的賴氨酸的量，確定每個磁性納米晶體表面耦聯的賴氨酸 的數目為800個。實施例5將3.75 g表面修飾有羧基的Ni (30 nm)磁性納米晶體溶于80 mL二氯甲烷 中，然后，向該溶液中加入lmLN-羥基琥珀酰亞胺(138mg，1.2mmol)的二 甲基甲酰胺溶液，混勻，逐滴加入lmLN，W-二異丙基碳二亞胺(37.8 mg, 0.3 mmol， Fluka38370，純度大于980/O的二氯甲垸溶液，室溫條件下(15'C)反 應18小時，離心，取上層清液，將沉淀用二氯甲烷洗滌三次后棄去沉淀物， 合并上層清液和洗滌液，抽真空，得到磁性納米晶體干粉，該干粉表面修飾 的羧基已被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。稱10mg該干粉，加入5mL末端氨基 化的含十八個堿基的單鏈DNA (NH2-ssDNA， 5'-Amine-C6TA CAG GTC ATG TAACTT-3c) (4.67mg)的TE (三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二鈉)緩沖 液溶液，混勻，室溫(28'C)反應30分鐘，得到鎳納米晶體與DNA的共價耦 聯物，磁性納米晶體的表面等離子體共振吸收峰在耦聯前后的移動結果(8納 米)表明上述耦聯已經成功地實現。實施例6將2.29 g表面修飾有羧基的Mri304 (2 nm)磁性納米晶體和N-羥基琥珀酰 亞胺(11.5 mg， 0.1 mmol)溶于50 mL二氧六環中，混勻，逐滴加入l mL二環 己基碳二亞胺(30.9 mg, 0.15 mmol)的二氧六環溶液，4 'C反應2小時，離心， 取上層清液，將沉淀用二氧六環洗滌三次后棄去沉淀物，合并上層清液和洗 滌液，抽真空，得到磁性納米晶體干粉，該干粉表面修飾的羧基已被活化成 N-羥基琥珀酰亞胺酯。稱10mg該干粉，加入5mL人IgG(免疫球蛋白，10mg) 的PBS溶液，混勻，4 'C反應24小時，得到Mn304與IgG的共價耦聯物，并釆 用實施例3中類似的電泳方法證明了上述耦聯物的形成。實施例7將2.32 g表面修飾有羧基的Fe304 (10 nm)磁性納米晶體和N-羥基琥珀酰 亞胺(18.4mg，0.16mmol)溶于50mL二甲基甲酰胺中，然后向該溶液中逐滴 加入l mL二環已基碳二亞胺(30.9 mg， 0.15 mmol).的二氯甲烷溶液，室溫條 件下(30'C)反應40分鐘，離心，取上層清液，將沉淀用二甲基甲酰胺洗條 三次后棄去沉淀物，合并上層清液和洗滌液，抽真空，得到磁性納米晶體千 粉，該干粉表面修飾的羧基已被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。稱10mg該干粉， 加入10mL人胰島素(4mg)的PBS溶液，混勻，室溫條件下(25'C)反應2小 時，得到Fe304與人胰島素的共價耦聯物，并采用實施例3中類似的電泳方法證 明了上述耦聯物的形成。實施例8將50 ML實施例2中得到的Fe304與抗CEA嵌合抗體rch 24共價耦聯物的 PBS溶液與1 mL (2，000，000個)表面表達CEA抗原的人結腸癌細胞LS 180在37 'C孵育1小時，離心，用PBS緩沖溶液洗滌三次后，加入200mL0.1。/q的SDS(十 二垸基磺酸鈉)溶液裂解細胞，得到裂解后細胞溶液。按照上述方法，將Fe304 與人IgG (免疫球蛋白)的共價耦聯物和Fe304納米晶體分別與等量的LS 180細 胞在同樣的條件下孵育、洗滌并裂解后，將上述三種細胞裂解液和未處理過 的LS 180細胞的裂解液進行磁共振造影實驗。圖5為磁共振造影實驗所得的T2 加權像。由圖可以看出，與未處理的LS 180細胞相比，Fe304與抗CEA嵌合抗 體rch 24的耦聯物與細胞孵育后，質子的弛豫時間明顯縮短，這就表明Fe30.4納米晶體通過抗CEA嵌合抗體rch 24已經富集在LS 180細胞表面。而將Fe304 與人IgG的耦聯物或Fe304納米晶體與LS 180細胞孵育后，質子的弛豫時間與未 處理的LS 180細胞無明顯差別，這就表明，Fe304納米晶體與抗CEA嵌合抗體 rch24的耦聯物與LS 180細胞之間的相互作用具有特異性。實施例9將0.35 g表面修飾有羧基的氧化釓納米晶體(3.9nm)和11.5 mg(O.l mmol) 的N-羥基琥珀酰亞胺溶于50 mL氯仿溶液中，然后緩慢滴入l mL溶有8.24 mg (0.04 mmol) DCC的氯仿溶液，25'C下反應12小時后，離心去除沉淀，將得到 的上清液真空干燥，得到磁性納米晶體干粉，該干粉表面修飾的羧基已被活 化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。