專利名稱：血管化增強的移植構造物的制作方法
技術領域：
本發明涉及來源于基質組分的血管化增強的組織移植物以及它們修復患病或受損組織的用途。更具體而言，本發明涉及血管化增強的組織移植物，它包括已經用內皮細胞和至少一種附加的預選的外源性細胞群接種的來源于胃粘膜下層或膀胱的基質組分，從而提高組織移植構造物的修復能力。
背景技術：
和概述本發明涉及一種用于修復受損或患病組織的組織移植構造物，它包括用內皮細胞和至少一種附加的預選的外源性細胞群接種的基質組分。本發明所用的基質組分選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物。所述基質組分優選包括高度保守的膠原、糖蛋白、蛋白聚糖、和糖胺聚糖。本發明所用的基質組分來源于溫血脊椎動物的膀胱或胃組織。
本發明組織移植構造物的粘膜下層成分基本上是無細胞的基質，提供類似體內基質環境的良好細胞生長基質。基質組分的天然組成和構型提供了一種獨特的細胞生長基質，它可促進體外細胞附著和增殖，并在體內植入移植構造物時誘導組織重塑。
作為組織移植材料，膀胱粘膜下層和胃粘膜下層可誘導內源性組織在植入到宿主中后生長(即，移植材料誘導重塑)。當用于這類應用中時，組織移植構造物似乎不僅作為被移植構造物替換的組織的生長或再生長的基質起作用，而且可促進或誘導內源性組織的這種生長或再生長。這些移植材料以可植入片的形式或可注射的流體或凝膠形式使用，從而誘導內源性組織的再生長。
本發明涉及組織移植構造物，它包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，此外還包括加入的內皮細胞和至少一種附加的預選的外源性細胞群。本發明還涉及增強組織移植構造物體內血管化的方法。血管化提高的組織移植構造物是在將組織移植構造物植入或注射到宿主中前，通過用內皮細胞或內皮細胞前體(例如，祖細胞或干細胞)和至少一種附加的預選或預定的細胞類型體外接種基質組分而制備的。
其中一個實施方案提供一種用于修復患病或受損組織的組織移植構造物。所述組織移植構造物包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，加入的內皮細胞，和至少一種附加的預選的外源性細胞群。
在另一實施方案中，提供血管化的組織移植構造物用于修復患病或受損組織。所述組織移植構造物包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，加入的內皮細胞，和至少一種附加的預選的外源性細胞群，其中所述內皮細胞已經在基質組分上培養過一段時間，這段時間足夠體外形成血管或血管樣結構。
在另一實施方案中，提供一種用于增強組織移植構造物體內血管化的方法。該方法包括用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群外接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，從而形成移植構造物，然后將移植構造物植入到脊椎動物中需要修復的部位的步驟。
在另一實施方案中，提供一種用于增強組織移植構造物體內血管化的方法。該方法包括用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群外接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，體外培養內皮細胞一段時間，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構或成分的形成，然后將移植構造物植入到脊椎動物中需要修復的部位的步驟。
在這些方法實施方案的任何一個中，可用內皮細胞接種基質組分后，再用附加的預選的細胞群接種基質組分，也可在用內皮細胞接種基質組分前，用附加的預選的細胞群接種基質組分，或用內皮細胞和附加的預選的細胞群同時或近乎同時接種基質組分。
可將內皮細胞在基質組分上體外培養一段時間，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構的形成，或將內皮細胞在基質培養物上培養一段時間，這段時間足夠在沒有體外形成血管或血管樣結構的情況下，使內皮細胞擴增(即，使內皮細胞分裂至少一次)。可選擇性地，可在內皮細胞沒有擴增的情況下植入移植構造物。在這些實施方案的任何一個中，在植入移植構造物前，附加的預選的細胞群可以擴增或沒有擴增(即，允許發展經過至少一個細胞分裂周期)。
在另一實施方案中，提供一種制備用于修復患病或受損組織的組織移植構造物的方法。該方法包括用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，從而形成移植構造物的步驟。該方法還可進一步包括在基質組分上體外培養內皮細胞一段時間的步驟，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構的形成。
在這些實施方案的任何一個中，至少一種附加的細胞群包括未角化或角化的上皮細胞群或選自成纖維細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、多-潛能祖細胞(例如，干細胞)、周細胞和成骨細胞的中胚層來源的細胞群。在各種實施方案中，可用內皮細胞和一種或多種這些附加的細胞類型接種基質組分(即，可用內皮細胞和這些附加的細胞類型的一種、兩種、三種等接種基質組分)。
附圖簡述

圖1提供描述本發明移植構造物的可選的制備方法的流程圖。
