一種貽貝暫養過程中的免疫增強劑及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及一種貽貝暫養過程中的免疫增強劑，其由以下組分組成：類胡蘿卜提取物、肽聚糖、甘露寡糖、L?精氨酸以及輔酶Q10，并且上述各組分的質量比為11～23:6～15:9～13:2～4:2～4；還涉及該免疫增強劑的制備方法和在貽貝暫養過程中的應用。與現有技術相比，本發明中的免疫增強劑中以類胡蘿卜提取物為主要配料，該類胡蘿卜提取物以蝦類副產物為主要原料提取，充分利用水產品加工副產物進行高值化開發，同時組配肽聚糖和甘露寡糖，加入適量L?精氨酸以及輔酶Q10，各組分能協調增效，顯著提高貽貝類機體的免疫功能，促進貽貝生長與代謝，降低死亡率。
【專利說明】
一種貽貝暫養過程中的免疫増強劑及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及水產養殖領域，尤其涉及一種貽貝暫養過程中的免疫增強劑及其制備 方法和應用。
【背景技術】
[0002] 貽貝為典型濾食性貝類，如翡翠貽貝、紫貽貝、厚殼貽貝、隔貽貝等，其利用鰓上的 纖毛過濾水中的懸浮顆粒為食，因此需要過濾大量的海水。此外，由于貽貝的生存環境一般 是近岸，所以貽貝富集重金屬和有機化合物的幾率也高于其他海洋生物。
[0003] 近年來，貽貝養殖及暫養過程中，存在著生長異常、死亡率增高的現象，有些學者 將其與目前日益增長的海水污染聯系起來，并證實了環境污染與貽貝的非病原性疾病有著 一定的關系。貽貝對外界脅迫的免疫機制主要為細胞免疫和體液免疫，其中細胞免疫依賴 于貝體血細胞吞噬、包囊、形成細胞結等細胞免疫反應，清除病原物顆粒和自體損傷或死亡 細胞，并參與損傷修復等功能。貝類吞噬作用伴隨著水解酶類釋放以及抗氧化酶類參與來 共同殺滅入侵異物。此外，貝類缺乏特異性免疫球蛋白，因此，除了以上的細胞免疫外，還需 依靠機體的體液免疫作用，乳凝集素凝集和調理作用、溶血素及溶酶體酶等非特異性免疫 因子來實現對外界脅迫因子的抵御。
[0004] 目前，對于貽貝等雙殼貝類的免疫調節及增強研究還存在較大不足，不過越來越 多的研究表明貝類免疫作用在貝類機體防御反應中起著十分重要的作用。免疫增強劑指單 獨或同時與抗原使用均能增強機體免疫應答的物質，且通過提高貝類的非特異性免疫功能 以及特異性免疫功能，來增強水產貝類的抗疾病感染能力。免疫增強劑與抗生素和疫苗相 比，具有安全、無殘留、作用范圍廣和使用方便等優點。可見，對貝類的免疫調節及增強劑進 行研究與應用，有望為貝類病害防御、保障貝類產品安全提供一條新的途徑。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的第一個技術問題是針對現有技術而提供一種能顯著增強貽貝 的免疫能力進而提高其抗病力的貽貝暫養過程中的免疫增強劑。
[0006] 本發明所要解決的第二個技術問題是針對現有技術而提供一種上述免疫增強劑 的制備方法。
[0007] 本發明所要解決的第三個技術問題是針對現有技術而提供一種上述免疫增強劑 在貽貝暫養過程中的應用。
[0008] 本發明解決上述第一個技術問題所采用的技術方案為:一種貽貝暫養過程中的免 疫增強劑，其特征在于，其由以下組分組成:類胡蘿卜提取物、肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以 及輔酶Q10,并且上述各組分的質量比為11~23:6~15:9~13:2~4:2~4。
[0009] 作為優選，所述甘露寡糖的聚合度為3~6。
[0010] 本發明解決上述第二個技術問題所采用的技術方案為:上述免疫增強劑的制備方 法包括以下步驟：
[0011] (1)類胡蘿卜提取物的制備:取蝦類加工副產物，加入體積比為2~4:6~8的異丙醇 和正己烷混合提取溶劑，蝦類加工副產物與上述混合提取溶劑的質量體積比為1~3:5~8; 提取8~10h后，高速均質、離心，收集離心上清液，并將離心獲得的沉淀物，再次采用上述提 取溶劑提取1~2次后，合并上清液得提取混合液；
[0012] 除去提取混合液中的正己烷后，加入等體積的0.05~0.15%NaCl溶液進行漂洗， 分液去除水層;然后加入少量硫酸鈉以去除殘留水分，經過濾后采用氮氣吹打5~8min，獲 得提取物;將獲得的提取物38~43°C下進行真空減壓濃縮，即得所需的類胡蘿卜素提取物；
[0013] (2)將獲得的類胡蘿卜提取物與肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q10按上述質 量比混合均勻，即得所需的免疫增強劑。
[0014] 作為優選，所述蝦類為南美白對蝦或斑節對蝦中的至少一種。
[0015] 作為優選，所述步驟(2)中使用的甘露寡糖的聚合度為3~6。
