專利名稱：接枝納米炭的醫藥用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種接枝納米炭的醫藥用途，特別是接枝納米炭混懸液在制備用于淋巴示蹤(診斷)或淋巴靶向治療的藥物中的應用。
背景技術：
目前尚沒有直接用于治療惡性腫瘤局部淋巴轉移的靶向化療藥物，用于示蹤惡性腫瘤局部淋巴結走向和分布的淋巴示蹤劑，有美國的锝99同位素納米微粒和國內的納米炭混懸注射液。北美的阿霉素脂質體，具有一定的淋巴系統靶向性，但靜脈給藥后，主要聚積在肝臟和脾臟，不能有效到達惡性腫瘤的局部引流淋巴結。
專利號ZL02113731.5，發明名稱一種納米炭混懸組合物的制備方法，公開了一種用于示蹤惡性腫瘤的區域引流淋巴結的納米炭混懸液的制備方法。該技術的特點是由于納米炭表面結構為疏水性質，不能直接在水溶液中分散形成納米炭混懸液，因此必須加入分散助懸輔料，在高剪切力研磨分散設備的機械作用下，才能形成納米炭混懸液。納米炭混懸液注射到局部組織后，能夠選擇性進入局部組織的引流淋巴結，將這些淋巴結染黑，幫助醫生肉眼辨別淋巴結，達到淋巴示蹤的效果，從而有利于清掃這些淋巴結。但是，其中的分散助懸輔料導致混懸液的稠度變大，有礙于進一步提高淋巴示蹤速度，而且，根據美國FDA的資料，作為分散助懸輔料的聚乙烯吡咯烷酮如果進入血液，可影響凝血功能。另外，納米炭吸附能力有限，表面活性基團較少，很難與化療藥物共價鍵結合，不利于進一步開發成淋巴靶向化療藥物。該專利中所描述的納米炭，實質上是一種經過純化除去揮發性有機成分和重金屬成分的炭黑。因此，所述納米炭與炭黑是同一物質。
通過化學或物理方法對納米炭的表面改性，給其表面接上一些化學基團，就成為接枝納米炭(接枝炭黑)。例如，如果接枝后接枝納米炭的表面性質是疏水性的，則這種接枝納米炭并不能在水中分散；接上親水基團的接枝納米炭，就使得其表面的極性增大，成為親水性接枝納米炭，在水中就可以均勻分散，親水性接枝納米炭可以用于制造打印機用墨水，復印機用墨粉，高耐磨輪胎，等等產品。至今為止，尚無接枝納米炭在醫藥領域的淋巴示蹤和淋巴靶向治療方面的應用的相關報道。
發明內容
本發明的技術方案是提供了接枝納米炭在醫藥領域中的用途，具體地說，是接枝納米炭在制備用于淋巴趨向性藥物中的用途。本發明的另一技術方案是提供了含有該接枝納米炭的混懸液及其制備方法和用途。
本發明提供了接枝納米炭在制備用于淋巴趨向性藥物中的用途，所述用途是指接枝納米炭用于活體腫瘤手術中的淋巴示蹤劑或用于直接殺死淋巴結內轉移癌細胞的藥物。所述接枝納米炭是納米炭經過表面改性，接上親水性基團的納米炭。所述接枝納米炭表面接上親水性基團COOH基、酚羥基和/或弱酸基團，故在其表面存在四種以上不同結合能的碳原子，引入的O＝C-OH表面含氧量達到14.34％。其粒徑為5-250nm。
需要特別申明的是，本發明中所使用的接枝納米炭，是將經過純化的炭黑進行親水性修飾得到接枝納米炭。因此，在本發明中接枝納米炭與接枝炭黑是同一物質。
其中，接枝納米炭是制成接枝納米炭混懸液，用于淋巴示蹤和直接殺死淋巴結內轉移癌細胞的靶向藥物上，所述接枝納米炭混懸液含接枝納米炭、生理鹽水和pH調節劑。
所述接枝納米炭混懸液每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭2.5-200克，接枝納米炭的粒徑為10-100nm，混懸液pH值為6.0至8.0。優選為每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭50g，接枝納米炭的粒徑為30-70nm，混懸液的pH值為6.7-7.1。
其中，上述方案中所述pH調節劑為鈉、鉀、鈣的無機鹽溶液；進一步地，所述的pH值調節劑是枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸二氫鈉、氫氧化鈣、碳酸鈣、乳酸鈣等；更進一步地，優選10％w/w氫氧化鈉溶液。
