專利名稱：基質金屬蛋白酶組織抑制劑預防和治療血管損傷后再狹窄的制作方法
技術領域：
本發明涉及基質金屬蛋白酶組織抑制劑預防和治療血管損傷后再狹窄，更具體說是用基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-2或TIMP-4)預防和治療血管損傷后再狹窄。
關于細胞外基質穩定性對維持血管壁完整的重要性人們早有認識，目前的研究著重于細胞外基質在血管成形術后再狹窄中的作用，(Bendeck，et al.Circ Res 1994；75539-545；Schwartz，et al.Ann N Y Acad Sci 1985；454292-304；Bendeck，et al.Circ Res 1996；7838-43；Strauss，et al.Circ Res1994；75650-658；Zempo，et al.J Vasc Surg 1994；20209-217Southgate，etal.Circ Res 1996；791177-1187；Webb，et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol1997；171837-1844)。血管損傷后再狹窄的過程是正常愈合的結果，但不是我們所希望的，會引起血管腔減小，25％的患者癥狀復發。
動脈損傷后血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells/VSMCs)遷移并增殖形成新的內膜，后者在再狹窄過程的晚期積聚細胞外基質。(Clowes，et al.Lab Invest 1983；49208-215)我們知道，血管平滑肌細胞分泌蛋白酶，通過凝血酶原依賴或非依賴途徑消化細胞外基質，由此有利于遷移。(Sperti，et al.Circ Res1992；71385-392)。
許多研究表明血管損傷后(Bendeck，et al.Circ Res 1994；75539-545；Zempo，et al. J Vasc Surg 1994；20209-217；Southgate，et al.Circ Res1996；791177-1187；Webb，et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997；171837-1844)以及動脈粥樣硬化癥中(Henney，et al.Proc Natl Acad Sci USA1991；888154-8158；Vine and Powell Clin Sci Colch 1991；81233-239；Galis，etal.Ann N Y Acad Sci 1995；748501-507)有基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases/MMPs)的表達，但很少研究其內源抑制劑-基質金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases/TIMPs)。(Webb，et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997；171837-1844；Hasenstab，et al.Circ Res 1997；80490-496)。對TIMP了解最深的功能是對MMP活性的抑制作用。用藥理學或基因轉導的方式抑制MMP活性，從而改變脈管系統中蛋白水解平衡，顯示能抑制遷移和新內膜的形成。(Strauss，et al.Circ Res1996；79541-550；Forough，et al.Circ Res 1996；79812-820)。
本發明目的是采用基質金屬蛋白酶組織抑制劑抑制細胞遷移來預防和治療血管損傷后再狹窄，通過給予受治療者一定量的TIMP-2或TIMP-4有效治療或預防血管損傷后再狹窄。
本發明另一目的是提供一種對受治療者系統給予TIMP的方法。
