專利名稱：新型金葡菌素制劑及其制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療金色葡萄球菌感染的新型金葡菌素免疫制劑。
背景技術：
在一般的外科范圍內，急性化膿性感染之病原菌中，以葡萄球菌感染率為第一位，占檢出的總病菌數的88.9％以上，較青霉素、鏈霉素等抗菌素應用前的1945年上升了約50％。這是由于這些年來，青霉素等抗菌素的大量應用，使許多的結核菌、化膿菌得到控制，但是，由于葡萄球菌能比較快的產生抗藥性，使得葡萄球菌有增無減，目前現存的自然的葡萄球菌80-85％是耐藥菌株，而從醫院取得并分離出來葡萄球菌中95％以上對青霉素、鏈霉素、四環素以及先鋒系列是多重耐藥的，使目前的抗炎藥物無法控制病情，目前尚缺乏有效的控制藥品。及時開發出能夠抵抗葡萄球菌感染、并能根據其耐藥性及時進行調整、使金葡球菌不能產生抗耐藥性的免疫制劑，已經成為世界性的重大課題。
根據這些現狀，美國近年批準了一種新的抗菌藥物ZYVOX，它是35年來全世界推出的最有意義的新型抗菌藥，但是，為了避免病原菌特別是葡萄球菌接觸后產生出新的耐藥菌株，美國規定，只有對其他抗菌藥無效的情況下，經過批準才可以使用。近年來，我國從敗血病人的血清中分離并培植了S155金色葡萄球菌，并研制了其無毒的類毒素，但是隨著此類抗原的不斷變異，需要不斷開發新的異變菌種。并且，原有的金葡菌素是注射劑，其中有少量的患者在注射部位有紅腫、熱痛等不良反應，需要誘導、分離并純化新的抗菌疫苗。這種劑型如果遇到大范圍的感染，注射器械不及時，將難以使用。

發明內容
本發明的目的是提供一種新型的金色葡萄球菌抗菌疫苗，及其該疫苗的制作方法。
本發明解決上述技術問題的方案是新型金葡菌素制劑，所述的制劑中包括金黃色葡萄球菌staphlococcusaureus cgmcc No.0671的菌體蛋白及其類毒素的生物制劑，其中所述的菌體蛋白(毫克)與類毒素(溶血單位)比例為(0.5-30)∶(5-30)。
上述的新型金葡菌素制劑，所述的制劑是10-20單位/毫升的注射液、噴霧劑或者外用皮膚擦劑。
上述的新型金葡菌素制劑的制作方法，其過程包括，將cgmcc 0671菌株作為進行種子培養和純化保存于血斜面中培養、將該培養物清洗后破碎制取菌體蛋白、用該培養物在堿性環境下用甲醛解毒制成類毒素，將取得的菌體蛋白和類毒素按比例混合，制成相應的制劑。
本發明與已有的技術相比的有益效果是1.經臨床檢驗，本產品對現有的葡萄球菌的感染的療效占90％以上，由于本產品是免疫制劑，不會產生耐藥性的問題，是國際領先的抗菌消炎新藥，在外科感染中，金色葡萄球菌的感染引起的死亡占外科死亡的42％，本產品可以大幅度的降低外科手術的皮膚創面的葡萄球菌感染，降低外科感染率90％以上。本產品的發明將會象當年青霉素、鏈霉素的發明一樣，為人類抵御外科感染提供強而有力的幫助。
2.傳統的金葡菌素只能注射給藥，一但發生大范圍的外傷，如地震、戰爭等，根本無法實現及時控制疫情，所以國際上都在花大力氣研究無創傷給藥的疫苗。本產品帥先實現了粘膜或者皮膚給藥的方式，無毒副作用，方便有效，可以應付突發性群體外傷的治療局面。避免注射等有傷給藥帶來的交叉感染機會。
3.本方法的提純工藝，大幅度提高產品的純度，基本消除了已有的產品用藥后產生的紅腫、發熱等問題。
4.本產品可以明顯刺激肌體產生金黃色葡萄球菌的抗毒物質，充分利用金黃色葡萄球菌頑強而迅速的抵御外來侵害的能力，并以此抵抗現有的葡萄球菌的毒性，及時有效的刺激肌體產生抗殺白血球素，能有效的中和葡萄球菌感染產生的毒素，保護白血球，增加白血球的數量，增強吞噬功能。
5.療效廣泛，根據不同的病種可不同的病情，可以配制不同配比的疫苗，可治療主要由金黃色葡萄球菌感染的疾病如外傷感染，外科手術感染，金葡球菌敗血病、青草痤瘡、臃、癤、骨髓炎、乳腺炎、中耳炎等各種化膿性感染。