圖2是表示用內皮細胞接種的組織移植物的組織學切片的顯微照片。
圖3是表示用內皮細胞和3T3細胞接種的組織移植物的組織學切片的顯微照片。
發明詳述本發明涉及一種組織移植構造物，它包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，而且還包括加入的內皮細胞和至少一種附加的預選的外源性細胞群。所述基質組分是用內皮細胞和預選的外源性細胞群接種的，并用于修復患病或受損組織。按照本發明，“受損組織”是指受到損害的、撕裂的、切斷的組織，或已經手術除去或以其它方式從需要修復的部位失去的組織(例如，先天缺乏或畸形)。基質組分優選是從來源于選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的組織的胞外基質組分制備的。用于本發明的內皮細胞可來源于任何類型的內皮細胞群，包括大血管、微血管、動脈、和靜脈內皮細胞。不論是成熟的內皮細胞(例如，從器官或血管采集的)還是內皮細胞前體(例如，祖細胞或干細胞)都可用于本發明。此外，內皮細胞可從幼年或老年動物中采集，但優選從幼年動物采集的內皮細胞。
在其中一個實施方案中，附加的預選的外源性細胞群可包括未-角化或角化的上皮細胞群或選自成纖維細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、多-潛能祖細胞、周細胞、成骨細胞、和任何其它適宜細胞類型的中胚層來源的細胞群。
與基質組分和內皮細胞組合的附加的預選的外源性細胞群可以所要修復組織的細胞類型為基礎選擇。例如，如果要修復皮膚，預選的外源性細胞群可以是未角化的上皮細胞或如果要修復心臟組織，則預選的外源性細胞群可以是心肌細胞。在另一實施方案中，使用從待治療患者中分離的自體細胞接種基質組分。
在其中一個實施方案中，與基質組分和內皮細胞組合的至少一種附加的預選的細胞群包括能夠分化成平滑肌細胞的平滑肌細胞和/或祖細胞。有利地，平滑肌細胞和/或平滑肌祖細胞可促進(連同內皮細胞)血管或血管樣結構在移植構造物中的形成。在另一實施方案中，附加的細胞類型可連同內皮細胞、平滑肌細胞、和/或平滑肌祖細胞一起加入。
在另一實施方案中，至少一種附加的預選的外源性細胞群包括多-潛能祖細胞群。基質組分可誘導這些多-潛能祖細胞分化成幫助受損組織修復的細胞。有利地，可將用內皮細胞群和多-潛能祖細胞群接種的基質組分植入到體內多個不同的部位，且祖細胞將分化成對特殊環境較為適宜的細胞類型。例如，包括內皮細胞和多-潛能祖細胞的組分在腱或韌帶部位的植入可導致移植構造物重塑成腱或韌帶。
和使用與單獨的內皮細胞組合的單獨的基質組分，或與除內皮細胞外的細胞類型組合的單獨的基質組分作為治療劑相比，基質組分、內皮細胞、和附加的預選的外源性細胞群的組合所提供的組織移植構造物在體外和/或體內顯示出令人吃驚的提高的血管化，從而產生提高的傷口愈合能力和更好的組織功能恢復。
在各實施方案中，可在用內皮細胞接種基質組分后，再用附加的預選的細胞群接種基質組分，也可在用內皮細胞接種基質組分前，用附加的預選的細胞群接種基質組分，或可用內皮細胞和附加的預選的細胞群同時或近乎同時接種基質組分(見圖1的各種舉例性實施方案)。
在其中一個這樣的實施方案中，可用內皮細胞接種基質組分，并在將所述構造物植入到受影響的區域之前，在基質組分上培養內皮細胞一段時間，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構的形成。可在用內皮細胞接種基質組分后以及在將移植構造物體內植入前的任何時間，用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分。因此，根據植入移植構造物前在基質組分上培養預選細胞群的時間的不同，在將移植構造物植入到受影響的區域前，附加的預選的細胞群可以擴增或沒有擴增(即，允許發展經過至少一個細胞分裂周期)。
可選擇性地，可在用內皮細胞接種基質組分后，用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分，且可在植入移植物前，在基質組分上培養內皮細胞，使內皮細胞擴增，而不會誘導血管或血管樣結構或成分的形成。在該實施方案中，根據植入移植構造物前在基質組分上培養預選細胞群時間的不同，在將移植構造物植入到受影響的區域前，附加的預選的細胞群可以擴增或沒有擴增。
在另一實施方案中，可在用內皮細胞接種基質組分后，用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分，且在內皮細胞或附加的預選的外源性細胞群沒有擴增的情況下，稍后即植入基質組分。
在選擇性實施方案中，可用附加的預選的外源性細胞群接種基質組分，并在植入移植構造物前，在基質組分上培養預選的細胞群，從而使預選的細胞群擴增(即，使細胞分裂至少一次)。在該實施方案中，可在用預選細胞群接種基質組分后以及體內植入移植物前的任何時間，用內皮細胞接種基質組分。因此，根據植入移植物前在基質組分上培養內皮細胞時間的不同，在將移植構造物植入到受影響的區域前，內皮細胞可擴增或沒有擴增。如果內皮細胞擴增，內皮細胞的擴增可包括或不包括血管或血管樣結構的形成。
在另一實施方案中，可在用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分前，用內皮細胞接種基質組分，且在內皮細胞或附加的預選的外源性細胞群沒有擴增的情況下，稍后即植入移植物。