[0016] 本發明解決上述第三個技術問題所采用的技術方案為:將上述免疫增強劑以飼料 添加劑的形式加入到貝類暫養飼料中，其中每千克貝類暫養飼料中加入2~4.5克上述免疫 增強劑。
[0017] 與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明的免疫增強劑中以類胡蘿卜提取物為 主要配料，該類胡蘿卜提取物以蝦類副產物為主要原料提取，充分利用水產品加工副產物進 行高值化開發，同時組配肽聚糖和甘露寡糖，加入適量L-精氨酸和輔酶Q10等組分，各組分 能協調增效，顯著提高貽貝類機體的免疫功能，促進貽貝生長與代謝，降低死亡率。
【具體實施方式】
[0018] 以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0019] 實施例1:免疫增強劑制備
[0020] 本實施例中的免疫增強劑由以下組分組成:類胡蘿卜提取物、肽聚糖(聚合度為3~ 6,下同）、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q10,上述各組分的質量比為11:6:9:2:2。
[0021] 本實施例中的免疫增強劑通過以下步驟制備:取蝦類(南美白對蝦)加工副產物， 加入體積比為2:6的異丙醇和正己烷混合提取溶劑，蝦類加工副產物與上述混合提取溶劑 的質量體積比為1:5;提取8h后，高速均質、離心，收集離心上清液，并將離心獲得的沉淀物， 再次采用上述提取溶劑提取1~2次后，合并上清液得提取混合液。除去提取混合液中的正 己烷后，加入等體積的0.05 %NaCl溶液進行漂洗，分液去除水層;然后加入少量硫酸鈉以去 除殘留水分，經過濾后采用氮氣吹打5min，獲得提取物;將獲得的提取物38°C下進行真空減 壓濃縮，即得類胡蘿卜素提取物。
[0022]將獲得的類胡蘿卜提取物與肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q10按上述質量 比混合均勻，即得所需的免疫增強劑。
[0023]實施例2:免疫增強劑制備
[0024] 本實施例中的免疫增強劑由以下組分組成:類胡蘿卜提取物、肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q1 〇，上述各組分的質量比為23:15:13:4:4。
[0025] 本實施例中的免疫增強劑通過以下步驟制備:取蝦類(斑節對蝦)加工副產物，加 入體積比為4:8的異丙醇和正己烷混合提取溶劑，蝦類加工副產物與上述混合提取溶劑的 質量體積比為3:8;提取10h后，高速均質、離心，收集離心上清液，并將離心獲得的沉淀物， 再次采用上述提取溶劑提取1~2次后，合并上清液得提取混合液。除去提取混合液中的正 己烷后，加入等體積的0.15 %NaCl溶液進行漂洗，分液去除水層;然后加入少量硫酸鈉以去 除殘留水分，經過濾后采用氮氣吹打8min，獲得提取物;將獲得的提取物43°C下進行真空減 壓濃縮，即得所需的類胡蘿卜素提取物。
[0026]將獲得的類胡蘿卜提取物與肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q10按上述質量 比混合均勻，即得所需的免疫增強劑。
[0027]實施例3:免疫增強劑制備
[0028] 本實施例中的免疫增強劑由以下組分組成:類胡蘿卜提取物、肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q1 〇，上述各組分的質量比為17:10:11:3:3。
[0029] 本實施例中的免疫增強劑通過以下步驟制備:取蝦類加工副產物(南美白對蝦加 工副產物和斑節對蝦加工副產物混合物，混合比例1:1 )，加入體積比為3:7的異丙醇和正己 烷混合提取溶劑，蝦類加工副產物與上述混合提取溶劑的質量體積比為2:7 ;提取9h后，高 速均質、離心，收集離心上清液，并將離心獲得的沉淀物，再次采用上述提取溶劑提取1~2 次后，合并上清液得提取混合液。除去提取混合液中的正己烷后，加入等體積的〇. 10 %NaCl 溶液進行漂洗，分液去除水層;然后加入少量硫酸鈉以去除殘留水分，經過濾后采用氮氣吹 打7min，獲得提取物;將獲得的提取物40°C下進行真空減壓濃縮，即得所需的類胡蘿卜素提 取物。
[0030] 將獲得的類胡蘿卜提取物與肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q10按上述質量 比混合均勻，即得所需的免疫增強劑。
[0031] 實施例4:免疫增強劑制備
[0032] 本實施例中的免疫增強劑由以下組分組成:類胡蘿卜提取物、肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q1 〇，上述各組分的質量比為18:10:10:2:4。
