專利名稱：：人參皂苷Rh₂的新用途的制作方法人參皂苷Rb的新用途發明領域本發明涉及人參皂苷Rh2的新用途，具體涉及人參皂苷Rh2在制備抗疲勞的保健食品或藥品中的新用途。技術背景人參皂苷Rh2是人參皂苷的一種，因為具有顯著的抗癌活性而備受關注。關于其生理活性以及制備方法等方面的研究論文及專利報道較多，但人參皂苷Rh2具有抗疲勞作用的研究結果至今未見報道，更沒有利用人參皂苷Rh2制備抗疲勞產品的報道。
發明內容本發明的研究者通過小鼠負重游泳實驗以及通過觀察肝糖原變化、血清尿素水平變化以及血乳酸變化情況首次發現并證明了人參皂苷Rh2具有抗疲勞作用。試驗結果表明，經口給予小鼠不同劑量的人參皂苷Rh2，能明顯延長小鼠負重游泳時間；減少肝糖原的消耗量；降低運動時血清尿素水平；對小鼠運動后血乳酸升高有明顯的抑制作用。證明人參皂苷Rh2具有抗疲勞作用。本發明所述的人參皂苷Rh2可以購買市售產品或通過已見報道的酸水解、堿水解或酶水解的方法獲得。把從人參屬植物人參、西洋參、三七等中獲得的人參皂苷Rb,、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd等二醇組人參皂苷進行酸水解或堿水解或酶水解后再進行精制處理可以得到不同純度的人參皂苷Rb。在利用人參皂苷Rh2制備具有抗疲勞功能的產品時可以使用高純度的人參皂苷Rh2單一化合物，也可以使用含有其他人參皂苷的人參皂苷mv混合物。將人參皂苷Rh2與賦形劑或載體混合后即可制備具有抗疲勞功能的產品，其劑型可以是膠囊、片劑、顆粒劑、口服液或飲料或其他適于口服的形式，也可以是注射劑。具體實施方式下面的實施例并不意味著利用人參皂苷Rh2制備的抗疲勞產品僅限于此。實施例l1材料與方法1.1人參皂苷Rh2，白色粉末，利用中國專利00123073.5(申請號)的方法制備。1.2實驗動物由黑龍江省腫瘤研究所實驗動物中心提供的健康雄性昆明種小鼠40只，(批準號為醫動字第09-2-ll號)，體重1822g，隨機分為4組，每組10只，作為抗疲勞一組進行負重游泳實驗；另取雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，作為抗疲勞二組，進行血清尿素測定；再取雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，作為抗疲勞三組，進行肝糖原測定；再取雄性小鼠40只，隨機分為4組，每組10只，作為抗疲勞四組，進行血乳酸測定。1.3劑量設計-人參皂苷Rh2設高中低三個劑量組，即6.7mg/kg體重(低劑量)；13.4mg/kg體重(中劑量)；40.2mg/kg體重(高劑量)；另設一個對照組。以蒸餾水為溶劑各組動物均按20ml/kg體重灌胃容積進行灌胃，對照組灌胃等容積蒸餾水。連續灌胃30天后進行各項指標檢測。1.4儀器與試劑動物天平、電子天平、離心機、水浴、振蕩器、722分光光度計。游泳箱(大約50cmX50cmX40cm)、鉛皮、計時器、血色素吸管、加樣器、試管、離心管。半自動生化分析儀，中生公司生產。尿素測定試劑盒，中生公司生產；蛋白沉淀劑、l%NaF、4%CuS04、乳酸標準液(0.01mg/ml)、1.5%對羥基聯苯。5%三氯醋酸(蒸餾水配制)(TCA)、葡萄糖標準液100ml/dL、72%貼04(蒸餾水配制)、蒽酮試劑(含0.05%的蒽酮，1%的硫脲、用72%的貼04配制)。1.5實驗方法1.5.1負重游泳實驗末次給予受試物30分鐘后，置小鼠在游泳箱中游泳，水深為30cm，水溫25°C，鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，作為小鼠游泳的時間(分鐘)。1.5.2血清尿素測定二乙酰-肟法末次給予受試物30分鐘后，在溫度為3CTC的水中不負重游泳90分鐘，休息60分鐘后撥眼球采血0.5ml。