在另一實施方案中，可用內皮細胞和附加的預選的外源性細胞群同時或近乎同時接種基質組分。在該實施方案中，可在基質組分上培養內皮細胞和附加的預選的外源性細胞群，從而使兩個細胞群擴增，或在兩個細胞群沒有擴增的情況下植入移植物。如果內皮細胞擴增，則內皮細胞的擴增可包括或不包括血管或血管樣結構的形成。
選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分可有利地提供一種生理環境，支持在基質組分上體外培養的細胞的增殖和分化。因此，可將細胞接種在基質組分上，并按照下面所述使用本領域那些普通技術人員已知的標準細胞培養技術培養，從而生產用于植入到需要它的宿主中的組織移植物。
選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分提供支持細胞生長的基質的能力可在植入到宿主中前，提供使內皮細胞群和/或附加的預選的外源性細胞群擴增的機會。如果內皮細胞擴增，則這種擴增可在植入前導致血管或血管-樣結構的形成(即，移植構造物的體外潛在的血管化)，從而在植入移植構造物后，立即提高移植物的傷口愈合能力。植入移植構造物前的血管或血管樣結構的形成或，可選擇性地，植入移植構造物前的內皮細胞擴增可提高植入后的移植物的傷口愈合能力，如通過促進在膀胱或胃粘膜下層組織片近腔(abluminal)側上生長的細胞的分化和遷移，并通過促進這些細胞在自身粘膜下層組織內的增殖而實現。
植入前，在基質組分上培養加入的內皮細胞和附加的預選的外源性細胞群的實施方案中，細胞是在有利于細胞生長的條件下，在基質組分上培養的。所培養的細胞可與基質組分直接或間接接觸(例如，流體連通)。有利于細胞生長的條件是環境條件，如無菌技術、溫度(例如，約37℃)和營養供給，這些對于在目前組織和細胞培養所接受的過程下進行的細胞生長而言，被認為是最佳的。雖然最佳培養條件取決于特定的細胞類型，但細胞生長條件通常是本領域熟知的。
本發明的基質組分可以各種形式被用作移植材料，并在植入移植構造物前，用于體外培養內皮細胞和其它細胞類型。這些形式包括片樣構型、凝膠形式、流化組分(例如，通過粉碎或消化組織)、和提取物，用于加入本領域-認可的細胞/組織培養基。基質組分或其成分可提供用于細胞粘附的表面和/或可誘導分化和/或增殖。在組織/細胞培養應用中使用之前，優選將基質組分滅菌，然而，如果細胞培養基中包含抗生素的話，也可使用未滅菌的組分。
按照本發明的其中一個實施方案，膀胱或胃粘膜下層的組織移植構造物(其中粘膜下層組織是從肌層和至少粘膜下層組織的粘膜層的腔部分剝離的)被用作移植材料，并在植入移植構造物前，用于體外培養內皮細胞和其它細胞類型。以這種方式剝離的膀胱或胃粘膜下層組織可按照本發明以片的形式、凝膠的形式或作為流化組分，如消化物或提取物的形式使用。
在其中一個實施方案中，植入移植構造物前，在有利于細胞增殖以用于細胞培養的條件下，在膀胱或胃粘膜下層組織片上直接接種細胞。這些組織的多孔性使細胞營養物在基質中擴散。因此，細胞可被接種在膀胱或胃粘膜下層組織片的腔和/或近腔面上并培養。膀胱或胃粘膜下層組織的腔面是面向器官腔的表面，且在體內通常與內粘膜層相鄰，而近腔面是遠離器官腔的表面，且通常與器官來源中的平滑肌組織接觸。
在粘膜下層組織的固體片上培養的細胞顯示出不同的生長模式，并根據細胞在粘膜下層片的哪一側生長，與粘膜下層生長基質的相互作用也不同。在粘膜下層組織片上培養的內皮細胞的組織學檢查揭示了接種在近腔面上的內皮細胞不僅沿著粘膜下層組織的表面生長/增殖，而且它們還更容易遷移到粘膜下層組織自身內并增殖。粘膜下層組織的腔面包括較之近腔側更致密的基質，并因此，細胞不太可能穿透腔面。接種在粘膜下層組織腔面上的細胞與基質粘附，但通常不會穿透基質表面。
在植入移植構造物前接種在基質組分上的內皮細胞和/或附加的預選的外源性細胞群可在有營養物，包括礦物質、氨基酸、糖、肽、蛋白、或糖蛋白、如層連蛋白和纖連蛋白、和/或生長因子如表皮生長因子、血管內皮細胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉化生長因子β、成纖維細胞生長因子、或其它血清生長因子存在的條件下生長。在其中一個實施方案中，流化或粉末形式的基質組分可用于補充標準細胞培養基，從而提高支持并誘導細胞體外增殖的能力，并誘導體內重塑。在有可商業得到的細胞培養液體培養基(含血清或不含血清)存在的條件下，使細胞在基質組分上生長。
在其中一個實施方案中，與基質組分和內皮細胞組合的至少一種附加的預選的細胞群可以是平滑肌細胞和/或能夠分化成平滑肌細胞的祖細胞，從而促進(連同內皮細胞)血管或血管樣結構在移植構造物中形成。已知用肝素酶處理平滑肌細胞可誘導增殖細胞的表型改變性質。因此，在用內皮細胞和至少一種預選的外源性細胞群，包括平滑肌細胞群和/或平滑肌細胞祖細胞群接種基質組分的實施方案中，肝素酶可包括在細胞培養基中。例如，來源于肝素鞘氨醇桿菌的4個單位/ml的肝素酶可短時間(例如，6小時)包含在培養基中或可持續存在于培養基中。
還已知作為細胞的亞匯合單層被接種在基質上的平滑肌細胞經歷與分裂能力相關的表型改變。如果將平滑肌細胞與內皮細胞的匯合單層共同培養，則表型改變被抑制。因此，在用內皮細胞和至少一種預選的外源性細胞群，包括平滑肌細胞群和/或平滑肌細胞祖細胞群接種基質組分的實施方案中，可將加入的內皮細胞接種在基質組分上，從而使細胞與基質組分粘附作為細胞的亞匯合單層。在另一實施方案中，可將內皮細胞、平滑肌細胞、和/或平滑肌祖細胞接種在基質組分上，這樣細胞就可與基質組分粘附作為細胞的亞匯合單層。