[0033] 本實施例中的免疫增強劑通過以下步驟制備:取蝦類加工副產物，加入體積比為 2:8的異丙醇和正己烷混合提取溶劑，蝦類加工副產物與上述混合提取溶劑的質量體積比 為3:5;提取8h后，高速均質、離心，收集離心上清液，并將離心獲得的沉淀物，再次采用上述 提取溶劑提取1~2次后，合并上清液得提取混合液。除去提取混合液中的正己烷后，加入等 體積的〇.〇8%NaCl溶液進行漂洗，分液去除水層;然后加入少量硫酸鈉以去除殘留水分，經 過濾后采用氮氣吹打8min，獲得提取物;將獲得的提取物40°C下進行真空減壓濃縮，即得所 需的類胡蘿卜素提取物。
[0034]將獲得的類胡蘿卜提取物與肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q10按上述質量 比混合均勻，即得所需的免疫增強劑。
[0035]實施例5:免疫增強劑應用試驗
[0036] 試驗組:任取實施例1~4中制備的免疫增強劑與貝類暫養飼料以2~4.5克/千克 的比例混合用于紫貽貝暫養過程中的日常飼料，具體包括試驗組1、試驗組2以及試驗組3， 其中試驗組1中免疫增強劑與貝類暫養飼料的混合比例為2克/千克，試驗組2中免疫增強劑 與貝類暫養飼料的混合比例為3克/千克，試驗組3中免疫增強劑與貝類暫養飼料的混合比 例為4.5克/千克；
[0037] 比較組:與試驗組不同的是，該組采用市售免疫增強劑(殼寡糖），具體包括比較組 1、比較組2以及比較組3,其中比較組1中市售免疫增強劑與貝類暫養飼料的混合比例為2 克/千克，比較組2中市售免疫增強劑與貝類暫養飼料的混合比例為3克/千克，比較組3中市 售免疫增強劑與貝類暫養飼料的混合比例為4.5克/千克，其他養殖條件均與試驗組相同；
[0038]對照組:該組采用基礎飼料進行喂食，其他養殖條件均與試驗組相同。
[0039]各組均于相同大小的養殖池進行試驗，并且各組均重復設置三個相同的養殖池， 各養殖池均投放相同量的紫貽貝。試驗周期為8周，水溫為15~20°C，每天分早晚投食兩次， 試驗組和比較組中連續投食含免疫增強劑的飼料四天后改用基礎飼料進行喂食三天，以此 模式循環喂養。
[0040] 養殖8周后，計算各養殖池中的紫貽貝數，計算成活率，同時對各養殖池中的所有 紫貽貝稱重，計算增重率，其中試驗組的增重率均大于比較組，而比較組的增重率均大于對 照組。免疫保護率=(1-實驗組死亡率/對照組死亡率)*1〇〇。試驗結果如表1所示。
[0041] 表1各組紫貽貝成活率和免疫保護率
[0042]
?〇〇43?~由表1的試驗結果可見，本發明中的免疫增強劑能顯著提高紫貽貝的成活率和生 長速度，提高其機體免疫功能。
【主權項】
1. 一種貽貝暫養過程中的免疫增強劑，其特征在于，其由以下組分組成:類胡蘿卜提取 物、肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q10,并且上述各組分的質量比為11~23:6~15:9 ~13:2~4:2~4〇2. 如權利要求1所述的免疫增強劑，其特征在于，所述甘露寡糖的聚合度為3~6。3. -種如權利要求1所述的免疫增強劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 類胡蘿卜提取物的制備:取蝦類加工副產物，加入體積比為2~4:6~8的異丙醇和正 己烷混合提取溶劑，蝦類加工副產物與上述混合提取溶劑的質量體積比為1~3:5~8;提取 8~10h后，高速均質、離心，收集離心上清液，并將離心獲得的沉淀物，再次采用上述提取溶 劑提取1~2次后，合并上清液得提取混合液； 除去提取混合液中的正己烷后，加入等體積的0.05~0.15 %NaCl溶液進行漂洗，分液 去除水層;然后加入少量硫酸鈉以去除殘留水分，經過濾后采用氮氣吹打5~8min，獲得提 取物;將獲得的提取物38~43°C下進行真空減壓濃縮，即得所需的類胡蘿卜素提取物； (2) 將獲得的類胡蘿卜提取物與肽聚糖、甘露寡糖、L-精氨酸以及輔酶Q10按上述質量比 混合均勻，即得所需的免疫增強劑。4. 如權利要求3所述的免疫增強劑，其特征在于，所述蝦類為南美白對蝦或斑節對蝦中 的至少一種。5. 如權利要求3所述的免疫增強劑，其特征在于，所述步驟(2)中使用的甘露寡糖的聚 合度為3~6。6. -種如權利要求1或2所述的免疫增強劑在貽貝暫養過程中的應用，其特征在于，將 上述免疫增強劑以飼料添加劑的形式加入到貝類暫養飼料中，其中每千克貝類暫養飼料中 加入2~4.5克上述免疫增強劑。
【文檔編號】A23K10/30GK106071410SQ201610523298
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月29日
【發明人】張賓, 房傳棟, 鄧尚貴
【申請人】浙江海洋大學