專利名稱：：治療心腦血管疾病的中藥提取物的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種治療心腦血管疾病的中藥提取物的制備方法。技術背景心腦血管系統疾病是人類最為常見的一類疾病，已成為當今世界人口的第一大死因。在我國，隨著人口老齡化加速，人民生活水平提高，生活節奏加快，飲食習慣向高熱、高脂化發展，人群中高血壓、高血脂、心力衰竭、腦卒中等心血管系統疾病也已成為危害人類健康及生命的嚴重疾病之一。心血管疾病的高發生率與死亡率，引導了藥物研發與生產的方向，在世界藥品市場中，該類藥物的研發、生產和市場狀況日益受到制藥企業、醫藥商業企業、投資機構和廣大人民的關注。烏藥(XzWera(aggreg她(Sims)Kosterm)系樟禾斗(Lauraceae山胡椒屬(X/"cfera)植物，其膨大塊根入藥，具有溫中散寒、理氣止痛的功效。而烏藥葉在民間及其臨床也被廣泛使用，具有抗菌、消炎作用。通過對烏藥葉化學成分的系統研究及文獻整理，我們發現烏藥葉主要含有兩類成分黃酮類及內酯類，這與市場上公認的對心腦血管疾病有良好治療效果的銀杏葉提取物成分類型極為相近，且成分比例也較為近似。烏藥葉提取物的這些特征，激發了我們進一步研究其藥理活性的興趣。藥理試驗進一步證實，烏藥葉提取物在抗氧化、擴張血管、降低血清膽固醇、增加冠脈流量、抗心率失常等方面均表現出良好的作用，可用于制備治療心腦血管疾病的藥物。專利CN1857610(—種含烏藥葉提取物的保健品及其制備方法)公開了采用烏藥葉提取物與多種中藥材配伍職稱保健品的方法，其中所采用的烏藥葉的提取物系采用簡單的方法提取而成，有效成分含量低(總黃酮含量18。％，倍半萜內酯0.1848%)，。
發明內容本發明的目的是提供一種治療心腦血管疾病的中藥提取物的制備方法。它是烏藥葉加612倍體積百分比濃度為20%95%乙醇，冷浸或加熱回流提取14次，每次0.512小時，提取液過濾，合并，濃縮至0.251.0§生藥/mL，過濾或離心分離后通過AB-8或DuM大孔樹脂柱，烏藥葉與大孔樹脂的重量比為1:15，上柱流速l4BV/h，樹脂柱徑高比為1:31:9;用水洗滌樹脂38BV，洗脫流速為24BV/h，水洗脫液棄去；用體積百分比濃度為20%95°%乙醇洗脫，流速為24BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所述的提取所用乙醇的體積百分比濃度優選30%95%。所述的洗脫樹脂所用乙醇的體積百分比濃度優選30%95%。烏藥葉提取物用于制備治療心腦血管疾病的藥物。本發明采用大孔樹脂精制的方法制備烏藥葉提取物，提取物中有效成分含量顯著提高，其總黃酮含量不低于20%(以蘆丁計)；總內酯含量不低于1%(以烏藥醚內酯計)。該提取物具有抗氧化、擴張血管、降低血清膽固醇、增加冠脈流量、抗心率失常等作用，可用于制備治療心腦血管疾病的藥物。具體實施方式治療心腦血管疾病的提取物的制備方法是烏藥葉加612倍體積百分比濃度為20%95%乙醇，冷浸或加熱回流提取14次，每次0.512小時，提取液過濾，合并，濃縮至0.251.0g生藥/mL，過濾或離心分離后通過大孔樹脂AB-8或Dun大孔樹脂柱，烏藥葉與大孔樹脂的重量比為1:15，上柱流速l4BV/h，樹脂柱徑高比為1:31:9;用水洗滌樹脂38BV，洗脫流速為24BV/h，水洗脫液棄去；用體積百分比濃度為20%95%乙醇洗脫，流速為24BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所制備的烏藥葉提取物中總黃酮含量不低于20%(以戸丁計)，倍半萜內酯不低于1%(以烏藥醚內酯計)。實施例1烏藥葉加6倍30%乙醇，加熱回流提取l次，提取時間為0.5小時，提取液過濾，合并，濃縮至0.25g生藥/mL，過濾后通過AB-8大孔樹脂柱，烏藥葉與AB-8大孔樹脂的重量比為1:1，上柱流速lBV/h，樹脂柱徑高比為1:3;用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為2BV/h，水洗脫液棄去；用30%乙醇洗脫，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。該提取物中總黃酮的含量為21%，倍半萜內酯的含量為1%。