專利名稱：通用微方陣的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物，醫學，材料科學等技術領域。
微方陣的另一個通用術語就是芯片，微方陣在這里是指非計算機領域里的廣義芯片。為區別起見，我們在廣義場合下使用微方陣，而就其中某一具體形式則稱之為芯片。現在主要是指基因芯片和材料芯片。高密度基因芯片主要通過微電子光刻技術原位合成生產寡聚核苷酸芯片，最高可達40萬個寡聚核苷酸/平方厘米，代表6000～8000個基因。其缺點是重復性極差，目前僅用于科研領域；還有cDNA膜芯片，密度高達2000個基因/平方厘米。由于它是以尼龍膜或硝酸纖維素膜為基質進行點膜，隨著密度增大，樣品之間的相互污染難以避免，從而限制了其密度。
本發明采用玻璃或石英材質的光纖或毛細管為生物或化學目標分子的載體，并以大量不同的載體為基元根據給定的二維空間地址將它們一一排列起來并進一步拼裝成芯片。這類芯片的密度直接取決于光纖或毛細管的外徑。目前光纖的最小外徑系列為5～10微米，其所能提供的最大芯片密度潛力為100萬～400萬/平方厘米。毛細管主要用于制作細胞芯片，其外徑目前所知道的在140微米，可以用以制作密度高達3000～5000/平方厘米的細胞芯片。由于毛細管基芯片的巨大的內表面積，也可以將之發展成為較低密度的用于定量檢測的生物大分子芯片。本技術的優勢不僅在于它能提供芯片的超高密度，還在于適用范圍的廣譜性和可再生性。
本發明的目的在于從技術上找到進一步大幅度提高這種通用的芯片密度的基礎性方法。這里將要提供的技術內容包括涉及高密度芯片的制造技術，自動化設備的原理設計及其制造工藝，在各領域里的用途及其相應的使用方法。在各個領域里高密度芯片都可以找到相當有潛力的應用前景。比如在核酸領域里，高密度基因芯片可以極大地提高基因測序和基因表達譜研究。目前人類基因組的測序工作已工廠化，旨在加速測序進程。現在基因研究中大量的人力和經費都是投入到單調的測序中。高密度基因芯片，尤其是密度高達幾十萬甚至上百萬的高密度基因芯片將從根本上使基因測序工作變得簡易和快速；用于分析人類等位基因多態性的基因芯片可以為人們提供了一個強有力的，萬無一失的基因身份鑒定系統；在蛋白質領域里，高密度免疫芯片可以大幅度提高免疫診斷的效率并擴大其診斷譜。高密度蛋白和化學芯片將為剛剛興起的蛋白組學研究提供一個極其有力的武器。高密度細胞(受體)芯片在新藥先導化合物篩選和建立化合物結構及其生物活性的關系等領域的研究中有著現實的應用價值。在材料科學研究中，材料芯片將可以使材料的合成和優化效率提高幾個甚至幾十個數量級。
本發明從總體上可以分為1.芯片制作技術，包括信號標記，目標物固定，芯片拼裝等方面；2.芯片生產線中各設備的原理設計及制造工藝；3.信號檢測和數據處理技術及設備；4.全自動雜交及系統整合；5.芯片在各個領域里的應用及使用方法。
芯片制作原理本發明制作芯片的基本原理是以光纖或毛細管等形式的載體為基元，將要固定的目標物(即，將要被固定在光纖端面上的生物或化學分子以及將要被固定在毛細管內壁上的細胞或目標分子等)直接或間接地固定在光纖端面或毛細管內壁上，然后將固定有各種不同目標物的光纖或毛細管分類，排序，按址存放并構建成載體形式的文庫。制作芯片時，首先將載體從文庫中取出按順序批量裝入光纖或毛細管拼裝器的各個單元內，經光纖或毛細管拼裝器的三維排列形成光纖或毛細管方陣。最后將光纖方陣未固定有目標物的端面進行一些加工后形成約3～5厘米厚的芯片。
信號標記是指在分析物分子上通過共價合成或生物親和的方式連接一個或多個信號標記分子。在本發明中主要采用了生物發光，酶聯免疫化學發光和熒光的標記方法。
目標物固定是指將要檢測的目標分子或細胞以共價鍵或非共價鍵形式連接到光纖端面或毛細管內壁上。
芯片生產線的設計及其制造工藝由于我們的芯片未采用常規的“點膜式”或原位合成制作技術，而是一種“拼裝式”的芯片，而且所選用的光纖通常極細，因此操作它們的機械零件必須具有足夠高的精密度并微型化。借助微電子技術中已發展很成熟對硅材料的微細加工技術，可以制作出高度精密，高度集成的芯片生產線。芯片生產線的工作原理是首先將若干種目標分子載體如光纖或毛細管根據各自所固定的分子種類逐個存放在刻蝕在硅襯底上獨立的一字二維排列的不同的小室(Closet)列內，建立目標分子與小室地址(Closet No.)的一一對應關系。將一列這樣按即定順序排列并存放不同目標分子載體的小室定義為列室(train)，并將若干個這樣的列室按已知的地址特征存放在一個目標分子載體的文庫(library)里。