已經很好地證明了粘膜下層能夠在植入后，立即在很多體內微環境(例如，腱、韌帶、骨、關節軟骨、動脈、和靜脈)中誘導宿主組織增殖、重塑和適宜組織結構的再生。用于誘導內源性組織形成的、片形式和流化形式的膀胱和胃粘膜下層組織的使用在美國專利U.S.Nos.5,554,389，6,099,567，和6,264,992中描述并要求保護，其內容引入此處作為參考。因此，本發明的膀胱或胃粘膜下層組織移植物被體內植入，從而誘導需要修復的受損組織重塑。
在其中一個實施方案中，所要求保護的包括基質組分、加入的內皮細胞、和附加的預選的外源性細胞群的組合物可被包封在生物適合性基質中，用于植入到宿主中。包封的基質可被構造成使營養物擴散至包封的細胞，同時使包封細胞的產物從包封的細胞擴散至宿主細胞。用于包封活細胞的適宜的生物相容性聚合物是本領域那些技術人員已知的。例如，聚賴氨酸/藻酸鹽包封過程先前已經由F.Lim和A.Sun(Science，Vol.210，pp.908-910)描述。事實上，按照本發明，膀胱或胃粘膜下層本身可被有利地用于包封基質上的細胞，作為人工器官植入。
在其中一個實施方案中，提供一種用于增強組織移植構造物體內血管化的方法。該方法包括下列步驟用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群外接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，從而形成移植構造物，并將移植構造物植入到脊椎動物中需要修復的部位。在該方法的其中一個實施方案中，可用內皮細胞接種基質組分，并在將所述構造物植入到受影響區域中前，在基質組分上培養內皮細胞一段時間，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構的形成。在用內皮細胞接種移植物后且在體內植入移植物前的任何時間，可用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分。因此，根據植入移植構造物前在基質組分上培養預選細胞群的時間的不同，在將移植構造物植入到受影響區域中前，附加的預選的細胞群可以擴增或沒有擴增。
可選擇性地，可在用內皮細胞接種基質組分后，用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分，并在植入移植物前，在基質組分上培養內皮細胞，從而使內皮細胞擴增而不會誘導血管或血管樣結構的形成。在該實施方案中，根據植入移植構造物前在基質組分上培養內皮細胞的時間的不同，在將移植構造物植入到受影響區域中前，附加的預選的細胞群可擴增或沒有擴增。
在另一實施方案中，可在用內皮細胞接種基質組分后，用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分，且隨后即植入移植物，而內皮細胞或附加的預選的外源性細胞群沒有擴增。
在本方法的選擇性實施方案中，可用附加的預選的外源性細胞群接種基質組分，并在植入移植構造物前，在基質組分上培養預選的細胞群，從而使預選的細胞群擴增。在該實施方案中，可在用預選細胞群接種基質組分后且體內植入移植物前的任何時間，用內皮細胞接種基質組分。因此，根據植入移植物前通過在基質組分上培養細胞而使內皮細胞擴增的時間的不同，在將移植構造物植入到受影響區域之前，內皮細胞可能擴增或沒有擴增。如果內皮細胞擴增，則內皮細胞的擴增可能包括或不包括血管或血管樣結構的形成。
在另一實施方案中，可在用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分后，用內皮細胞接種基質組分，且可隨后即植入移植物，而內皮細胞或附加的預選的外源性細胞群沒有擴增。
在另一實施方案中，可用內皮細胞和附加的預選的外源性細胞群同時或近乎同時接種基質組分。在該實施方案中，可在基質組分上培養內皮細胞和附加的預選的外源性細胞群，從而使兩種細胞群擴增，或可在兩種細胞群沒有擴增的情況下植入移植物。如果內皮細胞擴增，則內皮細胞的擴增可包括或不包括血管或血管樣結構的形成。
本發明還提供一種用于修復患病或受損組織的血管化組織移植構造物。血管化移植構造物包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層、及其提取物和水解產物的基質組分，而且還包括加入的內皮細胞，和至少一種附加的預選的外源性細胞群，其中已經在基質組分上培養內皮細胞一段時間，這段時間足夠體外形成血管或血管樣結構。
在另一實施方案中，提供一種增強組織移植構造物體內血管化的方法。該方法包括下列步驟用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，在基質組分上體外培養內皮細胞和附加的細胞群一段時間，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構的形成，并將移植構造物植入到需要修復部位的脊椎中。
本發明的基質組分可用最初較小的細胞群接種，它們可在植入前體外擴增。有利地，用內皮細胞接種可在基質組分上體外培養內皮細胞后，立即誘導移植物的血管化。此外，還可用平滑肌細胞或平滑肌細胞祖細胞或其它細胞類型，如成纖維細胞接種基質組分，從而促進血管化。
在該實施方案中，用內皮細胞接種基質組分，并在將所述構造物植入到患病區域中前，在基質組分上培養內皮細胞一段時間，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構的形成。在用內皮細胞接種基質組分后且體內植入移植物前的任何時間，用至少一種附加的預選的外源性細胞群接種基質組分。因此，根據植入移植物前，在基質組分上培養預選細胞群時間的不同，在將移植構造物植入到受影響區域中前，附加的預選的細胞群可以擴增或沒有擴增。