實施例2烏藥葉加12倍95%乙醇，加熱回流提取4次，每次2小時，提取液過濾，合并，濃縮至l.Og生藥/mL,離心后通過Dun大孔樹脂柱，烏藥葉與Dnn大孔樹脂的重量比為1:5，上柱流速4BV/h，樹脂柱徑高比為1:9;用水洗滌樹脂犯V，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用95%乙醇洗脫，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所制備的烏藥葉提取物中總黃酮含量為80%(以蘆丁計)，倍半萜內酯含量為12%(以烏藥醚內酯計)。實施例3烏藥葉加8倍70%乙醇，加熱回流提取3次，每次1小時，提取液過濾，合并，濃縮至0.5g生藥/mL，離心后通過AB-8大孔樹脂柱，烏藥葉與AB-8大孔樹脂的重量比為1:2，上柱流速2BV/h，樹脂柱徑高比為1:5;用水洗滌樹脂5BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用70%乙醇洗脫，流速為3BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所制備的烏藥葉提取物中總黃酮含量為53%(以盧丁計)，倍半路內酯含量為8%(以烏藥醚內酯計)。實施例4烏藥葉加10倍50乙醇，加熱回流提取2次，每次2小時，提取液過濾，合并，濃縮至0.5g生藥/mL,過濾后通過Dun大孔樹脂柱，烏藥葉與Dnn大孔樹脂的重量比為1:3，上柱流速2BV/h，樹脂柱徑高比為1:7;用水洗滌樹脂6BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用70%乙醇洗脫，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。所制備的烏藥葉提取物中總黃酮含量為24%(以蘆丁計)，倍半萜內酯含量為6%(以烏藥醚內酯計)。烏藥葉提取物藥效學試驗通過對烏藥葉提取物開展的一系列藥理試驗證明，烏藥葉提取物具有良好的清除自由基、抗氧化的作用，同時，能有效的擴張冠脈血管，增加冠脈流量、明顯改善心肌缺血缺氧、改善缺血腦組織損傷、延緩血栓形成和降低血黏度，具有作為防治心腦血管疾病的天然藥物的巨大潛力。1、抗氧化作用取昆明種小鼠40只，雌雄各半，體重(20士2)g，隨即分為4組鹽水組、小劑量組、大劑量組、銀杏葉提取物組(EGb)，每天給藥1次，連續給藥1周后，腹主靜脈取血lmL，離心分離出血清，測定MDA、NO及SOD含量。結果見表l。表l烏藥葉提取物對小鼠血清MDA、NO、SOD含量的影響(》士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注與生理鹽水比較，*P<0.05,**P<0.01試驗證明，本品能使小鼠血清中SOD含量升高，具有清除氧自由基和抗氧化的能力。2、豚鼠離體心臟冠脈流量試驗取豚鼠25只，每組5只，隨即分為5組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、中、高3個劑量組，EGb對照組。擊頭致昏，迅速取心臟，在4。C任洛氏液中清洗，排除積血。將主動脈套入灌流裝置的套管上，并結扎固定，以純氧飽和的任洛氏液(Ringer-Locke，s)恒速灌流。灌流平衡10min后，連續測定3min的每分冠脈流量，以其平均值作為藥前值。加藥后，記錄13min的每分冠脈流量，取極值，作為藥后值，比較前后變化。表2烏藥葉提取物對豚鼠離體心臟冠脈流量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注與對照組相比*P<0.05,**P<0.01;與藥前相比#P<0.05,##P<0.01試驗證明，不同劑量的烏藥葉提取物均可增加豚鼠離體心臟的冠脈流量。3、垂體后葉素所致大鼠心肌缺血試驗取大鼠50只，雌雄各半，體重180-220g，隨即分成5組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、中、高3個劑量組，EGb對照組。分別靜脈注射給藥，給藥20min后，25烏拉坦5mL/kg.ip麻醉，固定于鼠臺上，記錄正常II導連心電圖后，舌靜脈注射垂體后葉素0.8單位/kg，5s注完。分別記錄0，15，30，60s，3，8min后的II導連心電圖，比較給予垂體后葉素前后，T波高度的變化，進行組間t檢驗。