專利名稱：圣塔景天的制作方法
圣塔景天是景天科，圣塔屬，種名為綠葉大花圣塔(簡稱圣塔景天)，(Cotyledonmacrantha De Smet var，vivescens(Sohoent.et.Bak.f.)V.Poelln縮寫為CMSVP)，高60～80cm，莖直徑4～5cm，形似小樹，葉片肥厚，葉寬14cm，長18cm，鮮葉均重52.5g，樹冠直徑為34cm。
常綠多年生肉質半灌木，高約1米，莖肥厚呈園柱略彎曲狀，具向光性，莖部稍木質化，多二歧對稱分枝成一整齊美觀挺拔樹形，枝節從根部周圍分枝，主干無分權，根呈須發狀，隨樹長高，莖部大葉慢慢變黃呈黑干狀，向下卷曲枯萎脫落，脫落后的主莖上留有口唇狀疤痕，葉對生，無柄，貼莖，尖端初生嫩葉肥厚呈凹狀，下部葉大而肥厚呈凸狀，倒卵匙形，葉長18～20cm，寬14～16cm，尖端園闊，靠莖部漸漸變窄呈匙狀，最大葉重約60g，整株葉為12片。
原產南非，世界各地均栽培，為觀賞植物，以其樹姿挺拔、壯麗著稱。生長較快，扦插與組織培養繁殖極易成活，我國多喜栽為盆景。
本發明的圣塔景天的提取液或原粉對抗腫瘤和增強免疫效應，降血糖等作用分別敘述如下1、CMSVP提取液或原粉制造實施例1.1、實施例1取洗凈的圣塔景天葉子1kg，粉碎后，用石油醚(30-60)回流脫脂2h，殘渣置于1升無離子水，煮沸0.5h，過濾，殘渣繼續重復上述操作3次，合并4次濾液，濃縮至小體積，加氯仿(A、R)至分層，沉淀棄蛋白，上層溶液濃縮至小體積，濃縮，烘烤，得圣塔景天(CMSVP)原粉，產量22.86g，收率2.29％。(見附

圖1-1)。1.2、實施例2取鮮CMSVP葉子或莖500g溶于2升無離子水，加熱煮沸5分鐘，過濾，濾液濃縮至小體積，將上述操作重復3次，合并4次濾液，濃縮至含10g/ml鮮圣塔景天(CMSVP)原粉供抗腫瘤與增強免疫實驗使用。2、圣塔景天(CMSVP)的抗腫瘤作用和對免疫功能增強效應2.1、實驗材料與方法2.1.1藥品與主要試劑
CMSVP提取液和原粉均由北京泰達士生物化學研究所提供。刀豆蛋白A購自美國Sigma公司，3H-TdR購自中國原子能科學研究院，強度1mCi(3.7×106kbp)。細菌脂多糖由北京生物制品研究所提供。其它試劑均為國產分析純。2.1.2實驗動物和瘤株昆明小鼠，8周齡，體重19-21g，雌雄各半；C57BL/6小鼠，8周齡，體重19-21g，雌雄各半；均由北京大學動物學部提供。小鼠黑色素瘤B16、小鼠Lewis肺癌接種于C57BL/6小鼠；小鼠肉瘤S180和艾氏腹水癌接種于昆明小鼠，以上細胞株均由中國預防醫學科學院提供。2.2、實驗方法2.2.1體內抑瘤實驗剝離小鼠腋下傳代的黑色素瘤B16和Lewis肺癌的瘤快，取生長良好的腫瘤組織研磨成腫瘤勻漿，以0.2ml/只接種于C57BL/6小鼠腋下。無菌取腹腔內傳代7d肉瘤S180和艾氏腹水癌細胞，生理鹽水洗滌3次，以1×106細胞接種于昆明小鼠腋下。接種后次日起灌胃給予CMSVP提取液，每日1次連續10d(劑量見表2-1)。以氮烯咪胺(DTIC)作為小鼠黑色素瘤B16的陽性對照組，其余均用環磷酰胺(CTX)作為陽性對照藥，于第1、3、5、9天腹腔注射給藥。第11天脫頸處死小鼠，稱瘤重，計算腫瘤生長抑制率(Inhibition Rate，IR)。2.2.2脾細胞對絲裂原ConA反應的影響制備脾細胞懸液，調節細胞濃度5×106個/ml)。向96孔板中加入脾細胞懸液0.2μl/孔，ConA 100μl/孔(終濃度為5μl/ml)，同時設自身對照(不含ConA)。培養72h，終止培養前6h加入3H-TdR 20μl/孔(含0.4μCi)。收集細胞于濾膜上，烤干，在液閃儀上測定3H-TdR摻入量。結果刺激指數(Stimulation Index，SI)表示。2.2.3 NK細胞活性測定取生長良好的L929細胞(作為靶細胞)加到96孔培養板，培養2h，使細胞貼壁成單層細胞。再加入上述脾細胞懸液0.1ml/孔，對照組只加入靶細胞，繼續培養20h后用生理鹽水洗滌3次，每孔加入0.2ml 0.5％中性紅染液，培養30min，棄染液洗滌3次，每孔加細胞溶解液20μl，輕輕搖均，用酶標儀在492nm波長處測定吸光度。結果以NK細胞殺傷率表示。2.2.4脾細胞分泌的TNF活性測定