在選擇性實施方案中，可用附加的預選的外源性細胞群接種基質組分，并在植入移植構造物前，在基質組分上培養預選細胞群，從而使預選細胞群擴增。在該實施方案中，用預選細胞群接種基質組分后，再用內皮細胞接種基質組分。在該實施方案中，在將移植構造物植入到受影響區域中前，在基質組分上培養內皮細胞一段時間，這段時間足夠使內皮細胞擴增形成血管或血管樣結構。
在另一實施方案中，可用內皮細胞和附加的預選的外源性細胞群同時或近乎同時接種基質組分。在該實施方案中，在植入移植物前，在基質組分上培養附加的預選的外源性細胞群和內皮細胞，從而使兩種細胞群擴增。
還提供了一種制備用于修復患病或受損組織的組織移植構造物的方法。該方法包括下列步驟用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，從而形成移植構造物。該方法還可包括在將移植構造物植入到受影響區域中前，在基質組分上培養內皮細胞一段時間的步驟，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構形成。
例如，用于本發明的膀胱和胃粘膜下層的制備方法在美國專利US.Nos.5,554,389(膀胱粘膜下層)和6,099,567(胃粘膜下層)中描述。總之，粘膜下層組織是從脊椎動物的膀胱或胃制備的，優選從豬、羊或牛采集，但不排除其它物種。在這點上，粘膜下層組織通常是異種的(即，來源于不同物種)，但也可以是同種異體的(即，來源于同一物種的不同的成員)或自體的(即，來源于同一動物或個體)。
在制備用于本發明中的膀胱和胃粘膜下層組織的其中一個方法中，使用縱向擦拭動作摩擦組織，從而除去外層，包括平滑肌組織，和最內層，即至少粘膜的腔部分。因此，粘膜下層組織是從肌層和至少粘膜的腔部分剝離的。在另一實施方案中，膀胱或胃組織可按照在WO01/45765中描述的Spievack的方法制備，其引入此處作為參考。按照該方法，將膀胱或胃組織浸泡在脫上皮溶液，如1N生理鹽水中，除去上皮細胞層并留下所有下面鄰接的層，包括上皮基底膜。可選擇性地，可將膀胱或胃組織浸泡在1N生理鹽水中，并經過酶和機械剝離步驟，除去與粘膜下層下面鄰接的其它層，或其一部分。這些過程中的任何一個都可產生包括膀胱或胃粘膜下層以及上皮基底膜的制品。
然后用生理鹽水沖洗粘膜下層并任選滅菌；它可以水化或脫水狀態貯藏。可將凍干或風干的粘膜下層再水化，并用于本發明中而不會損失生物學活性。作為起始材料的天然粘膜下層是相對無細胞的膠原基質，且按照上面所述制備的優選膠原基質是無完整細胞的膠原基質(即，粘膜下層膠原基質組分是無細胞的)。
為形成粘膜下層的多層片，多層粘膜下層可相互重疊。可使用本領域那些技術人員已知的標準技術將各層彼此固定，包括使用縫線和生物相容性粘合劑如膠原粘合糊劑。可選擇性地，可在脫水條件下，通過壓緊重疊區而將各層融合在一起，任選加熱，如美國專利US No.5,711,969所述，其內容引入此處作為參考。
脊椎動物膀胱或胃粘膜下層可使用常規滅菌技術滅菌，包括戊二醛鞣制、酸性pH下的甲醛鞣制、環氧乙烷處理、環氧丙烷處理、等離子氣體滅菌、γ射線照射、電子束和過乙酸滅菌。優選的滅菌技術包括使粘膜下層組織暴露于過乙酸、1-4 Mrads γ射線照射(更優選1-2.5 Mrads γ射線照射)或等離子氣體滅菌；過乙酸滅菌是最優選的滅菌方法。通常，粘膜下層組織經過兩個或更多滅菌過程。將粘膜下層組織滅菌后，例如通過化學處理，可使用電子束或γ射線照射滅菌技術將所述組織再次滅菌。通常，在將移植物滅菌后，將細胞加入到移植組織中。還可使用在美國專利US No.6,206,931中描述的滅菌技術，其引入此處作為參考。按照本發明，在植入移植構造物前，滅菌的膀胱或胃粘膜下層可用于體外培養內皮細胞和預選細胞群。
還已知脊椎動物膀胱或胃粘膜下層可通過粉碎和/或酶消化而被流化，且不會損失它的生物學活性。見美國專利US No.6,264,992 B1，其內容引入此處作為參考。更具體而言，可用酶處理天然或流化的粘膜下層組分一段時間，這段時間足夠溶解粘膜下層成分的全部或大部分。優選，用可水解粘膜下層結構成分的酶消化粘膜下層，從而產生粘膜下層成分的混懸液或均勻溶液。粘膜下層可用蛋白酶(例如，膠原酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶)、糖胺聚糖酶或蛋白酶與糖胺聚糖酶的組合進行酶處理。任選地，可單獨使用其它適宜的酶，或與蛋白酶和糖胺聚糖酶聯合使用。可任選過濾組織消化物，從而提供部分溶解的粘膜下層的均勻溶液。
流化粘膜下層的粘度可通過控制粘膜下層成分的濃度及水化程度而操縱。可將粘度調節至25℃下的約2-約300,000cps。更高粘度的制品，例如，凝膠，可通過透析消化的物質，然后調節這種溶液的pH至約5.0-約9.0而由粘膜下層消化液制備。
膀胱或胃粘膜下層還可以是提取物的形式。例如，粘膜下層組織提取物的制備在PCT申請No.PCT/US97/22721中描述，其在1998年6月18日作為WO98/25964公開，其內容引入此處作為參考。簡單的說，4℃下，將膀胱或胃粘膜下層攪拌混懸在提取緩沖液(見實施例1)中約24小時。4℃下，以12,000xg離心提取混合物約30分鐘并收集上清液。然后用提取緩沖液洗滌不溶性物質，并重復離心步驟，將洗滌液與最初的上清液混合。用去離子水充分透析上清液(MWCO約3500)，以12,000xg離心透析液。上清液可立即使用或冷凍干燥貯藏。膀胱或胃粘膜下層的流化和凝膠形式以及這些粘膜下層組織的提取物可保留生物活性劑，如生長因子，包括轉化生長因子(TGF)β、TGFβ-相關蛋白以及成纖維細胞生長因子。流化形式或凝膠形式的膀胱或胃粘膜下層組織，提取物，或粉末可用于在植入本發明的移植構造物前，體外培養內皮細胞和預選細胞群。