表3烏藥葉提取物對垂體后葉素所致大鼠心肌缺血的治療效果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>10mg/kg100.193±0.0200.257±0.027*#0.412±0.024*#0.298±0.022#0.235±0.018#0.221±0.02820mg/kg100.198±0.0220.231±0.030*0.359±0.036**##0.241±0.031*#0.223±0.029*0.214±0.01840mg/kg100.197±0.0210.214±0.019**0.274±0.033**絲0.215±0.026**0.209±0.019**0.200±0.015*EGb纟Jl100.195±0.0180.231±0.020*#0.344±0.025*##0.291±0.030*#0.229±0.035*0.201±0.020注與對照組相比*P<0.05,**P<0.01;與藥前相比#P<0.05，##P<0.014、小鼠常壓缺氧試驗取小鼠50只，雌雄各半，體重(20士2)g，隨即分成5組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、中、高3個劑量組，EGb對照組。尾靜脈注射給藥20min后分別放入盛有10g堿石灰的容量為250mL磨口瓶內，加蓋密封。觀察其存活時間，以呼吸停止為死亡特征。表4烏藥葉提取物對小鼠常壓缺氧存活時間的影響(》化)劑量ti生存時間(min)生理鹽水1024.9土4.0Omg/kg1030.8土3.5*20mg/kg1036.4土5.4**40mg/kg1041.4土6.3**EGb組1037.3士5,3**與對照組相比叩<0.05,**P<0.015、烏藥葉提取物對實驗性大鼠腦梗死損傷的保護取大鼠(雄性，體重300350g)用戊巴比妥鈉40mg/kgip麻醉，然后在右眼和右耳之間的中點作1.5cm長的切口，分開顳肌，暴露顴突和顳骨，在顴突之頭端l2mm處，用牙科鉆開一直徑為2mm的小孔，將軟腦膜開一小孔，暴露中腦動脈起始部位，用刮刀將腦組織輕輕移開，用微小雙極電凝器灼斷大腦中動脈，然后將顆肌和皮膚分層縫合。取手術成功的32只大鼠，分成4組:分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、高2個劑量組，腦血栓片對照組。連續用藥15d后，將動物處死，取其大腦，以均等間距橫切5個斷面，用1。/。四氮唑藍(TTG)磷酸緩沖液在37"C染色10min后，分離梗死區與非梗死區，稱重，用重量法計算梗死面積，最后將腦組織放入ll(TC烘箱內連續烘干24h，取出稱腦組織干重，算出腦含水量。結果見表5。表5烏藥葉提取物對大鼠實驗性腦梗死得保護作用(》h)劑量n梗死百分率％含水量％生理鹽水829.4±5.684.2±1.1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與對照組相比*P<0.01試驗證明，烏藥葉提取物對大鼠腦梗死模型的損傷有明顯的保護作用，使病灶面積顯著縮小，組織含水量減少，水腫程度明顯減輕。6、對大鼠體內血檢形成的影響取大鼠40只，雌雄各半，隨即分成5組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、中、高3個劑量組，腦血栓片對照組，各組連續灌胃7d，于末次給藥后lh進行體內血栓形成實驗(戊巴比妥鈉40mg/kgip麻醉大鼠，切開頸部皮膚，分離右側頸動脈，在動脈近心端下放置刺激電極，遠心端下放連接儀器的溫度探頭，開通體內血栓形成測定儀，通過刺激電極給予1.5mV直流電刺激7min，以損傷動脈內皮細胞，隨著動脈管腔內血栓逐漸形成，血流逐漸被阻斷，溫度突降，儀器報警，記錄堵塞形成時間。)最后將各組動物頸總動脈采血，肝素抗凝，測定血液黏度參數。結果見表6。表6烏藥葉提取物對大鼠體內血栓形成時間集全血黏度的影響(》±"<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與對照組相比*戶<0.05,**戶<0.01試驗說明烏藥葉提取物能夠明顯延長大鼠體內血栓形成時間，同時各給藥組動物的全血黏度均有不同程度的降低，說明烏藥葉提取物具有較好的抗血栓和改善血液流變學的作用。