于4"C冰箱約3h后2000rpm離心15分鐘，取血清用半自動生化分析其測定尿素。1.5.3肝糖原測定蒽酮法末次給予受試物后30min處死動物，取肝臟經生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精確稱取肝臟100mg，加入8mlTCA，每管勻槳lmin，將勻漿倒入離心管，以3000轉/min離心15min。將上清夜轉移至另一個試管內。取lml上清液放入10ml離心管中，每管加入95%乙醇4ml，充分混勻至兩種液體間不留有界面。用干凈塞子塞上，將試管放在37-4(TC水浴3h。沉淀完全后，將試管于3000轉/min離心15min。小心倒掉上清液并使試管倒立放置10miru用2ml蒸餾水溶解糖原，加水時將管壁的糖原洗下。如管底的糖原不立即溶解，振蕩管子直到完全溶解。制作試劑空白和標準管試劑空白吸2ml蒸餾水到干凈的離心管標準管吸0.5ml葡萄糖標準液(含100mg/dL葡萄糖)和1.5ml蒸餾水放入同樣的管子。此時將10ml蒽酮試劑用力加入各管，液流(蒽酮試劑)直接進入管子中央>保證充分混合好。從管子中注入蒽酮試劑時起，將管子放在冷水龍頭下沖涼。在所有管子都達到涼水溫度后，將其浸于沸水浴(水浴深度略高于管子液面)15min，然后移到冷水浴。將管內液體移入比色管，再620nm波長下，用試劑空白管調零后測定吸光度。根據所稱取的肝臟重量換算成肝糖原含量(以mg/g肝表示)，并進行統計分析。按下式計算肝糖原含量DU提取液體積每100克肝組織中糖原的毫克數=:一X0.5X,只微X1(WX0"DU:樣品管吸光度提取液體積為8mlDS:標準管吸光度肝組織克數為O.lg0.5:0.5ml葡萄糖標準液中的葡萄糖含量0.9:將葡萄糖換算成糖原的系數1.5.4血乳酸測定末次給予受試物30min后各采血20u1加入5ml試管中(事先已加入0.48mll%NaF溶液)再加入1.5ml蛋白沉淀劑混勻，3000轉/分離心10分鐘，留上清液備用。在溫度3(TC的水中不負重游泳10分鐘后停止，立即釆血20ixl，休息20分鐘后再采血20iil，處理方法同上。三個時間點的上清液均按手工法測定乳酸含量。血乳酸含量按下式計算A壩!J定血乳酸含量(mg/L)=::x100x10A標準管血乳酸曲線下面積^5x(游泳前血乳酸值+3x游泳后Omin的血乳酸值+2x游泳后休息20min的血乳酸值)1.6實驗數據用LKAT軟件進行統計。2結果2.1人參皂苷Rh2對小鼠體重的影響人參皂苷Rh2對小鼠體重的影響分別見表l、表2、表3、表4。表1人參皂苷Rh2對小鼠體重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2人參皂苷Rh2對小鼠體重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3人參皂苷他2對小鼠體重的影響劑量_抗疲勞三組_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表4人參皂苷Rh2對小鼠體重的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表l、2、3、4可見，經口給予小鼠不同劑量的人參皂苷他230大，經統計學處理，抗疲勞一組、二組、三組、四組實驗中動物的體重增長值分別與對照組相比均無顯著差別(P>0.05)，即各實驗組小鼠的體重增長均無明顯差別。2.2人參皂苷Rh2對小鼠負重游泳時間的影響人參皂苷Rh2對小鼠負重游泳時間的影響見表5。表5人參皂苷Rh2對小鼠負重游泳時間的影響組別劑量(rag/kg)動物數(只)游泳時間(分)Q值P(0.05)P商劑量組40.21050.2±9.51*4.3643.85<0.05中劑量組13.41049.0±7345*3.863.49<0.05低劑量組6.71044.8±7.51對照組01039.8±4.98注*與對照組相比差異顯著P<0.05由表5可見，經口給予人參皂苷Rh230天，實驗組的高、中劑量組與對照組相比，能明顯延長小鼠的負重游泳時間。