本發明還考慮了粉末形式粘膜下層的使用。在其中一個實施方案中，粉末形式的粘膜下層是通過在液氮下粉碎粘膜下層，從而產生0.1-1mm2大小的顆粒而制備的。然后將顆粒狀組分冷凍干燥過夜并滅菌，形成固體、基本無水的顆粒狀復合物。可選擇性地，可通過將粉碎粘膜下層的混懸液或溶液干燥而從流化的粘膜下層而形成粉末形式的粘膜下層。
實施例1膀胱和胃粘膜下層組分的制備膀胱粘膜下層的制備膀胱粘膜下層是從當地肉食加工廠的豬的膀胱制備的。沖洗切除下來的膀胱至沒有內含物，翻過來并通過機械剝離除去粘膜表層。將組織恢復至其原始方向，并除去外肌肉層。將所制備的膀胱切開，在水中充分沖洗，從而溶解與粘膜下層基質有關的任何細胞，并除去細胞降解產物。
可選擇性地，可按照Spievack在WO01/45765中描述的方法制備保留有粘膜下層和上皮基底膜的膀胱組織，其引入此處作為參考。按照本方法，保留上皮基底膜的膀胱粘膜下層組織可通過將組織浸泡在脫上皮溶液，如1N生理鹽水中而制備。在另一實施方案中，可將膀胱組織浸泡在1N生理鹽水中，并經過酶和機械剝離步驟除去與粘膜下層下面鄰接的其它層，或其一部分。這些過程中的任何一個都可產生包括膀胱或胃粘膜下層以及上皮基底膜的制品。
如下所述，這種制品用于本發明的移植構造物中。在制備流化或凝膠形式的膀胱粘膜下層或膀胱粘膜下層的提取物時，通常沖洗后立即首先將膀胱粘膜下層冷凍在液氮中，并在-80℃貯藏。將冷凍組織切成1cm3，用工業攪拌器在液氮下粉碎成小于2mm2的顆粒，使用前在-80℃下貯藏。流化或凝膠形式的膀胱粘膜下層和膀胱粘膜下層的提取物的制備在下面描述。
胃粘膜下層組織的制備首先通過在胃上它們各自的入口和出口點橫切食管和小腸而取出豬的胃。除去胃近腔面上任何多余的腸系膜組織或脂肪，并排空胃的內含物，通過用流動的自來水沖洗而除去胃內部的任何剩余殘留物。然后將胃外翻，從而使胃的內(腔)表面暴露出來，并切斷食管末端的括約肌和形成胃出口點的括約肌遠端。通常是剩下完整的胃，然而還可在除去無用組織前切下胃并弄平。使用鈍的器械或止血鉗磨擦胃的腔面，從而取出胃內層，包括至少粘膜的腔部分。再次外翻胃組織，從而將胃的腔表面恢復到移植構造物的內部。然后在外部肌纖維層進行切開小的切口。之后從粘膜下層組織機械或酶剝離肌肉層。剩余組織的顏色是略帶粉色的白色。可選擇性地，保留了上皮基底膜的胃粘膜下層組織可按照上面討論的Spievack等人描述的方法制備。
在制備胃組織的過程中，要注意通過定期用水浸泡組織而維持組織的水化。用流動的自來水沖洗胃粘膜下層組織大約2小時，從而除去所有血液或松散的組織碎片。沖洗后，組織應當顯白色，但如果組織的顏色保持粉色，則在水下摩擦組織直達組織顯白色。沖洗完全后，通過用手或機械缽圈攥住組織而除去多余的水份。這種制品用于本發明的移植構造物中。對于制備流化或凝膠形式的胃粘膜下層或胃粘膜下層提取物而言，通常首先在液氮中冷凍組織，并在-80℃下的液氮中貯藏。將冷凍組織切成1cm3，用工業攪拌器在液氮下粉碎至小于2mm2的顆粒，使用前在-80℃貯藏。胃粘膜下層的流化或凝膠形式和胃粘膜下層提取物的制備在下面描述。
流化的膀胱或胃粘膜下層的制備粉碎材料的部分消化是通過將5g粉末狀組織加入到100ml含有溶于0.5M醋酸中的0.1％胃蛋白酶的溶液中，并在4℃下消化72小時而進行的。部分消化后，4℃下12,000rpm離心混懸液20分鐘，棄去不溶性顆粒。4℃下，多次更換0.01M醋酸而透析上清液(MWCO3500)。通過向透析水解產物中加入氯仿(5ml氯仿加入900ml 0.01M醋酸)而將溶液滅菌。額外更換兩次無菌的0.01M醋酸而繼續透析水解產物，從而除去氯仿。然后將透析包的內含物無菌轉移到無菌容器中。4℃下貯藏所得的流化組分。
膀胱和胃粘膜下層凝膠組分的制備為了制備凝膠形式的膀胱或胃粘膜下層，將8ml流化粘膜下層與1.2ml 10xPBS緩沖液(含5mg/L酚紅的10x磷酸鹽緩沖生理鹽水)混合；加入0.04N HCl(約1.6ml)調節pH至6.6-7.4，然后加入0.05NNaOH(約1.2ml)，改變pH至＞8。用水將終體積調節至12ml。
膀胱或胃粘膜下層提取物的制備用于這些研究的提取緩沖液包括4M胍、2M尿素、2M MgCl2和2MNaCl，每個都是在50mM Tris-HCl，pH7.4中制備的。4℃下，將膀胱或胃粘膜下層的粉末混懸在提取緩沖液(25％w/v)中，所述提取緩沖液包含均為1mM的苯甲基磺基氟化物、N-乙基馬來酰亞胺、和芐脒(蛋白酶抑制劑)，用力攪拌24小時。然后在4℃下，12,000xg離心提取混合物30分鐘，并收集上清液。在提取緩沖液中簡單洗滌不溶性物質，離心，并將洗滌液與原始上清液混合。在Spectrapor管(MWCO3500，Spectrum Medical Industries，Los Angeles，CA)中，用30個體積的去離子水充分透析上清液(72小時更換9次)。12,000xg離心透析液除去所有不溶性物質，立即使用上清液或凍干貯藏。