血管損傷后，在再狹窄的早期階段，VSMCs首先釋放蛋白酶降解細胞外基質并向受損的內皮細胞層遷移。遷移至受損血管區域后，VSMCs增殖、分泌基質蛋白如膠原，并在再狹窄后期形成新的損害。因此，TIMP抑制平滑肌細胞遷移的作用，在阻止再狹窄第一步中十分有用。
本發明描述了一種抑制平滑肌細胞如血管平滑肌細胞遷移的方法，通過細胞內導入能有效抑制細胞遷移的適量的TIMP-2或TIMP-4(J.Greene etal.，J.Biol.Chem.，27130375-30380，1996)。
本發明還提供了治療或預防受治療者血管再狹窄的方法，以及治療或預防受治療者血管損傷的方法。所述血管損傷是由血管成形術、動脈瘤、動脈粥樣硬化、動脈閉塞、損傷、移植、肺栓塞或心肌梗塞所引起。通過給予受治療者一定量的能有效治療或預防再狹窄的TIMP如TIMP-2或TIMP-4。發明者證實在球囊損傷后立即給予TIMP-4能抑制平滑肌細胞的遷移和再狹窄。
本發明還提供了一種對受治療者系統給予TIMP的方法。發明者驚奇地發現通過肌內注射裸DNA然后電穿孔的方法給予TIMP-2或TIMP-4可以達到有效和持續的TIMP蛋白的血清水平。
本發明提供了一種用TIMP治療和預防血管損傷后再狹窄的新方法。發現TIMP如TIMP-2或TIMP-4可以通過肌內注射脂質體配方的裸DNA的方法有效地給予。通過基因治療方法肌內介導TIMP-4的一個實例如下，結果參見圖1。
通過肌內給予TIMP-4表達質粒進行基因治療。基于公開的DNA質粒肌內介導數據(Aiharaand Miyazaki，1998；Blezinger et al，1999)，我們選擇了兩個TIMP-4表達質粒劑量(50和150μg)用以肌內注射然后電穿孔。注射前，以及注射后4、8、13和21天收集血清。用Western blot方法確定TIMP蛋白水平。在50μg質粒劑量，TIMP-4血清水平在注射后4天比對照略高。但是，在150μg質粒劑量，TIMP-4血清水平明顯增高。如圖1所示，雖然在注射前血漿中有最小量的TIMP蛋白，當給予150μg質粒時，注射后4天TIMP的量增加3倍。第8和13天TIMP蛋白量明顯增加，分別是對照的19和29倍。第21天，血漿TIMP回復正常水平。因此，裸DNA在因血管成形術所致血管損傷前3-7天注射為宜。
本發明還提供了一種抑制平滑肌細胞遷移的方法，包括對平滑肌細胞介導一個有效量TIMP以抑制遷移。具體實例之一為介導TIMP-2或TIMP-4的平滑肌細胞為血管平滑肌細胞。血管平滑肌細胞可以在靜脈、動脈或毛細血管中發現。在本發明的最佳實施例中，為大動脈中的血管平滑肌細胞。TIMP可以以蛋白的形式如純化的重組TIMP-2或TIMP-4蛋白(YiliangE.Liuet al.，J.Biol Chem.，272(30)20479-20483，1997)介導入平滑肌細胞。TIMP還可以以編碼TIMP蛋白的DNA序列(Damon A.et al.，J.ProteinChem.，16237-255，1997)導入平滑肌細胞。代表性的，DNA序列包含于一個載體以表達TIMP蛋白。編碼TIMP蛋白的DNA序列可以通過該領域技術人員所知的方法介導入平滑肌細胞，如利用電穿孔法或者陽離子脂質體融合法介導裸DNA。
這里所說的“裸DNA”定義為包含于一個非病毒載體的DNA。正如本領域專業技術人員所知，任何以上DNA轉導方法都可以結合起來。
圖2中的數據顯示重組TIMP-2或TIMP-4蛋白抑制VSMC的遷移。研究了純化的重組TIMP-2或TIMP-4對血管平滑肌細胞遷移的作用。大鼠平滑肌細胞適度入侵。40小時孵育后，約2.5％的細胞已遷移穿過Matrigel屏障，分別加入使終濃度為10nmol/L的重組TIMP-2或重組TIMP-4，遷移分別下降72％和60％。通過細胞計數發現對照和TIMP處理過的細胞之間生長速率沒有明顯改變。因此對照細胞和TIMP處理過的細胞之間遷移的差異不是由TIMP對平滑肌細胞的增殖作用引起。