7、烏藥葉提取物對麻醉犬腦血流量及腦血管膽力的影響取犬20只，每組5只，分成4組分別為生理鹽水組、烏藥葉提取物低、高2個劑量組，腦血栓片對照組。犬用戊巴比妥鈉30mg/kgiv麻醉，氣管插管，分離股動脈，插心導管至腹主動脈，與壓力換能器相連，再接于多道生理記錄儀記錄血壓波形，并讀取主動脈收縮壓(SAP)、舒張壓(DAP)、平均動脈壓(MAP)和心率(HR)，同時，記錄標準II導程心電圖;分離頸總動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈，將內徑3mm的電磁流量計探頭放置在頸總動脈上，以電磁流量計測定頸內動脈血流量(ICBF)。頸內動脈血管阻力(ICVR)=MAP/ICBF，手術后穩定2030min，待上述各項穩定后測正常值，然后進行十二指腸給藥。給藥后30,60,90和120min分別記錄頸內動脈血流量及血管阻力。結果見表7、8。表7烏藥葉提取物對麻醉犬ICBF的影響(用藥后不同時間得ICBF值(ml/min-100g)劑量0min30min60min90min120min生理鹽水9.7土0.99.7土0.89.9±1.010.歸.99.8土1.110mg/kg10.2±1.0lt).5土1.012.3±1.4*12.5士1.2*40tng/kg10.0±0.910.4±0.912.8±1.5"腦血栓片組59,9±0.8lt).4士0.910.9±0.9*12.5±1."12.6土1.3*與對照組相比*尸<0.05,**尸<0.01表8烏藥葉提取物對麻醉犬ICVR的影響(》±"用藥后不同時間得ICBF值(tnl/min-100g)劑量生理鹽水10mg/kg40mg/kg腦血栓片組nOmin30min60min90min120min51.75±0.421.77±0.381.80±0.351.82±0.271.82±0.3051.77±0.291.72±0.331.68±0.29*1.55±0.36**1.57±0.25**51.74±0.341.69±0.291.60±0.31*1.51±0.22**1.48土0.19"51.72±0.211.68±0.261.66±0.31*1.56±0.27**1.54±0.21**與對照組相比*P<0.05，**尸<0.01與空白對照組相比，烏藥葉提取物組在各用藥時間點，對犬的血壓、心電、心律均無明改變，但有增加其ICBF和降低ICVR的作用。權利要求1、一種治療心腦血管疾病的提取物的制備方法，其特征在于烏藥葉加6～12倍體積百分比濃度為20％～95％乙醇，冷浸或加熱回流提取1～4次，每次0.5～12小時，提取液過濾，合并，濃縮至0.25～1.0g生藥/mL，過濾或離心分離后通過AB-8或D101大孔樹脂柱，烏藥葉與大孔樹脂的重量比為1∶1～5，上柱流速1～4BV/h，樹脂柱徑高比為1∶3～1∶9；用水洗滌樹脂3～8BV，洗脫流速為2～4BV/h，水洗脫液棄去；用體積百分比濃度為20％～95％乙醇洗脫，流速為2～4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。2、根據權利要求1所述的一種治療心腦血管疾病的提取物的制備方法，其特征在于提取所用乙醇的體積百分比濃度30%95%。3、根據權利要求1所述的一種治療心腦血管疾病的提取物的制備方法，其特征在于洗脫樹脂所用乙醇的體積百分比濃度30%95%。4、一種如權利要求1所述的治療心腦血管疾病的提取物的用途，其特征在于用于制備治療心腦血管疾病的藥物。全文摘要本發明公開了一種治療心腦血管疾病的提取物的制備方法。它是將烏藥葉加乙醇，冷浸或加熱回流提取，提取液過濾，合并，濃縮，過濾或離心后通過大孔樹脂，先用水洗滌樹脂，水洗脫液棄去；再用乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮，干燥，粉碎，即得烏藥葉提取物。本發明采用大孔樹脂精制的方法制備烏藥葉提取物，提取物中有效成分含量顯著提高。該提取物具有抗氧化、擴張血管、降低血清膽固醇、增加冠脈流量、抗心率失常等作用，可用于制備治療心腦血管疾病的藥物。文檔編號A61P9/10GK101129466SQ20071007062公開日2008年2月27日申請日期2007年8月31日優先權日2007年8月31日發明者劉洪梅,孫銘遙,琳張,欣王,田景奎,鐳羅,谷希達,金鑒璐申請人:浙江大學