其中，所述接枝納米炭混懸液是由下列方法制備(1)制備接枝納米炭；(2)將接枝納米炭分散于生理鹽水中，用pH調節劑調節接枝納米炭混懸液的pH值為6.0-8.0；(3)將調節pH值后的接枝納米炭混懸液通過微孔濾膜過濾，除去大顆粒和細菌得到接枝納米炭混懸液。
上述步驟(1)制備接枝納米炭包括a、納米炭的氧化接枝反應將由炭黑純化得到的納米炭置于耐酸容器中，加入60-80％w/w濃HNO3，加溫至回流溫度，回流80-200小時；b、分離提取接枝納米炭反應后的炭黑硝酸溶液降溫到常溫，離心，取上層黑色液體，在溫度60-80℃減壓蒸發，在120-200℃的條件干燥得到黑色固體，即接枝納米炭。
進一步地，a步驟中所述納米炭的氧化接枝反應中，濃HNO3濃度為67％w/w，回流時間為100小時；c步驟所述對純化分離提取得到的接枝納米炭進行pH調節，是使用10％NaOH溶液進行調節。
上述步驟(2)所述接枝納米炭分散于生理鹽水中是通過攪拌或超聲震蕩的機械方法使接枝納米炭在生理鹽水中均勻分散成接枝納米炭混懸液；用堿性溶液調節接枝納米炭混懸液的pH值為6.7至7.1。
將調節pH值后的接枝納米炭混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。然后分裝，加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
通過檢測證明，采用本發明的制備工藝制造的接枝納米炭可以直接在水中分散成接枝納米炭混懸液，具有比納米炭混懸液更好的淋巴示蹤和淋巴靶向治療效果。根據用自動電位滴定儀進行接枝納米炭基團和HCl的反滴定對接枝納米炭官能團的檢測結果，可推出其共軛環為12個，分子大小為900左右。
接枝納米炭的粒徑平均在70nm左右，具有淋巴靶向性，并且在接枝納米炭的表面上有大量的羧酸基團和羥基等官能團，使得接枝納米炭具有親水性，可以直接在水或水溶液中形成均勻分散的混懸液；且表面活性基團增多，可與化療藥物共價鍵結合，為接枝納米炭進一步開發成淋巴靶向化療藥物提供了可能的條件。與現有技術比較，制備接枝納米炭混懸液不需要分散助懸輔料，保證制劑的安全性，也不需要使用高剪切力研磨分散設備，操作方便，成本低。
本發明制備的接枝納米炭混懸液在注射到人或動物的機體的部位后，迅速進入注射部位的引流淋巴結，起到淋巴示蹤的效果。將接枝納米炭混懸液注射到惡性腫瘤部位后，可以迅速到達惡性腫瘤的引流淋巴結，同時可以直接殺死淋巴結內的轉移癌細胞，可以作為淋巴靶向化療藥物使用。
圖1透射電鏡檢測接枝納米炭粒徑照片。
圖2作為對照的純化納米炭的紅外光譜檢測圖譜。
圖3接枝納米炭的紅外光譜檢測圖譜。
圖4接枝納米炭的X射線光電子能譜(X PS)檢測圖譜。
圖5作為對照的純化納米炭的X射線光電子能譜(X PS)檢測圖譜。
圖6接枝納米炭的核磁共振檢測圖譜。
圖7接枝納米炭混懸液的激光粒度檢測圖譜。
具體實施例方式
實施例1 納米炭的純化制備采用專利申請號02113731.5，發明名稱“一種納米炭混懸組合物的制備方法”公開的方法，采用40號炭黑為化學原料，經過乙酸乙酯脫脂，酸洗堿洗降低灰分和重金屬，然后大量水洗去酸、堿，制成純化的納米炭，作為制備接枝納米炭的原料。納米炭純化制備工藝步驟如下
1、乙酸乙酯脫脂稱取40號炭黑1600g置于適當的容器中，加6000ml乙酸乙酯。加熱回流1小時，過濾，濾渣重復處理1次，真空干燥2小時，得粗品1420.59g，收率為89.12％，甲苯抽提物透光率為99.98％。
2、酸洗堿洗水洗將上述粗品700g置于適當的容器中，加10％硝酸3000ml，室溫下攪拌2小時，過濾，濾后用去離子水洗至中性。加0.1mol/L氫氧化鈉3000ml，室溫下攪拌1小時，過濾，濾后用去離子水洗滌至中性，120℃干燥5小時，得納米炭樣品660.69g，收率95.27％。
3、檢測對樣品純化前后的檢測結果見表1。表明用乙酸乙酯脫酯及酸洗堿洗可明顯降低炭黑的脂溶性物質、灰分和重金屬的含量，純化前后粒徑未發生變化，形態呈細粒狀，較細的顆粒呈圓狀，較粗的顆粒呈現出由細小顆粒粘附形成。細小顆粒約30nm至70nm，較粗顆粒可達100nm左右。本制備工藝方法簡單易行，收率高，質量穩定。