TIMP有各種不同的生物學功能，除了其抗MMP活性以外，還包括細胞生長和凋亡的調節作用等。包括TIMP-2在內所有TIMP的抑制MMP的活性已證實由其N末端區域所介導，該末端區域與活化的MMP形成緊密復合物(Murphy et al.，Methods Enzymol.248496-510，1995；Hutton et al.，Biochemistry，3710094-8，1998)。由于TIMP-2和TIMP-4對VSMC遷移的抑制作用是由其抗MMP的活性介導，因此我們想研究僅有抗MMP區域的突變TIMP是否也能抑制VSMC的遷移。基于這點，我們構建了僅有TIMP-2N末端(氨基酸殘基1-124)的TIMP-2cDNA突變體。將突變的TIMP-2轉染入VSMC，并與沒有轉染TIMP-2的VSMC對照比較細胞遷移。如圖3所示，與野生型TIMP-2一樣，僅有TIMP-2 N末端區域的突變型也能有效抑制VSMC的遷移。
本發明還提供了一個治療或預防受治療者再狹窄的方法，包括對受治療者給予一個有效量TIMP如TIMP-2或TIMP-4以治療或預防再狹窄。TIMP可以作為一種蛋白質如純化的重組TIMP蛋白或從天然物質分離的TIMP蛋白給予受治療者。TIMP還可以以編碼TIMP蛋白的DNA序列導入平滑肌細胞。代表性的，DNA序列包含于一個載體以表達TIMP蛋白。編碼TIMP蛋白的DNA序列可以以許多不同的方式給予受治療者。例如，可以用許多本領域技術人員所知的有效方法把包含編碼TIMP蛋白的DNA序列的載體介導入受治療者。諸如利用電穿孔法或者陽離子脂質體融合法介導裸DNA。這里所說的“裸DNA”定義為包含于一個非病毒載體的DNA。正如本領域專業技術人員所知，任何以上DNA轉導方法都可以結合起來。
為檢驗給予TIMP在血管損傷后是否可以抑制血管平滑肌細胞遷移防止再狹窄，我們進行體外動脈器官培養以檢測血管損傷后的再狹窄。Wistar鼠球囊血管成形術損傷，球囊損傷后立即將頸動脈取出并在動脈器官培養物中培養。器官培養3周后，動脈被固定并做組織分析和TIMP-2免疫組化染色。如圖4所示，被球囊損傷的血管處逐步顯示有明顯的血管重塑或再狹窄(圖4中A)，而在對照的未損傷血管沒有觀察到損害(圖4中B)。在再狹窄損傷部位TIMP-2表達明顯升高(圖4中C)。這些數據顯示動脈器官培養模型對研究球囊損傷后的再狹窄反應是合適的。
然后在我們建立的動脈器官培養模型中檢驗了重組人TIMP-2蛋白(rTIMP-2)或重組人TIMP-4蛋白(rTIMP-4)抑制再狹窄的有效性。分離球囊損傷的頸動脈并在器官培養基質中培養，分別加或不加rTIMP-2或rTIMP-4。正如我們所期待的，在不加rTIMP-2或rTIMP-4的損傷動脈中很容易觀察到再狹窄反應(圖5中B、D)，而rTIMP-2或rTIMP-4的存在明顯降低損傷動脈中的再狹窄反應(如圖5中C、E)。與對VSMC遷移的抑制效應聯系起來，這些數據明顯證實TIMP在抑制VSMC遷移然后減輕再狹窄中的治療價值。
為達到將TIMP基因介導入受治療者的目的，可以將一個包含編碼TIMP的核酸的重組載體與一種無菌水溶液組合，該溶液最好是與接受者的血液等滲。可以將重組載體懸浮于含有生理上可配伍的物質如氯化鈉、甘氨酸等以及與生理條件相配的緩沖PH的水中，并將該溶液滅菌。本發明的較好例子，重組載體與20-25％蔗糖組合配制于生理鹽水中用以介導入哺乳動物。所給予的編碼TIMP的核酸的量或者載體中編碼TIMP的核酸的量足以抑制受治療者的再狹窄。但是，確切的劑量依賴于各種因素諸如給藥的目的、給藥方式、組合的有效性、以及受治療者個體藥代動力學參數。本領域專業人員可以按治療的需要決定治療的頻率和時間。本發明優點血管損傷后再狹窄一直是臨床上有待解決的問題，尤其是急性心肌梗塞、冠脈狹窄以及經皮冠狀動脈腔內血管成形術后冠狀動脈再狹窄是臨床上的難題，目前除了用支架機械地預防再狹窄以外，沒有什么方法。還沒有應用基因療法進行治療。
本發明采用的是基因療法，并且通過裸DNA肌內注射然后電穿孔的方法來轉移基因，而沒有用病毒做載體，因此操作簡單，沒有毒性。


圖1是肌內注射TIMP-4表達質粒后血清中的TIMP-4蛋白水平。
圖2是重組人TIMP-2或重組人TIMP-4對血管平滑肌細胞遷移的抑制作用示意圖。
圖3是轉染僅有N末端區域的突變TIMP-2質粒對血管平滑肌細胞遷移的抑制作用示意圖。
圖4是鼠頸動脈損傷后的組織分析和TIMP-2免疫染色。