經統計學處理均有顯著性差別(P<0.05)。2.3人參皂苷Rh2對小鼠運動時血清尿素的影響人參皂苷Rh2對小鼠運動時血清尿素的影響見表6表6人參皂苷Rh2對小鼠運動時血清尿素的影響組別劑量(mg/kg)動物數(只)血清尿素(mg/dl)q值P(0.05)P(0.01)p高劑量組40.2109.42±0.96**5.0884.80<0.01中劑量組13.4109.86±1.20*3.9284.45<0.05低劑量組6.71010.3±1.33對照組01011.3±1.26注*與對照組相比差異顯著，P<0.05林與對照組相比差異極顯著，P<0.01由表6可見，經口給予小鼠不同劑量的人參皂苷Rh230天，經統計學處理，高、中劑量組與對照組相比分別有極顯著性差別(P<0.01)和顯著性差別(P<0.05)。2.4人參皂苷Rh2對小鼠肝糖原消耗量的影響人參皂苷Rh2對小鼠肝糖原消耗量的影響見表7表7人參皂苷Rh2對小鼠肝糖原消耗量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*勾對照組相比差異顯著，P<0.05由表7可見，經口給予小鼠不同劑量的人參皂苷Rh230天，高劑量組能減少小鼠肝糖原的消耗。經統計學處理，小鼠肝糖原的消耗量高劑量組與對照組相比有顯著性差別(P<0.05)。2.5人參皂苷Rh2對小鼠運動后血乳酸水平的影響人參皂苷Rh2對小鼠運動后血乳酸水平的影響見表8表8人參皂苷Rh2對小鼠運動后血乳酸水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*與對照組相比差異顯著，P<0.05由表8可見，經口給予小鼠不同劑量的人參皂苷Rh230天，其小鼠運動后的血乳酸曲線下面積高、中劑量組均有明顯下降。經統計學處理，高、中劑量組與對照組比均有顯著差別(P<0.05)，說明人參皂苷Rh2對運動后小鼠的血乳酸升高有明顯的抑制作用。3小結經口給予小鼠不同劑量的人參皂苷Rh230天，能明顯延長小鼠負重游泳時間，減少肝糖原的消耗量，減低運動時血清尿素水平，對小鼠運動后血乳酸升高有明顯的抑制作用。證明人參皂苷Rh2抗疲勞作用。實施例2取純度為98%的人參皂苷他221克，加淀粉104克混合均勻，裝入膠囊，制成1000粒，得每粒含人參皂苷Rb約20毫克的抗疲勞藥品。本品每日服用兩次，每次兩粒。取含人參皂苷他260%的人參葉總皂苷堿水解物35克，加淀粉90克混合均勻，裝入膠囊，制成1000粒，得每粒含人參皂苷Rh2約20毫克的抗疲勞保健食品。本品每日服用兩次，每次兩粒。[人參葉總皂苷水解物參考中國專利00123073.5(申請號)的方法獲得]。實施例4取含人參皂苷私260%的人參葉總皂苷堿水解物70克，加維生素B65克、B^25毫克、無水咖啡因25克以及適量矯味劑，加水50升加熱溶解，制成1000瓶口服液，得每瓶含人參皂苷Rh2約42毫克的抗疲勞保健食品。本品每日服用兩次，每次一瓶。[人參葉總皂苷水解物參考中國專利00123073.5(申請號)的方法獲得]。權利要求1、人參皂苷Rh2在制備抗疲勞產品中的應用。2、權利要求1所述的產品是保健食品或藥品。3、權利要求1所述的抗疲勞是緩解體力疲勞。全文摘要本發明涉及人參皂苷Rh₂的新用途，公開了人參皂苷Rh₂在抗疲勞方面的新用途，屬于醫藥及保健食品領域。文檔編號A61K31/704GK101161246SQ200610131959公開日2008年4月16日申請日期2006年10月12日優先權日2006年10月12日發明者姜二晨,張龍清,李緒文,桂明玉,金樓,鄭美口,金永日申請人:海南亞洲制藥有限公司