實施例2內皮細胞的生長膀胱或胃粘膜下層是按照上面所述從新安樂死的豬采集并制備的。經由各種技術(γ射線照射、過乙酸等)滅菌后，將組織夾在聚丙烯框架內，產生平坦的表面區域(50mm2)用于細胞生長。將框架浸沒在組織培養基中，使培養基營養物進入膀胱或胃粘膜下層組織的表面。將內皮細胞和平滑肌細胞(3×104個細胞/組織切片)接種在粘膜下層組織上，然后放在37℃的5％CO2、95％空氣的培養箱中。各個時間周期后，將接種的膀胱或胃粘膜下層組織固定在10％中性緩沖福爾馬林中，包埋在石蠟中，并切片(6μm)。進行各種組織學和免疫組織化學染色過程，從而確定細胞生長特性。利用這些過程觀察血管或血管樣結構。
實施例3內皮細胞的生長膀胱粘膜下層是按照上面所述從新安樂死的豬采集并制備的。經由各種技術(γ射線照射、過乙酸等)滅菌后，將組織夾在聚丙烯框架內，產生平坦的表面區域(50mm2)用于細胞生長。將框架浸沒在組織培養基中，使培養基營養物進入膀胱或胃粘膜下層組織的表面。將人微血管內皮細胞接種在膀胱粘膜下層的其中一個表面上，將3T3細胞接種在另一表面上(兩種細胞類型均以1×106個細胞/組織切片接種)，然后將組織切片放在37℃的5％CO2、95％空氣的培養箱中。生長7天后，將接種的膀胱粘膜下層組織固定在10％中性緩沖福爾馬林中，包埋在石蠟中，并切片(6μm)。進行各種組織學和免疫組織化學染色過程，從而確定細胞生長特性。如圖2所示，在沒有任何其它細胞類型存在的條件下，單獨接種在膀胱粘膜下層上的內皮細胞在不侵入基質的情況下在膀胱粘膜下層上生長。如圖3所示，當在相反的表面上接種3T3細胞時，細胞侵入基質并形成血管或血管樣結構。這些結果表明，當內皮細胞在有其它細胞類型存在的條件下，在移植材料上生長時，內皮細胞形成血管或血管樣結構的能力增強了。
權利要求
1.一種用于修復患病或受損組織的組織移植構造物，所述組織移植構造物包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，加入的內皮細胞，以及至少一種附加的預選的外源性細胞群。
2.根據權利要求1所述的移植構造物，其中所述至少一種附加的細胞群包括選自角化上皮細胞、未角化上皮細胞、和中胚層來源細胞的細胞群。
3.根據權利要求1所述的移植構造物，其中所述至少一種附加的細胞群包括平滑肌細胞群。
4.根據權利要求1所述的移植構造物，其中所述至少一種附加的細胞群包括平滑肌細胞祖細胞群。
5.根據權利要求1所述的移植構造物，其中所述膀胱或胃粘膜下層組織是從肌層和至少所述粘膜下層組織的粘膜層的腔部分剝離的。
6.根據權利要求1所述的移植構造物，它還包括肝素酶。
7.根據權利要求1所述的移植構造物，它還包括選自血管內皮細胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉化生長因子β、和血清生長因子的生長因子。
8.根據權利要求1所述的移植構造物，其中用內皮細胞接種基質組分后，再用附加的預選的細胞群接種基質組分。
9.根據權利要求1所述的移植構造物，其中用附加的預選的細胞群接種基質組分后，再用內皮細胞接種基質組分。
10.根據權利要求1所述的移植構造物，其中用內皮細胞和附加的預選的細胞群同時或近乎同時接種基質組分。
11.一種用于提高組織移植構造物的體內血管化的方法，所述方法包括下列步驟用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群外接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，以形成移植構造物；并將所述移植構造物植入到脊椎動物中需要修復的部位。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細胞群包括選自角化上皮細胞、未角化上皮細胞、和中胚層-來源細胞的細胞群。
13.根據權利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細胞群包括平滑肌細胞群。
14.根據權利要求11所述的方法，其中所述至少一種附加的細胞群包含平滑肌細胞祖細胞群。
15.根據權利要求11所述的方法，其中所述膀胱或胃粘膜下層組織是從肌層和至少所述粘膜下層組織的粘膜層的腔部分剝離的。
16.根據權利要求11所述的方法，其中所述移植構造物還包括肝素酶。
17.根據權利要求11所述的方法，其中所述移植構造物還包括選自血管內皮細胞-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子、血小板-衍生的生長因子樣分子、轉化生長因子β、和血清生長因子的生長因子。
18.根據權利要求11所述的方法，進一步包括在所述基質組分上培養所述內皮細胞一段時間的步驟，這段時間足夠在將所述移植構造物植入到脊椎動物中之前形成血管或血管樣結構。
19.根據權利要求11所述的方法，其中用內皮細胞接種基質組分后，再用附加的預選的細胞群接種基質組分。
20.根據權利要求11所述的方法，其中用附加的預選的細胞群接種基質組分后，再用內皮細胞接種基質組分。
21.根據權利要求11所述的方法，其中用內皮細胞和附加的預選的細胞群同時或近乎同時接種基質組分。
22.根據權利要求18所述的方法，其中用內皮細胞接種基質組分后，再用附加的預選的細胞群接種基質組分。
23.根據權利要求18所述的方法，其中用附加的預選的細胞群接種基質組分后，再用內皮細胞接種基質組分。
24.根據權利要求18所述的方法，其中用內皮細胞和附加的預選的細胞群同時接種基質組分。
25.根據權利要求19、20或21任何一項所述的方法，其中在植入移植構造物前，內皮細胞或附加的預選的細胞群均沒有擴增。