圖5是重組人TIMP-2或重組人TIMP-4對損傷的頸動脈再狹窄的抑制作用示意圖。
實施例1肌內注射TIMP-4表達質粒的試驗利用一次性胰島素注射器以及一支25號針，將50μl(150μg)TIMP-4表達質粒DNA(TIMP-4 cDNA插入pCI-neo哺乳動物表達載體，PromegaCorporation，Madison，WI)或僅質粒DNA注射入6周大的雌性裸鼠的雙側脛骨前肌肉。然后進行電穿孔法一對電極插入肌肉，在DNA注射部位相距5mm間隙，用一個電脈沖發生器Electro Square Porator ECM 830(Genetronics，Inc.San Diego，CA)給予電脈沖。三次脈沖，每秒一次，電壓為200V，傳導到注射部位，每個脈沖持續50ms。然后，給予三次反向的脈沖。
圖1顯示肌內注射TIMP-4表達質粒后血清中的TIMP-4蛋白水平。單次肌內注射150μg TIMP-4表達質粒前以及在4、8、13和21天后收集10μl的血清，用TIMP-4抗體進行western blot分析。圖1表示一只鼠中血清TIMP-4水平在不同時間的變化。所有5只鼠在每個時間點上均觀察到相似的TIMP-4水平。
實施例2重組人TIMP-2(或重組人TIMP-4)對血管平滑肌細胞遷移的抑制作用用Matrigel侵入法檢驗純化的重組人TIMP-2(或重組人TIMP-4)蛋白對鼠平滑肌細胞遷移的抑制作用。簡言之，10μm孔聚碳酸酯膜用4mg/ml的生長因子減少的Matrigel被覆。鼠平滑肌細胞以35,000個細胞/ml/孔的密度在含5％FCS的DMEM中播種，每孔不加入或加入重組人TIMP-2或重組人TIMP-4蛋白達終濃度為10n mol/l。底室(Bottom chamber)中的培養基含10％FCS。在含5％CO2的潮濕的培養箱中37℃培養48小時后，將培養基和細胞從底室中轉移出來離心，用Nikon顯微鏡計數。結果見圖2。以未處理的對照組的細胞遷移作為100％。用重組人TIMP-2或重組人TIMP-4處理過的細胞的遷移以對照組的百分比表示。數字代表三組的平均值±SD。
實施例3轉染僅有N末端區域的突變TIMP-2質粒對血管平滑肌細胞遷移的抑制作用用我們以前報道過的方法(Wang and Shi et al，Oncogne 142767-2774，1997)將僅有N末端區域的突變TIMP-2質粒轉染入VSMC。簡言之，40μg對照pCI-neo質粒或pCI-TIMP2-N質粒用磷酸鈣介導法轉染入VSMC。用G-418選擇，收集耐受的細胞。用前面描述的方法檢驗對平滑肌細胞遷移的抑制作用。結果見圖3。以轉染對照質粒的平滑肌細胞遷移作為100％。轉染pCI-TIMP2-N質粒的平滑肌細胞的遷移以對照組的百分比表示。數字代表兩組的平均值±SD。
實施例4體外動脈器官培養檢測血管損傷后的再狹窄對雄性Wistar鼠的頸動脈球囊損傷按shi等的方法進行(Shi，etal.，Circulation Research，84498-504，1999)。分離損傷以及對照的動脈并在CCDM140器官培養基質中培養，該培養基中含5％小牛血清、20ng/ml的表皮生長因子(EGF)、2ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、10ng/ml的胰島素以及2ng/ml的轉化生長因子β1(TGF-β1)。每5天換一次培養基。器官培養3周后，固定動脈并進行組織分析和TIMP-2免疫組化染色，結果見圖4。圖4中A和B為H&E染色的部分。箭頭指示再狹窄損害區域。圖4中C和D為TIMP-2免疫染色。箭頭指示TIMP-2蛋白表達。A和C為損傷的頸動脈，B和D為沒有損傷的動脈對照。