稱取10mg上述干粉，溶于5mLPBS緩沖液中，加 入10 mg人IgG (免疫球蛋白)，4'C下反應24小時，得到氧化釓(Gd203)納米 晶體與人IgG的共價耦聯物，并釆用實施例3中類似的電泳方法證明了上述耦 聯物的形成。實施例IO將10 mg按照實施例l類似方法得到的表面修飾羧基已被活化為N-羥基琥 珀酰亞胺酯的磁性Fe304納米晶體干粉溶于5 mL PBS緩沖液，然后與10 mL溶 有10mgL-賴氨酸的PBS緩沖液(pH=7.4)混合，20'C下反應4小時后，再透 析反應液7小時得到磁性Fe304納米晶體與L-賴氨酸的共價耦聯物。利用紫外一 可見吸收光譜方法，通過采用茚三酮反應檢測未耦聯的賴氨酸的量，確定每 個磁性納米晶體表面耦聯的賴氨酸的數目為300個。實施例ll將0.81 g表面修飾有羧基的磁性氧化鉺納米晶體(3.2 nm)和N-羥基琥珀 酰亞胺(67.9 mg， 0.59 mmol)溶于30mL二氯甲烷中，然后向該溶液中逐滴加 入2mL二環己基碳二亞胺(49.5mg， 0.24mmol)的二氯甲垸溶液，25'C反應8 小時，離心，取上層清液，真空抽干有機溶劑，得到磁性納米晶體干粉，該 干粉表面修飾的羧基已被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。稱10mg該干粉，加入 5mL溶有4mg抗胃癌單克隆抗體3Hll的PBS(pH-7.4)溶液，混勻，4'C反應 6小時，得到氧化鉺納米晶體與抗胃癌單克隆抗體3H11的共價耦聯物，并采用實施例3中類似的電泳方法證明了上述耦聯物的形成。 實施例12將0.23 g表面修飾有羧基的Fe304納米晶體(8.2 nm)和57.7mg (0.5 mmol) NHS溶于100 mL氯仿溶液，然后逐滴加入l mL溶有41.2 mg (0.2 mmol) DCC 的氯仿溶液。25'C下反應12小時，離心去除沉淀，將上清液真空干燥，得到 表面帶有N-羥基琥珀酰亞胺酯基團的磁性Fe304納米晶體干粉。將10 mg該干 粉和l mg乳糖(分子結構式見附圖6)溶于20mL水中，25匸反應40分鐘，得 到磁性Fe304納米晶體與乳糖的耦聯物。耦聯物的紅外光譜測試結果顯示出酰 胺鍵的特征吸收峰，如對應于C-O振動的峰(16卯cm")和對應于C-N伸縮 振動峰(1260 cm")。實施例13將0.58 g表面修飾有羧基的磁性氧化鏑納米晶體(2.3 nm)和N-羥基琥珀 酰亞胺(138mg，1.2mmol)溶于30mL二氯甲垸中，然后向該溶液中逐滴加入 2mLN，N'-二異丙基碳二亞胺(37.8mg,0.3mmol)的二氯甲垸溶液，25 'C反應 6小時，離心，取上層清液，真空抽干有機溶劑，得到磁性納米晶體干粉，該 干粉表面修飾的羧基已被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯，并得到了紅外光譜的 驗證。實施例14將10 mg按照實施例l類似方法得到的表面修飾羧基已被活化為N-羥基琥 珀酰亞胺酯的磁性Fe3O4納米晶體干粉和0.5mg維生素H的水溶性衍生物(分子 結構式見附圖7)溶于20 mL水中，25'C反應1小時，得到磁性Fe304納米晶體 與維生素H的耦聯物，并得到了紅外光譜的驗證，耦聯物的紅外光譜顯示出酰 胺鍵羰基在1680 cm"和N-H鍵在3340 cm"處的特征吸收。實施例15將0.8 g表面修飾有羧基的錳摻雜的磁性氧化鐵納米晶體(6.8 nm)和N-羥基琥珀酰亞胺(138mg，1.2mmol)溶于30mL氯仿中，然后向該溶液中逐 滴加入2mLN,lSr-二異丙基碳二亞胺(37.8 mg， 0.3 mmol)的氯仿溶液，25 °C反應6小時，離心，取上層清液，真空抽干有機溶劑，得到錳摻雜的磁性納 米晶體干粉，該干粉表面修飾的羧基已被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。采用 實施例3的反應條件制備得到的錳摻雜的磁性氧化鐵納米晶體與抗CEA嵌合 抗體rch24的耦聯物，并釆用實施例3中類似的電泳方法證明了上述耦聯物 的形成，電泳結果還說明修飾在磁性納米晶體表面的N-羥基琥珀酰亞胺酯具 有進一步的反應活性。
權利要求
1.一種表面修飾的羧基被活化后的磁性納米晶體干粉，其特征是該磁性納米晶體表面修飾有聚乙二醇或聚乙二醇鏈段，并且表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯。
2. 根據權利要求1所述的磁性納米晶體干粉，其特征是所述的表面修飾 的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉可進一步與帶有胺 基的生物分子在水溶液中混合，實現它們之間的共價耦聯，得到磁性納米晶 體和生物分子的共價耦聯物。