26.根據權利要求19、20或21任何一項所述的方法，進一步包括以下步驟在基質組分上培養內皮細胞一段時間，這段時間足夠使內皮細胞在沒有體外形成血管或血管樣結構的情況下擴增，并在基質組分上培養附加的預選的細胞群一段時間，這段時間足夠在將移植構造物植入到脊椎動物中之前，使附加的預選的細胞群擴增。
27.根據權利要求19、20或21任何一項所述的方法，進一步包括在基質組分上培養內皮細胞一段時間的步驟，這段時間足夠使內皮細胞在沒有體外形成血管或血管樣結構的情況下擴增。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述附加的預選的細胞群在植入移植構造物前沒有擴增。
29.根據權利要求19、20或21任何一項所述的方法，進一步包括在基質組分上培養附加的預選的細胞群一段時間的步驟，這段時間足夠在植入移植構造物前，使預選的細胞群擴增。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述內皮細胞在植入移植構造物前沒有擴增。
31.根據權利要求22、23或24任何一項所述的方法，其中所述附加的預選的細胞群在植入移植構造物前擴增。
32.根據權利要求22、23或24任何一項所述的方法，其中所述附加的預選的細胞群在植入移植構造物前沒有擴增。
33.一種制備用于修復患病或受損組織的組織移植構造物的方法，所述方法包括用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群外接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分的步驟。
34.根據權利要求33所述的方法，進一步包括在將所述移植構造物植入到脊椎動物中之前，在所述基質組分上培養所述內皮細胞一段時間的步驟，這段時間足夠體外形成血管或血管樣結構。
35.一種用于增強移植構造物的體內血管化的方法，所述方法包括下列步驟用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源性細胞群外接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分；在所述基質組分上體外培養所述內皮細胞一段時間，這段時間足夠誘導血管或血管樣結構的形成；并將所述移植構造物植入到脊椎動物中需要修復的部位。
36.根據權利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細胞群包括選自角化上皮細胞、未角化上皮細胞、和中胚層-衍生細胞的細胞群。
37.根據權利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細胞群包括平滑肌細胞群。
38.根據權利要求35所述的方法，其中所述至少一種附加的細胞群包括平滑肌細胞祖細胞群。
39.根據權利要求35所述的方法，其中用內皮細胞接種基質組分后，再用附加的預選的細胞群接種基質組分。
40.根據權利要求35所述的方法，其中用附加的預選的細胞群接種基質組分后，再用內皮細胞接種基質組分。
41.根據權利要求35所述的方法，其中用內皮細胞和附加的預選的細胞群同時接種基質組分。
42.一種用于修復患病或受損組織的血管化組織移植構造物，所述組織移植構造物包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，加入的內皮細胞，以及至少一種附加的預選的外源性細胞群，其中所述內皮細胞已經在所述基質組分上培養過一段時間，這段時間足夠體外形成血管或血管樣結構。
43.一種用于修復患病或受損組織的具有血管樣結構的組織移植構造物，所述組織移植構造物包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，加入的內皮細胞，以及至少一種附加的預選的外源性細胞群，其中所述附加的細胞群可增強所述血管樣結構在所述移植構造物中形成的開始。
44.一種制備用于修復患病或受損組織的具有血管樣結構的組織移植構造物的方法，所述方法包括用內皮細胞群和至少一種附加的預選的外源細胞群外接種選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的步驟，其中所述附加的細胞群可增強所述血管樣結構在所述移植構造物中形成的開始。
45.一種治療患者中患病或受損組織的方法，包括使用權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、42或43任何一項所述的組織移植構造物修復患病或受損組織。
全文摘要
提供一種用于修復患病或受損組織的組織移植構造物。所述組織移植構造物包括選自膀胱粘膜下層和胃粘膜下層，及其提取物和水解產物的基質組分，加入的內皮細胞，以及可增強血管－樣結構在移植構造物中形成開始的至少一種附加的預選的外源性細胞群。預選的細胞群可以是未－角化或角化的上皮細胞群或選自成纖維細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、多－潛能祖細胞、周細胞、成骨細胞、和任何其它適宜細胞類型的中胚層來源的細胞群，優選以所修復組織為基礎選擇的細胞群。還提供了用于增強這些組織移植構造物的體內血管化和用于制備這些移植構造物的方法。
文檔編號A61L27/00GK1684589SQ03815472
公開日2005年10月19日 申請日期2003年5月1日 優先權日2002年5月2日
發明者S·F·巴戴拉克 申請人:普渡研究基金會