6.類毒素的精制工藝使本產品的性能有了顯著的提高，由于毒素中包括金黃色葡萄球菌菌體蛋白，在一定的培養條件下，可以產生大量的外毒素及其腸毒素，殺血球毒素，經過本提純無毒化處理工藝后，獲得精制的沒有毒性的類毒素。經臨床試驗證明，該類毒素與菌體蛋白混合后治療有多重抗藥性的金色葡萄球菌的感染，已經取得了明顯的療效，使肌體的免疫功能顯著加強。
7.藥效高，用量少。采用免疫遞增打法使用本產品0.2ml(含金葡菌素1-4單位，菌體蛋白50-150mg)以后每日遞增0.1ml，達到0.5ml為一個療程。經臨床檢驗，無不良反應。
8.經檢驗，可以認定，本產品的抗原蛋白包括蛋白A(ProteinA)，壁酸(Teichaic acid)、粘多肽、Jonsen抗原A、vewey部分B、細胞壁、表面抗原以及菌體蛋白，在這5種抗原成份中，我們已經準確的確認其中的三種蛋白包括壁酸、Jensen抗原和Vewey部分B的混合物是在肌體內的對人體淋巴細胞產生刺激作用的有效物質，通過本方法得到的本產品中的這些物質的配合比例促使了肌體抗原的形成。
9.經檢驗，本產品使免疫動物的外圍周血中性白細胞不僅數量增加，而且褪噬活性明顯增高，并且，單獨的傳統形成的金黃色葡萄球菌素只產生抗毒素，而使用了本產品的免疫動物同時產生抗兩種抗體，增加了抗體的種類和滴度，對于本產品的兩種有效成份的及本品分別進行檢驗的效果見下表下面舉例進行說明實施例1新型金葡菌素制劑，所述的制劑中包括金黃色葡萄球菌staphlococcusaureus cgmcc No.0671的菌體蛋白及其類毒素的生物制劑，根據病種及感染的嚴重程度選配，其中菌體蛋白(毫克)與類毒素(溶血單位)比例為(0.5、1、2、4、7、10、15、20、25、30)∶(5、7、10、15、20、25、30)。
其菌體特性為球菌，直徑為0.8-1.0μm，細胞單個，成對和多于一個平面分裂成不規則的堆團，菌落光滑、奶油狀，并且有完整的邊緣。
菌學特性甘露醇好氧產酸+ 麥芽糖+厭氧產酸+ D-甘露醇 +γ酵素 +凝固醇(兔血漿) +
胞內核酸酶抗熱+ 溶血+生長需要生物素- 溶菌酶 -細胞壁核糖醇+甘 油-A蛋白 +對新生素敏感 s其中+為大多數(90％以上)菌株陽性-為大多數(90％以上)菌株陰性s為最低抑制濃度小于0.6μg/ml上述的新型金葡菌素制劑，所述的制劑是10-20單位/毫升的注射液、噴霧劑或者外用皮膚擦劑。
實施例2上述的新型金葡菌素制劑的制作方法，其中與傳統的金葡菌素制造過程中不同的部分包括將cgmcc 0671菌株作為進行種子培養和純化保存于血斜面中培養、將該培養物清洗后破碎在pH4.5時制取菌體蛋白并提純、用該培養物在堿性環境下用甲醛解毒制成類毒素并提純，將取得的菌體蛋白和類毒素按上述的比例混合，制成相應的制劑。
實施例3實施例2中所述的新型金葡菌素制劑的制作方法中，所述的種子培養純化過程包括1.一種可以采用的生產菌體蛋白的培養基蛋白胨1.0％ 氯化鈉0.5％ 牛肉汁100毫升 瓊脂20％2.制作方法取蛋白胨100克，NaCl 50克，加入牛肉汁中，加熱溶化，加牛肉汁至10000ml，煮沸10分鐘，用NaOH調至pH7.6，過濾后分裝成7份，在15磅滅菌30分鐘備用。
菌株活力恢復將cpmcc 0671菌用無菌肉湯從培養基中洗出，在37℃下培養24小時。
取培養物于血平板上劃線分離，在37度培養24小時，取溶血環大的菌落，接種到普通肉湯中37℃，培養10-30小時。
將培養物0.5ml注入小白鼠腹腔，瀕死時取其心血，作血平板劃線分離，在37℃培養20小時，取溶血環較大的血平面，在37℃培養20小時。
3.上述的操作條件是可以放寬的，具體敘述如下將由敗血癥患者血樣中分離的cgmcc 0671菌株用無菌肉湯培養基將其洗入肉湯管中，在36-38℃培養12-24-36小時，用其在血平板上劃線分離，在36-38℃培養12-24-36小時，取溶血環較大的單個菌落，接種到肉湯中，在36-38℃培養下10-20-30小時，取肉湯培養物注入到小白鼠體中，至其瀕死時取其心血，作血平板劃線分離，在36-38℃培養10-20-30小時，取溶血環較大的菌落移入血斜面，在36-38℃培養10-20-30小時。