24孔培養板中加入脾細胞懸液1ml(終濃度2.5×106ml-1)，ConA 1ml(終濃度5mg/ml)，培養48h，收上清做為待測TNF樣品。在96孔培養板中加入TNF樣品100μl和L929細胞100μl(終濃度2.5×106ml-1)，同時設靶細胞對照。以下步驟同NK細胞活性測定。結果以細胞殺傷率表示。2.2.5腹腔巨噬細胞分泌的TNF活性測定制備小鼠腹腔巨噬細胞懸液，并以1ml/孔(濃度為1×106ml-1)，加入24孔培養板中，培養4h，洗耳恭聽去懸浮細胞，加入10μl LPS繼續培養20h，取上清作為TNF待測樣品，活性測定方法同脾細胞分泌的TNF活性檢測。2.2.6腹腔巨噬細胞細胞毒活性的檢測用3H-TdR標記L929細胞(靶細胞)。將制備好的腹腔巨噬細胞懸液加入96孔培養板中，100μl/孔(濃度為1×106個/ml-1)，培養4h，洗去懸浮細胞，加入10μl/ml LPS繼續培養8h，加入3H-TdR標記的L929細胞100μl(效靶比為5∶1)，同時設靶細胞對照孔，培養20h，吸取上清100μl，檢測放射活性，計算細胞殺傷率(cytotoxiciry)。以上培養均為5％CO2、37℃培養，每個樣品均設3復孔。2.3、實驗結果2.3.1 CMSVP的體內抑瘤作用對小鼠黑色素瘤B16、Lewis肺瘤S180和艾氏腹水癌(EAC)均有抑制作用，且有一定的劑量依賴關系。高劑量CMSVP對各種腫瘤的抑瘤率均大于30％，對黑色素瘤B16的抑制作用為最強，抑瘤率達到50％以上，高于陽性藥組(見表2-1)。
表2-1 體內抑制腫瘤生長作用
與陽性對照組比較1)P＜0.052)P＜0.013)P＜0.0014)指CMSVP鮮重提取液配制2.3.2 CMSVP對小鼠免疫功能的影響CMSVP治療10d后，conA誘導的脾細胞增殖反應對NK細胞活性無顯著影響；小鼠脾細胞分泌的TNF量明顯升高；腹腔巨噬細胞的細胞毒活性明顯增強，分泌的TNF活性也增加(見表2-2)。
表2-2 CMSVP對荷瘤小鼠免疫功能的影響(n＝8)
2.4、實驗討論本發明實驗結果表明圣塔景天(CMSVP)提取液或原粉具有良好的抗腫瘤作用，0.80g/kg和1.20g/kg的CMSVP對上述各瘤株的抑瘤率均達到30％以上，其中的黑色素瘤B16的抑瘤作用最強，1.2g/kgCMSVP的抑瘤達到50％以上，高于陽性對照組DTIC。CMSVP對荷瘤小鼠的NK細胞和ConA誘導的脾細胞增殖反應均無明顯作用(P＞0.05)，說明CMSVP對機體的細胞免疫無明顯作用。腫瘤壞死因子(TNF)是一種多功能細胞因子，可以通過直接殺傷腫瘤細胞、誘導細胞凋亡和介導免疫應答等途徑起到抗腫瘤作用。CMSVP可明顯促進脾細胞和腹腔巨噬細胞分泌TNF，并增加巨噬細胞的細胞毒活性，說明CMSVP可提高機體的非特異性免疫功能，通過TNF等細胞因子發揮抗腫瘤作用。TNF在體外或體內局部用藥時抑瘤作用較強，用藥物誘導機體巨噬細胞，特別是腫瘤細胞處于一定程度激活狀態的巨噬細胞及其它免疫細胞產生內源性TNF是腫瘤藥物治療中值得重視的途徑。CMSVP在這方面顯示了良好的開發前景。
CMSVP可以誘導人黑色素瘤細胞發生凋亡，其抗腫瘤作用有一定的特異性。說明除本實驗證實地增強機體非特異性免疫功能外，CMSVP還有其它的抗腫瘤機制，對此我們將做進一步的深入研究。3、CMSVP原粉對糖尿病(DM)小鼠高血糖的防治作用3.1、實驗材料3.1.1動物體重18～24g雄性昆明種小鼠，由北京大學動物學部提供，提取得CMSVP原粉。實驗時用生理鹽水配成所需濃度。3.1.2實驗方法3.1.2.1 實驗性四氧嘧啶糖尿病動物模型的制備四氧嘧啶溶于生理鹽水，由小鼠尾靜脈注入，劑量為100mg/kg。3.1.2.2 血糖測定各實驗鼠禁食6～8h后自尾部采血0.04ml，用鄰甲苯胺法測血漿葡萄糖濃度。3.2、實驗結果3.2.1 預防性給予CMSVP原粉對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響小鼠在注射四氧嘧啶前4h，口服CMSVP原粉對照組給等量生理鹽水。注射四氧嘧啶后72h測定血糖，結果見表3-1，預先4h給予300和800mg/kg組小鼠血糖升高幅度明顯降低，與對照組比較，有顯著性差異。預先1h給予300mg/kg藥物，對小鼠血糖升高幅度降低不明顯。表3-1 CMSVP原粉對四氧嘧啶引起高血糖作用的影響