表1純化前后檢測結果
實施例2 接枝納米炭的制備1、納米炭的氧化接枝反應將由炭黑純化得到的納米炭499.35g置于耐酸容器中，加入20000ml 67％濃HNO3，加溫至100℃，在該溫度下回流100小時。
2、分離提取接枝納米炭待反應后的炭黑硝酸溶液的溫度下降到常溫后，在5600rpm下離心30分鐘，將上層黑色液體移入適當的容器中，在溫度70℃下減壓蒸發后得到深棕黑色固體；將下層的黑色沉淀繼續加入蒸餾水，攪拌2小時，在5600rpm離心30分鐘，離心后的上層液體為黑色，黑色沉淀明顯減少；將上層黑色液體移入適當的容器中，在溫度70℃下減壓蒸發后得到深棕黑色固體。如此重復5次，收集每次離心后上層液經減壓蒸發后得到的黑色固體。
3、對純化分離提取得到的接枝納米炭進行pH調節在上一步所得的黑色固體置于適當的容器中，加入蒸餾水，倒入蒸發器中在150℃的烘箱里烘干，得到黑色固體。將黑色固體轉移至適當的容器中，加入蒸餾水，使用10％NaOH溶液調節pH值至6.9。然后在70℃溫度下減壓蒸發后得到黑色固體461.26克，即是接枝納米炭。
4、取接枝納米炭樣品進行了如下檢測4.1 透射電鏡檢測使用透射電鏡檢測該接枝納米炭的粒徑為30-70nm(圖1)。
4.2 結構分析4.2.1 紅外分析對比作為原料的納米炭的出峰位置1619cm-1和3450cm-1(圖2)，接枝納米炭的紅外圖譜上新出現了2918.8cm-1，1721.6cm-1，1442.5cm-1，1244.0cm-1，929.5cm-1，612.3cm-1等峰(圖3)。其中納米炭在1619cm-1的峰為C＝C伸縮振動。在3450cm-1處的峰為O-H的伸縮振動(可能是納米炭紅外測定過程中吸水所致)；接枝納米炭在3438.4cm-1處為O-H的伸縮振動(同樣可能是炭黑紅外測定過程中吸水所致，也不排除為羰基上的O-H和酚羥基上的O-H)，2918.8cm-1為烴類的C-H振動。1721.6cm-1為C＝O的伸縮振動的吸收，這表明接枝納米炭上引入了O＝C-OH。1619.9cm-1為C＝C的伸縮振動，1549.5cm-1和1442.5cm-1為C-硝基對稱伸展振動和不對稱振動的吸收，1244.0cm-1為C-O的振動。929.5cm-1為羧酸二聚體OH基團面外振動。612.3cm-1為CNO基團的彎曲振動。
4.2.2 元素分析將作為原料的納米炭和接枝納米炭進行對照，發現氧化接枝后的接枝納米炭的表面含碳量明顯減少(減少了43.81％)，含氫量和含氮量略有增加，分別增加1.26％和0.74％。由于在氧化接枝過程中只引入了H、N、O三種元素，所以在未對O含量測定的情況下，可以認為除C、H、N外主要元素為O。因此，可得O的含量增大了39.83％為43.31％。
由上可知，氧化接枝后的接枝納米炭上引入了大量的氧。
4.2.3 XPS(X射線光電子能譜)接枝納米炭表面O有三種結合方式，其中結合能為531.91eV的氧原子據認為是屬于C-O，結合能為532.668eV屬于O-H，結合能為533.568eV屬于O＝C。接枝納米炭的Cls譜(炭黑表面碳元素的1級光電子能譜)上，在289.570eV的位置上出現了一個強峰為O-C＝O的Cls結合能。接枝納米炭表面存在四種不同結合能的碳原子。其中結合能284.600eV認為是屬于接枝納米炭本身綢環結構上的碳原子，結合能285.500eV為C-H的碳原子，結合能286.570eV屬于表面醌基上的碳原子，結合能289.570eV屬于帶強吸電性鄰基的一COOH或過氧化酯基上碳原子(圖4)。
與作為原料的納米炭相比，硝酸氧化后的接枝納米炭表面含碳量由95.6％降至82.83％，氧化后接枝納米炭表面的含氧量增大，由4.4％升至14.34％。并且在其表面引入了含氮物(圖4、圖5)。
4.2.4 核磁共振檢測圖譜在接枝納米炭的13CNMR中，133.208ppm處屬接枝納米炭中的取代芳烴碳，168.491ppm為羧酸上的碳。在113～137ppm范圍內，有一個突出的弧性峰，應該屬接枝納米炭上不同的芳香碳(圖6)。