實施例5在動脈器官培養中重組人TIMP-2或重組人TIMP-4對損傷的頸動脈再狹窄的抑制作用分離球囊損傷的頸動脈并在實施例4所描述的器官培養基質中培養，分別加或不加rTIMP2或rTIMP-4。加入的rTIMP-2或rTIMP-4的終濃度為100nmol/l。每3天換一次培養基并重新加入rTIMP-2或rTIMP-4。培養3周后固定動脈并進行H和E染色用于組織分析，結果見圖5。圖5中A為沒有損傷的動脈對照，圖5中B、D為沒有加入rTIMP-2和rTIMP-4的受損動脈，圖5中C為加入rTIMP-2的受損動脈，圖5中E為加入rTIMP-4的受損動脈。如圖5中B、D，在不加rTIMP-2或rTIMP-4的損傷動脈中可以很容易觀察到再狹窄反應，而rTIMP-2或rTIMP-4的存在明顯降低損傷動脈中的再狹窄反應(如圖5中C、E)。說明rTIMP-2和rTIMP-4可以抑制血管再狹窄。也就是抑制血管損傷后再狹窄。結合實施例2，rTIMP-2和rTIMP-4抑制再狹窄很可能是通過抑制平滑肌細胞的遷移而實現的。
權利要求
1.一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷后再狹窄的藥物中的應用，其特征在于所述藥物中含有有效量基質金屬蛋白酶組織抑制劑TIMP-2或TIMP-4藉以抑制平滑肌細胞的遷移，以治療或預防再狹窄。
2.一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷的藥物中的應用，其特征在于所述藥物中含有有效量TIMP-2或TIMP-4藉以抑制平滑肌細胞的遷移，以治療或預防血管損傷。
3.如權利要求2所述的一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷的藥物中的應用，其特征在于所述血管損傷是由血管成形術、動脈瘤、動脈粥樣硬化、動脈閉塞、損傷、移植、肺栓塞或心肌梗塞所引起。
4.如權利要求1所述的一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷后再狹窄的藥物中的應用，其特征在于所述治療或預防血管損傷后再狹窄包括介導和表達一個編碼TIMP-2或TIMP-4蛋白的DNA序列進入受治療者足夠數量的細胞內以治療或預防受治療者的再狹窄。
5.如權利要求4所述的一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷后再狹窄的藥物中的應用，其特征在于所述的TIMP DNA序列可以是全長序列，或僅編碼多肽N末端1-124位氨基酸殘基的N末端序列。
6.如權利要求4所述的一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷后再狹窄的藥物中的應用，其特征在于所述的細胞為平滑肌細胞。
7.如權利要求4所述的一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷后再狹窄的藥物中的應用，其特征在于所述的編碼TIMP-2或TIMP-4蛋白的DNA序列是通過一個包括肌內注射裸DNA然后進行電穿孔的方法介導的。
8.如權利要求4所述的一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷后再狹窄的藥物中的應用，其特征在于所述的編碼TIMP-2或TIMP-4蛋白的DNA序列是通過一個包括肌內注射脂質體配方的裸DNA的方法介導的。
9.如權利要求4所述的一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑在制備治療或預防血管損傷后再狹窄的藥物中的應用，其特征在于所述的裸DNA是在因血管成形術所致血管損傷前3-7天注射。
全文摘要
動脈壁對球囊損傷的反應不完全被人所知,血管成形術后再狹窄的臨床問題尚未解決。本發明提供了一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)在制備治療或預防血管損傷后再狹窄的藥物中的應用,通過給予TIMP－2或TIMP－4藉以抑制平滑肌細胞的遷移,以治療或預防血管損傷后再狹窄以及血管損傷。而且TIMP可以通過肌內注射裸DNA然后進行電穿孔的方法有效地給予。
文檔編號A61P9/00GK1338305SQ0012409
公開日2002年3月6日 申請日期2000年8月21日 優先權日2000年8月21日
發明者陳偉杰, 柴嬰蕾 申請人:杭州泰士生物科技有限公司