1)P＜0.052)P＜0.013.2.2 CMSVP原粉對正常小鼠血糖的影響測定正常小鼠空腹血糖，而后灌胃藥物。分別于給藥后不同時間測定血糖，結果見表3-2，300mg/kg劑量對正常小鼠血糖有降低作用。3.2.3 CMSVP原粉對糖尿病(DM)小鼠血糖的影響小鼠注入四氧嘧啶后72h，測定空腹血糖，然后口服藥物。分別于給藥后1，4，7和24h測定血糖，結果見表3-2，實驗表明，劑量100和300mg/kg能明顯降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖水平。口服CMSVP原粉后4～7h，降血糖作用最明顯，血糖降低率最強可達50％，24h仍有作用。說明該藥降血糖作用持續時間較長。表3-2 CMSVP原粉對正常小鼠和四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的作用
1)P＜0.052)P＜0.013.2.4 CMSVP原粉對四氧嘧啶糖尿病小鼠飲水量的影響小鼠隨機分為對照組與給藥組。注射四氧嘧啶后48h，給藥組口服CMSVP原粉100mg/kg，每日2次，連續3d。對照組給等量生理鹽水。記錄給藥后小鼠不同時間的飲水量，并比較兩組間差別。結果見表3-3。由此表明，該CMSVP原粉顯著減少小鼠24～48，48～72h的飲水量，與對照組比較差異有顯著性。表3-3 CMSVP對四氧嘧啶糖尿病小鼠飲水量的影響
1)P＜0.052)P＜0.013.2.5 CMSVP原粉對糖尿病小鼠30天喂養血糖的影響糖尿病模型制作同上，陽性對照組小鼠11只，給藥組小鼠11只，按100mg/kg灌胃給藥(CMSVP)，陽性對照組灌等量的生理鹽水。表3-4 CMSVP原粉對DM小鼠30天喂養血糖的影響(n＝11) 從表3-4可見陽性對照組給藥僅給等量生理鹽水，給生理鹽水后血糖僅為自然下降，一部分還繼續上升，而給藥CMSVP原粉30天后血糖基本恢復至正常值。3.3、附圖簡要說明圖1-1是從鮮CMSVP葉提取CMSVP的生產工藝圖1-2是從鮮CMSVP葉提取成濃度為10g/ml鮮CMSVP的生產工藝3.4、實驗討論四氧嘧啶能選擇性地破壞胰島β細胞，實驗表明CMSVP原粉對四氧嘧啶引起的糖尿病有明顯預防作用，這一作用可能是CMSVP原粉減弱四氧嘧啶對胰島β細胞損傷所致。CMSVP原粉對正常及四氧嘧啶誘發小鼠高血糖都有非常明顯降低作用，用CMSVP對糖尿病小鼠進行30天喂養結果，表明CMSVP原粉可部分或基本修復β-細胞分泌胰島素的功能。本發明的CMSVP原粉可試用于糖尿病患者的治療，對糖尿病病人多飲多食癥狀也會明顯改善。CMSVP原粉能減少糖尿病小鼠飲水量，這一作用對于緩解病人的癥狀也是相當有益的。
權利要求
1.本發明的圣塔景天提取物或原粉具有極好的抗腫瘤、增強免疫、降血糖的效果。
2.按權利要求1所述，提取圣塔景天的溫度為煮沸(即100℃)。
3.按權利要求1所述，抗腫瘤、增強免疫臨床推薦量為100～400mg/天，預防腫瘤、糖尿病臨床推薦量為40～100mg/日/人。
4.按權利要求2所述，圣塔景天用于提取的可以是葉子、莖乃至全株。
全文摘要
本發明發現的圣塔景天提取物或原粉具有極好的抗腫瘤和免疫增強效應以及降血糖效果。本發明涉及保健食品、醫藥品及新功能型食品,圣塔景天原粉可作保健食品廠、藥廠開發增強免疫、預防腫瘤和糖尿病的發生的最適合的產品之一。
文檔編號A61P35/00GK1359688SQ00128218
公開日2002年7月24日 申請日期2000年12月18日 優先權日2000年12月18日
發明者丁慶 申請人:丁慶