由以上解析可以看出，接枝納米炭中含有大量的稠環芳碳，也使得接枝納米炭很難分離成單一分子量的物質，同時，可以看到接枝納米炭上引入了羧基。
4.2.5 官能團的檢測用自動電位滴定儀進行接枝納米炭基團和HCl的反滴定測定。
得出COOH基的含量為7.74mmol/g接枝納米炭酚羥基的含量為2.85mmol/g接枝納米炭弱酸基團為1.51mmol/g接枝納米炭其他為1.71mmol/g接枝納米炭由此可知，E/T＝(COOH+OH+CO+NO2)/C(11.201-COOH)，其中C為碳元素的百分含量，COOH、OH、CO、NO2的單位是mmol/g接枝納米炭，E/T＝0.407，推出其共軛環為12個，分子大小為900。
4.2.6 接枝納米炭加熱減量的測定(按GB/T3780.08-92方法測定)W1=M11-m21m11-m01×100]]>其中m01＝20.2718g；m11＝22.2946g m21＝22.1831gW1=22.2946-22.183122.2946-20.2718×100=5.51]]>注W1所測物質的加熱減量值，m01干燥器凈重；m11干燥前干燥器和所測物質重量m21＝干燥后干燥器和所測物質重量。
4.2.7接枝納米炭灰分的測定(按GB/T3780.10-92方法測定)W2=m12-m22m12-m02×100]]>
其中m02＝36.1225g；m12＝37.1276g m22＝36.1344gW2＝1.20注以上m02、m12、m22均取了平均值。注W2所測物質的灰份，m02坩堝凈重；m12焙燒前坩堝和所測物質重量m22焙燒后坩堝和所測物質重量。
4.2.6 接枝納米炭與納米炭在水中的分散性實驗于20℃室溫下實驗，在4只燒杯中分別裝入內容為接枝納米炭10g和雙蒸水200ml；納米炭10g和雙蒸水200ml；接枝納米炭10g和生理鹽水200ml；納米炭10g和生理鹽水200ml。分別對上述燒杯中的內容用玻棒攪拌3分鐘，然后靜置30分鐘，肉眼觀察發現接枝納米炭在雙蒸水和生理鹽水中都均勻分散，激光粒度儀器檢測出平均粒徑為88nm；而納米炭在雙蒸水和生理鹽水中都已經分層，而激光粒度儀器檢測平均粒徑要求樣品在溶媒中均勻分散，因此無法使用激光粒度儀器檢測其平均粒徑。本實驗說明接枝納米炭能夠在水中的直接分散性成混懸液，而納米炭不能夠在水中的直接分散性成混懸液。
實施例3 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑84nm(圖7)，pH值6.9，無菌。
實施例4 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，60℃溫度下，攪拌45分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌45分鐘，停止加溫，冷卻至常溫，加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑92nm，pH值6.9，無菌。
實施例5 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，90℃溫度下，攪拌20分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌20分鐘，停止加溫，冷卻至常溫，加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑88nm，pH值6.9，無菌。
實施例6 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭10克置于500ml容量的玻璃容器中，加入100ml生理鹽水，常溫下，使用超聲波粉碎機，功率30瓦，震蕩30分鐘，加入生理鹽水至200ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
制備了批號040311的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑92nm，pH值6.9，無菌。