3. 根據權利要求2所述的磁性納米晶體干粉，其特征是所述的表面修飾 的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉與帶有胺基的生物 分子耦聯后在所形成的耦聯物中的摩爾比為1:0.01 1:1000。
4. 根據權利要求1所述的磁性納米晶體干粉，其特征是所述的表面修飾 的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉在4'C干燥避光條 件下放置一年時間以內，仍然保持與帶有胺基的生物分子進行共價耦聯的反 應活性。
5. 根據權利要求2的磁性納米晶體干粉，其特征是所述的帶有胺基的生 物分子選自氨基酸、多肽、蛋白或碳水化合物和核酸的胺基衍i物中的一種。
6. 根據權利要求1所述的磁性納米晶體干粉，其特征是所述的磁性納米 晶體選自磁性這渡金屬及其氧化物、磁性鑭系稀土金屬氧化物，過渡和稀土 金屬摻雜型磁性氧化物，粒徑為1 60納米。
7. —種根據權利要求1 6任一項所述的磁性納米晶體干粉的制備方法，其 特征是，該方法包括以下步驟將表面修飾聚乙二醇或聚乙二醇鏈段的同時帶有羧基的磁性納米晶體溶 于有機溶劑中形成溶液，然后分別加入活化劑N-羥基琥珀酰亞胺的有機溶劑 溶液和活化劑二環已基碳二亞胺或活化劑N，N'-二異丙基碳二亞胺的有機溶劑 溶液，將磁性納米晶體表面修飾的羧基進行活化，室溫下反應40分鐘 18小 時，或在4'C下反應2 24小時；其中，表面修飾有羧基的磁性納米晶體與二 環己基碳二亞胺或N，N'-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2 1:2000, 二環己基 碳二亞胺或N，W-二異丙基碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1:0.9 1:10;或將表面修飾聚乙二醇或聚乙二醇鏈段的同時帶有羧基的磁性納米晶體和活化劑N-羥基琥珀酰亞胺溶于有機溶劑中形成溶液，然后逐滴加入活化劑 二環已基碳二亞胺或活化劑N，W-二異丙基碳二亞胺的有機溶劑溶液，將磁性 納米晶體表面修飾的羧基進行活化，室溫下反應40分鐘 18小時，或在4'C下 反應2 24小時；其中，表面修飾有羧基的磁性納米晶體與二環已基碳二亞胺 或N，N'-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:2 1:2000， 二環已基碳二亞胺或N,N'-二異丙基碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1:0.9 1:10，然后，提取反應液，除去有機溶劑，即可得到表面修飾的羧基被活化成 N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中所述的提取反應液包括將反應液離 心，取上層清液。
9. 根據權利要求7所述的方法，其特征是所述的有機溶劑選自二氯甲烷、 氯仿、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙二醇二甲醚、二氧六環、吡啶、二甲基甲酰 胺、二甲基亞砜中的一種或其中任意兩種的混合物。
10. —種制備磁性納米晶體與生物分子的共價耦聯物的方法，包括將由 權利要求7得到的表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米 晶體干粉與帶有胺基的生物分子在水溶液中混合均勻，室溫下反應30分鐘 4 小時，或在4'C下反應2 24小時，得到磁性納米晶體與生物分子的共價耦聯 物，其中表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉 與帶有胺基的生物分子進行共價耦聯反應的摩爾投料比為1:0.01 1:1000。
全文摘要
本發明涉及表面修飾的功能基團被活化后的磁性納米晶體干粉，特別涉及表面修飾的羧基被活化成N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉及其制備方法。采用DCC和NHS或DIC和NHS作為羧酸基團的活化劑，通過在有機溶劑中將磁性納米晶體表面修飾的羧酸基團活化，制備了表面帶有N-羥基琥珀酰亞胺酯的磁性納米晶體干粉。將該干粉和生物分子在水溶液中混合，可直接生成磁性納米晶體和生物分子的共價耦聯物。該干粉經長期放置后仍然保持與生物分子進行共價耦聯的反應活性；該干粉可以長期保存并便于運輸，與生物分子之間的共價耦聯簡便易行，適于規模化和商業化生產。
文檔編號A61K47/00GK101281810SQ200710187270
公開日2008年10月8日 申請日期2007年11月15日 優先權日2007年4月5日
發明者劉淑潔, 呼鳳琴, 高明遠 申請人:中國科學院化學研究所