實施例4實施例2或3中所述的新型金葡菌素制劑的制作方法中，制取菌體蛋白的過程可以是這樣的取血斜面培養物-接種環，種于固體的培養液之中，在36或37或38℃培養10-30小時，一般為20小時，洗滌2-5次，取掉異蛋白和外毒素，裝入均漿杯，加鹽水至滿杯，取鮮菌體及玻璃珠加入，放入冰箱預冷到3-7℃比如5℃后。
放入均漿機中以每分鐘2000次低速振動，通入CO2氣體之后，開到二檔，以每分鐘4000次振動12分鐘，每2分鐘停一下，涂片，革氏染色為陰性，檢測到破碎率到95％以上停止。
用無菌水從均漿杯中將破碎的菌體洗出，在4℃，以每分鐘4000轉離心40分鐘，離心去沉淀，留上清液。
在10℃以下，邊攪拌邊滴鹽酸等酸類調整pH4.5，需要反復幾次，穩定。
在每分鐘10000/r冷凍離心20-50分鐘，例如40分鐘，棄上清，沉淀即為菌體蛋白。
菌體蛋白的精制此時將得到的菌體蛋白經重復沉淀后，得到的免疫性是最強的，具體方法是用強堿調制pH8.5左右，以溶解沉淀，透析60-70-80-90小時，例如72小時，每日換水3-6次，用電風扇等進行蒸發濃縮、將透析袋中菌體用無菌蒸餾水洗出，放入蒸發皿中速凍，然后減壓干燥，可以加1％的硫柳貢使成1/5000在4℃冰箱中保存備用。
實施例5
上述的新型金葡菌素制劑的制作方法中所述的類毒素的制取過程可以是這樣的1.培養基牛肉浸液取牛肉1000克加水2000ml，在2-8℃浸泡20-24小時，在攪拌下煮費45分鐘，加酸到pH4.5，過濾后，補液至2000ml，在120℃滅菌30分鐘，在4℃避光保存。
牛肉消化液取牛肉渣500克，加水至2500ml，置于帶塞玻璃瓶中，加入碳酸鈉1.5克，胰酶10克，氯仿30ml，塞好，置于37℃中消化，開始時2-3小時搖動一次，并用40％NaOH調pH至8.0，消化36小時，用HCI調至pH4.5，加熱到80-90℃，過濾，濾液加氯仿至2％，在4℃避光保存。
培養基配方牛肉浸液70ml，牛肉消化液30ml，MgSO4.7H2O 0.03g，KCI 0.02g，K2HPO4.3H2O 0.03g，葡萄糖0.2g，酵母透析液 10ml，10％胱氨酸0.2ml KCI 0.02g。
全部溶解后，調pH為7.6，煮沸過濾，加活性炭0.2g，混均后裝培養瓶。每瓶60ml，在115℃滅菌30分鐘。
用實施例3培養的菌種制毒素將血平面培養物一白金耳，接種于上述的培養基中，在36-38℃的搖床中在170-200rpm狀態下，向室內通入20％CO2，培養10-20-30小時，選未染雜菌溶血效價1024以上的，將培養液在3-10℃(例如4℃)，3000rpm情況下離心30分鐘，取上清液類毒素置備將上款得到的上清濾液以NaOH等強堿調至pH8.0，加甲醛至濃度達0.4％，在36-38℃解毒3-7天，至不溶血即完全解毒，得到類毒素。
類毒素的精制取上款類毒素，可以加三氯乙酸至pH4.0，棄上清，于在3-8℃例如4℃，在3000rpm狀態下離心20-30分鐘，將沉淀用蒸餾水洗滌，再離心，將沉淀溶于原類毒素體積1/15-1/25的pH8.0的磷酸緩沖液中，在3-8℃例如4℃，3000rpm情況下離心20-30-40分鐘，取上清液加硫鋁汞使濃度在0.001-0.03％，在冰箱中低溫保存。
權利要求
1.一種新型金葡菌素制劑，其特征是所述的制劑中包括金黃色葡萄球菌staphlococcus aureus cgmcc No.0671的菌體蛋白及其類毒素的生物制劑，其中菌體蛋白(毫克)與類毒素(溶血單位)比例為(0.5-30)∶(5-30)。
2.根據權利要求1所述的新型金葡菌素制劑，其特征是所述的制劑是10-20單位/毫升的注射液、噴霧劑或者外用皮膚擦劑。