實施例7 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭2.5克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑88nm，pH值6.9，無菌。
實施例8 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭200克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑88nm，pH值6.9，無菌。
實施例9 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭25克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑96nm，pH值6.9，無菌。
實施例10 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭75克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑86nm，pH值6.9，無菌。
實施例11 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％碳酸氫鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑84nm，pH值6.9，無菌。
實施例12 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鉀調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑86nm，pH值6.9，無菌。
實施例13 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％碳酸二氫鈉調節pH至6.9。
將上述pH值為6.9的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑84nm，pH值6.9，無菌。
實施例14 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.0。
將上述pH值為6.0的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑88nm，pH值6.9，無菌。
實施例15 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至8.0。
將上述pH值為8.0的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑84nm，pH值6.9，無菌。
實施例16 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.7。
將上述pH值為6.7的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑82nm，pH值6.9，無菌。
實施例17 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至7.1。
將上述pH值為7.1的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑86nm，pH值6.9，無菌。
實施例18 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至6.6。
將上述pH值為6.6的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑88nm，pH值6.9，無菌。
實施例19 接枝納米炭混懸液的制備首先稱取接枝納米炭50克置于2000ml容量的玻璃容器中，加入300ml生理鹽水，常溫下，攪拌60分鐘，再加入300ml生理鹽水，攪拌60分鐘，繼續加入生理鹽水至1000ml，用10％氫氧化鈉調節pH至7.4。
將上述pH值為7.4的混懸液用0.22μm的微孔濾膜過濾，可以在膜的輸入側加壓過濾，也可以膜的輸出側負壓過濾，除去大顆粒和細菌。
分裝1ml/瓶。加塞，壓鋁蓋，檢漏，質檢，包裝。
所制備的接枝納米炭混懸液，顏色為深棕黑色，平均粒徑84nm，pH值6.9，無菌。
以下通過具體的淋巴示蹤試驗進一步說明本發明的有益效果試驗例1 接枝納米炭混懸液中納米炭含量對淋巴示蹤效果的影響將接枝納米炭混懸注射到局部后，對區域引流淋巴結的染色示蹤能力，在一定范圍內與接枝納米炭的含量正相關。為了考慮接枝納米炭含量對接枝納米炭混懸液淋巴示蹤作用的影響，特配制不同濃度的接枝納米炭混懸液，用小白鼠作淋巴示蹤試驗。并用納米炭混懸液作對照。
試驗方法1、將接枝納米炭混懸液中接枝納米炭含量分別配制為不同濃度，即2.5mg/ml、12.5mg/ml、50mg/ml和75mg/ml備用。將納米炭混懸液中納米炭含量分別配制為不同濃度，即2.5mg/ml、12.5mg/ml、50mg/ml和75mg/ml備用。
2、取健康ICR小鼠240只，雌雄各半，均分24組，每組10只。用50μl微量注射器，從小鼠右后腳墊皮下注射不同劑量的納米炭組合物混懸液，在給藥后1、2、4分鐘，分別將各組10只小白鼠斷頸處死，肉眼觀察后腿彎部淋巴結、髂淋巴結和腹主動脈旁淋巴結的染黑程度。黑染程度記分標準是0分為淋巴結顏色無改變，0.5分為淋巴結竇部染成灰色，或者部分黑染，1.0分為整個淋巴結黑染或邊緣竇部染黑。
3、比較組內得分，確定最佳染色的接枝納米炭濃度；比較組間得分，確定接枝納米炭混懸液和納米炭混懸液的淋巴示蹤效果的優劣。結果見表2。
表2炭懸液對小鼠淋巴結黑染程度
注采用SPSS統計軟件進行統計分析，組內比較顯示接枝納米炭混懸液和納米炭混懸液12.5、50.0、75.0mg/kg與2.5mg/kg相比，具有顯著或極顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)；組間比較顯示接枝納米炭混懸液和納米炭混懸液相對應濃度，對后腿彎淋巴結染黑程度無差異，對髂淋巴結和腹主動脈旁淋巴結的染黑程度具有顯著差異(P＜0.05)，說明接枝納米炭混懸液對淋巴結淋巴示蹤效果優于納米炭混懸液。
小鼠皮下注射試驗發現，在注射劑量為0.02ml/只的情況下，使用接枝納米炭濃度為2.5mg/ml的接枝納米炭混懸液時，對第一級的區域淋巴結開始染色，呈現淡灰色，隨著接枝納米炭量增加，染色范圍和程度開始增加，當使用接枝納米炭濃度為50mg/ml的接枝納米炭混懸液，可以很好染色注射區域引流淋巴結，達到淋巴示蹤的效果，再增大劑量時，染色程度無明顯增加。因此，確定本品的規格為每支1ml，含接枝納米炭50mg，劑量適中，合理，便于臨床使用。本實驗結果證明，接枝納米炭混懸液的淋巴示蹤效果優于納米炭混懸液的淋巴示蹤效果。
試驗例2 接枝納米炭混懸液pH值對淋巴示蹤效果的影響為了考察接枝納米炭混懸液pH值對其示蹤作用的影響，特配制不同pH值的接枝納米炭混懸液，用小白鼠作淋巴示蹤試驗。
試驗方法1、pH調節劑枸櫞酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉、碳酸二氫鈉、氫氧化鈣、碳酸鈣、乳酸鈣等。將接枝納米炭混懸液分別調節為不同pH值備用。結果發現采用10％氫氧化鈉調節pH值最佳。
2、取健康ICR小鼠70只，雌雄各半，均分7組，每組10只。用50μl微量注射器，從小鼠右后腳墊皮下注射，劑量為50mg/kg，在給藥后8分鐘，將各組小白鼠斷頸處死，肉眼觀察腹主動脈旁淋巴結的染黑程度。黑染程度記分標準是0分為淋巴結顏色無改變，0.5分為淋巴結竇部染成灰色，或者部分黑染，1.0分為整個淋巴結黑染或邊緣竇部染黑。
3、比較得分，確定最佳染色的pH值。
表3試驗條件及結果
從以上結果可以看出，當混懸液pH在6.0-8.0時，其示蹤性能較好，其中最好pH值為6.7-7.1。