3.一種權利要求1或2所述的新型金葡菌素制劑的制作方法，其特征是將saureus 0671菌株作為進行種子培養和純化保存于血斜面中培養、將該培養物清洗后破碎制取菌體蛋白、用菌體液在堿性環境下用甲醛解毒制成類毒素，將取得的菌體蛋白和類毒素按比例混合，制成相應的制劑。
4.根據權利要求3所述的新型金葡菌素制劑的制作方法，其特征是所述的種子培養純化過程包括將由敗血癥患者血樣中分離的saureus 155菌株用無菌肉湯培養基將其洗入肉湯管中，在36-38℃培養12-24-36小時，用其在血平板上劃線分離，在36-38℃培養12-24-36小時，取溶血環較大的單個菌落，接種到肉湯中，在36-38℃溫度下培養10-20-30小時，取肉湯培養物注入到小白鼠體中，至其頻死時取其心血，作血平板劃線分離，在36-38℃培養10-20-30小時，取溶血環較大的菌落移入血斜面，在36-38℃培養10-20-30小時。
5.根據權利要求3或4所述的新型金葡菌素制劑的制作方法，其特征是所述的制取菌體蛋白的過程包括取血斜面培養物-接種環，種于含100ml肉湯容器中，在在36-38℃培養10-20-30小時，低溫洗滌2-5次，離心去掉異蛋白和外毒素，取鮮菌體及玻璃珠取共同裝入均漿杯，預冷至3-7℃，放入均漿機進行均漿破碎，當破碎率到95％以上，用無菌水從均漿杯中將破碎的菌體洗出，離心去沉淀，用鹽酸等酸類調整pH4.5穩定，離心20-30-50分鐘，沉淀即為菌體蛋白，為增強免疫性能，可以用強堿調制pH8.5左右，以溶解沉淀，透析60-70-80-90小時，每日換水3-6次，濃縮、凍干。
6.根據權利要求5所述的新型金葡菌素制劑的制作方法，其特征是所述的類毒素的制取過程包括將血平面培養物接中于液體培養基中，在36-38℃的搖床中培養10-20-30小時，將培養液在3-10℃離心20-40分鐘，取濾液以強堿調至pH8.0，加甲醛至濃度達0.1-0.6％，在36-38℃解毒3-7天，至不溶血即得到類毒素，加三氯乙酸至pH3-5，在3-8℃離心20-30分鐘，將沉淀洗滌，再離心，將沉淀溶于原類毒素體積1/10-1/25的pH6.5-8.5的磷酸緩沖液中，在3-8℃離心20-30-40分鐘，取上清液加硫柳汞使濃度在0.001-0.03％，以保存備用。
7.根據權利要求3或4所述的新型金葡菌素制劑的制作方法，其特征是所述的類毒素的制取過程包括將血平面培養物接中于培養基中，在36-38℃的搖床中培養10-20-30小時，將培養液在3-10℃離心30分鐘，取濾液以強堿調至pH8.0，加甲醛至濃度達0.4％，在36-38℃解毒3-7天，至不溶血即得到類毒素，此后，可以加三氯乙酸至pH3-5，在3-8℃離心20-30分鐘，將沉淀洗滌，再離心，將沉淀溶于原類毒素體積1/20的pH8.0的磷酸緩沖液中，在3-8℃離心20-30-40分鐘，取上清液加硫柳汞使濃度在0.001-0.03％，以保存備用。
全文摘要
新型金葡菌素制劑及其制作方法，一種治療金色葡萄球菌感染的新型金葡菌素免疫制劑。外科急性化膿性感染之病原菌中，以葡萄球菌感染率為第一位，占檢出的總病菌數的88.9％以上，由于葡萄球菌能比較快的產生抗藥性，使得葡萄球菌有增無減，目前現存的自然的葡萄球菌80－85％是耐藥菌株。沒有有效的藥品可以控制病情。本制劑中包括金黃色葡萄球菌staphlococcus aureus cgmccNo.0671的菌體蛋白及其類毒素的生物制劑，其中菌體蛋白(毫克)與類毒素(溶血單位)比例為(0.5－30)∶(5－30)，該制劑可以是注射液也可以是噴霧劑或者外用皮膚擦劑。用于治療外傷感染，外科手術感染，金葡球菌敗血病、青春痤瘡、臃、癤、骨髓炎、乳腺炎、中耳炎等各種化膿性感染。
文檔編號A61P31/04GK1451437SQ0210951
公開日2003年10月29日 申請日期2002年4月18日 優先權日2002年4月18日
發明者孫建華, 沙長青, 曲月英, 夏海華, 曲曉軍, 李新玉 申請人:黑龍江省科學院應用微生物研究所