使用10％氫氧化鈉溶液將接枝納米炭混懸液的pH值調節為6.0-8.0，最佳為6.7-7.1。這種條件下接枝納米炭混懸液進入注射部位引流淋巴結的速度最快。而在過酸或過堿的情況下，接枝納米炭混懸液進入注射部位引流淋巴結的速度明顯下降，甚至不能進入注射部位引流淋巴結。
試驗例3 接枝納米炭混懸液對4T1乳腺癌動物模型淋巴結轉移癌的療效觀察目的研究接枝納米炭混懸液對4T1乳腺癌動物模型淋巴結轉移癌的療效材料4T1乳腺癌細胞，細胞密度為107·ml-1。BALB/C小鼠50只，平均體重18克·只-1，均分成低劑量實驗組、高劑量實驗組、陰性模型對照組、陰性空白對照組和陽性對照組。
方法在低劑量實驗組、高劑量實驗組、陰性模型對照組和陽性對照組BALB/C小鼠的左下肢腳墊注射接種4T1乳腺癌細胞，每只小鼠接種20μl；在陰性空白對照組BALB/C小鼠的左下肢腳墊注射培養液，每只小鼠接種20μl。常規飼養4周后，所有實驗組(除陰性空白對照組)的BALB/C小鼠的左下肢腳墊均長出0.3～0.7cm大小的腫瘤。在低劑量實驗組BALB/C小鼠的左下肢腳墊的腫瘤注射接枝納米炭混懸液20μl，在高劑量實驗組BALB/C小鼠的左下肢腳墊的腫瘤注射接枝納米炭混懸液20μl，在陽性對照組BALB/C小鼠的左下肢腳墊的腫瘤注射5-氟尿嘧啶20μl，在所有陰性對照組BALB/C小鼠的左下肢腳墊的腫瘤注射生理鹽水20μl。給藥后120小時處死所有小鼠，摘取接種同側的腿彎部淋巴結，病理切片，HE染色觀察。同時摘取接種同側腳墊的腫瘤組織，勻漿，臺盼藍染色，倒置顯微鏡下計數4T1乳腺癌細胞數目。
結果病理切片顯示，所有實驗組、陽性對照組和陰性模型對照組BALB/C小鼠的接種同側的腿彎部淋巴結均發生4T1乳腺癌轉移，左下肢腳墊的腫瘤注射接枝納米炭混懸液后120小時，同側的腿彎部淋巴結內聚集大量接枝納米炭顆粒，淋巴結的癌轉移灶內也有大量接枝納米炭顆粒，但是淋巴結周圍未見接枝納米炭顆粒存在。在這些淋巴結癌轉移灶的摩爾濃度比在1∶1，1∶2，1∶4時呈現出協同作用效果。
黃芩甙元或黃芩甙單獨使用時的IC50濃度，以及聯合用藥后的各IC50濃度通過相同軟件計算出。并計算出藥效增強比。結果見表10表10
單用黃芩甙元和黃芩甙時其IC50分別為12.33μm和19.2μm。當黃芩甙元與黃芩甙混合作用后，當黃芩甙元與黃芩甙摩爾濃度比在1比1時IC50下降為5.845μm，當黃芩甙元與黃芩甙摩爾濃度比在1比2時IC50下降為4.7472μm。當黃芩甙元與黃芩甙摩爾濃度比為1比4時IC50下降至2.9565μm。
通過計算兩種藥物單獨使用時的IC 50濃度和聯合用藥后的IC50濃度比顯示聯合用藥后，兩種藥物的藥效分別提高了2-4倍。
實施例6黃芩甙和黃芩甙元在抗乳腺癌上的協同作用人乳腺癌細胞株MCF-7，將細胞株懸浮在含有10％(小)牛胎兒血清的細胞培養液中，以1×103/孔播種于96孔細胞培養盤。在培養24小時后，加入黃芩甙或黃芩甙元。并將兩者以不同摩爾濃度比混合加入培養液里。培養72小時后作MTT測定。用四氮唑鹽(MTT)法染色并計算單用及聯用黃芩甙元或/和黃芩甙對MCF-7增殖的抑制率，用CalcuSyn統計軟件及聯合用藥系數值(CI)法進行數據分析。
權利要求
1.接枝納米炭在制備用于淋巴趨向性藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述用途是指接枝納米炭用于活體腫瘤手術中的淋巴示蹤劑或用于直接殺死淋巴結內轉移癌細胞的藥物。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述接枝納米炭是指納米炭經過表面改性，接上親水性基團COOH基、酚羥基和/或弱酸基團的納米炭。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述接枝納米炭的粒徑為5～250nm。
5.根據權利要求4所述的用途，其特征在于所述接枝納米炭的粒徑為50～150nm。
6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于所述接枝納米炭加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備成混懸液，所述的藥學上可接受的輔料或輔助性成分不含助懸輔料。
7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭2.5-200克，混懸液pH值為6.0～8.0。
8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭50g，混懸液的pH值為6.7～7.1。
9.根據權利要求6所述的用途，其特征在于所述混懸液是由下列方法制備a、制備接枝納米炭；b、將接枝納米炭分散于生理鹽水中，用pH調節劑調節接枝納米炭混懸液的pH值為6.0-8.0；c、將調節pH值后的接枝納米炭混懸液通過微孔濾膜過濾，得到接枝納米炭混懸液。
10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于步驟a所述的接枝納米炭制備方法包括如下步驟a、納米炭的氧化接枝反應將由炭黑純化得到的納米炭置于耐酸容器中，加入60-80％w/w濃HNO3，80～120℃回流；b、分離提取接枝納米炭反應后的炭黑硝酸溶液降溫到常溫，分離，取上層黑色液體，蒸發、干燥，得到黑色固體即接枝納米炭。
11.根據權利要求10所述的用途，其特征在于a步驟中所述納米炭的氧化接枝反應中，濃HNO3濃度為67％w/w，回流溫度為90～100℃；b步驟蒸發條件為60-80℃減壓蒸發；干燥條件為120-200℃。
12.一種接枝納米炭混懸液，它是由用于淋巴示蹤的靶向藥物或直接殺死淋巴結內轉移癌細胞的接枝納米炭，加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的混懸液。
13.根據權利要求12所述的接枝納米炭混懸液，其特征在于每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭2.5-200克，混懸液pH值為6.0～8.0。
14.根據權利要求13所述的接枝納米炭混懸液，其特征在于每1000ml接枝納米炭混懸液中含接枝納米炭50g，混懸液的pH值為6.7～7.1。
15.一種制備權利要求14所述的接枝納米炭混懸液的方法，它包括如下步驟a、制備接枝納米炭；b、將接枝納米炭分散于生理鹽水中，用pH調節劑調節接枝納米炭混懸液的pH值為6.0-8.0；c、將調節pH值后的接枝納米炭混懸液通過微孔濾膜過濾，得到接枝納米炭混懸液。
16.根據權利要求15所述的接枝納米炭混懸液的制備方法，其特征在于步驟a所述的接枝納米炭制備方法包括如下步驟a、納米炭的氧化接枝反應將由炭黑純化得到的納米炭置于耐酸容器中，加入60-80％w/w濃HNO3，80～120℃回流；b、分離提取接枝納米炭反應后的炭黑硝酸溶液降溫到常溫，分離，取上層黑色液體，蒸發、干燥，得到黑色固體即接枝納米炭。
17.根據權利要求16所述的接枝納米炭混懸液的制備方法，其特征在于a步驟中所述納米炭的氧化接枝反應中，濃HNO3濃度為67％w/w，回流溫度為90～100℃；b步驟蒸發條件為60-80℃減壓蒸發；干燥條件為120-200℃。
全文摘要
本發明涉及接枝納米炭在制備用于淋巴示蹤的靶向藥物中的用途或用于直接殺死淋巴結內轉移癌細胞的藥物中的用途。所述接枝納米炭是納米炭經過表面改性，接上親水性基團的納米炭，它可以直接在水中分散成接枝納米炭混懸液，不需要分散助懸輔料，也不需要使用高剪切力研磨分散設備，具有比納米炭混懸液更好的淋巴示蹤和淋巴靶向治療效果，同時可以直接殺死淋巴結內的轉移癌細胞，可以作為淋巴靶向化療藥物使用。且表面活性基團增多，可與化療藥物共價鍵結合，為接枝納米炭進一步開發成淋巴靶向化療藥物提供了可能的條件。
文檔編號A61P35/00GK1679625SQ20051005496
公開日2005年10月12日 申請日期2005年3月18日 優先權日2004年3月26日
發明者唐小海, 邱宇 申請人:成都市藥友科技發展有限公司