光纖或毛細管拼裝器(簡稱拼裝器(assemblier))的基礎是光纖或毛細管排列器(簡稱排列器(displacer))。所謂拼裝器就是用一系列支架(cartridge)按確定的地址將排列器定位起來并為每一個排列器的正常工作供氣，電，諧振機械能和膠粘劑等的全自動裝置。排列器由列室，拾取器(fetcher)構成，目的是為了將儲存在列室中每個小室的光纖或毛細管每次分別只取一個然后遵照列室中地址相應緊密的平行排列，并最終形成一個膠合起來的光纖列片或毛細管列片(簡稱列片，sheet)。若干個這些列片經自動疊放裝置最終疊放并膠合成光纖或毛細管方陣(array)。再經過一些后續加工過程，最后形成芯片。下面具體介紹這種拼裝器的特征，其結構及工作原理見圖8。
圖1-1是拼裝器的基本單位-小室的工作原理圖。小室的設計目的是為了確保在施加一個一定強度的電磁脈沖的情況下僅有一根光纖或毛細管從小室中被取出。其基本原理是通過化學刻蝕的方法形成的錐型槽的底部有一個被刻蝕透的小縫。這個小縫的寬度只比所要儲存的光纖直徑略大一點(比如光纖直徑為10微米時縫的寬度可以是12～15微米左右)，其目的是僅讓一根光纖順利地通過，而不允許兩根以上的光纖同時通過。這種小室的密封端是不透氣的。工作時，在小室的前方放置一個磁場及其強度可以瞬時在1或0之間變換的開關磁場發生器，如軟磁鐵鋁合金磁芯。由于光纖是預先經過磁性材料鍍過的，所以一旦磁場開關處于開的狀態將會有一個個光纖被吸引出來。為了確保僅有一個光纖被取出，必須將鐵鋁合金磁芯和小室的小縫靠得足夠近(最佳距離應是略大于一個但小于兩個光纖的直徑尺度)以確保第二根光纖無法被吸引出來。由于光纖的縱向尺度遠大于小室的深度，所以光纖在小室中顛倒過來的情況是可以排除的。但是這仍然存在著光纖在其中堆放不整齊的情況，而且這種雜亂會使得縱使磁場很強時小縫近處的光纖被干擾而無法被正常吸引出去。這種情況是絕對不允許的。因為在一列室中每次哪怕僅有一個光纖未能取出都會造成“移位突變”使整個光纖的二維排列次序出現錯誤。為了取保光纖在小縫端口的排列或取向與小縫一致從而有利于順利取出，在小室或列室的上方或下方垂直向上或向下施加一個強度微弱但足以使光纖發生上下諧振的脈沖式可控聲波諧振器。聲波諧振器與開關磁場協同作用。即它們同時處于開的或關的狀態，這樣的電子開關可以設計一個簡單的電子線路板使其統一接受電腦的時鐘控制來做成。聲波諧振器使光纖在縫口附近的的取向與小縫一致，因為在一致時，光纖被磁場吸引又被越來越窄的縫口鉗制，這種形式十分利于被取出。光纖被取出后還不能在重力作用下下降，因為磁場足夠強以致于光纖被隨即“粘”在磁芯上。由于磁芯與小室壁間距及縫口寬度的限制，被取出光纖的后隨者只能被堵在縫口內側而不能出來。然后去除聲波諧振和磁場作用，此時被粘在磁芯上的光纖能否掉下來取決于剩磁的存在特性。一般來說，軟磁鐵鋁合金磁芯的剩磁很小，在間隔短時間之后已不足于將后隨者吸引出來。為盡量減少剩磁問題，要使得產生開關磁場的電流強度盡量小，只要能夠將小室中的光纖都吸引起來即可。由于光纖本身分量很輕而且空間尺度很小，距磁芯很近，所以所需要的開關磁場強度必將很小。那么由此所產生剩磁將微乎其微。這種度量要從實驗中去摸索最佳參數。在兒秒鐘(在剩磁可以忽略不計的情況下不必有時間間隔)之后，使一小股氣流如氮氣自上而下流經小室的縫口將光纖推下(光纖在自身重力的作用下可以自行下落，但為確保迅速下落特地加上一股氣流去強制)。
小室是由在硅襯底上經過微加工(化學蝕刻)形成的一個V型槽(見圖1-2)經一面密封構成。小室及列室的制作工藝可以簡述為硅片(厚1～2mm)→磨平拋光→切割成矩形(如500×5×2mm)硅片→二次拋光→保偏膜制作→CAD化學蝕刻保偏膜設計→化學蝕刻→成型→裝載目標物載體，如光纖等→封閉V型槽的喇叭型開口(圖1-1所示)→封蓋小縫→裝入支架(形成Fig.1-3所示的列室)或存入文庫。
每一個小室實際上是一個裝載數以萬計的光纖或毛細管的微型倉庫。由于光纖的尺寸一般為3～5毫米長，5～20微米或更粗，所以一個高1毫米，底0.775mm的錐型槽即可容納10000根直徑20微米的光纖。為了組裝芯片的方便，可以將幾百個甚至上千個這些微型倉庫精密地集成在500×5×2mm的硅片上。上述刻蝕用的是可以從硅材料廠購得并進行了研磨和拋光等工藝處理的(100)各向異性單晶硅，保偏膜可以使用氮化硅沉積或二氧化硅氧化法等，借助于CAD(計算機輔助設計)可以設計出滿足要求的保偏膜來。對施加了保偏膜的硅襯底進行化學蝕刻時可以使用如下腐蝕液配方KOH 23.4％(wt)，丙醇13.3wt％，H2O63.3wt％。溫度為80度時各晶面的刻蝕速度分別如下(100)面，0.6微米/min；(110)面，0.1微米/min；(111)面，0.006微米/min。在<100>面的腐蝕角為54.74°。在85度用KOH作腐蝕劑時兩種保偏膜的腐蝕速率為二氧化硅，14/min；Si3N4，～0/min.可以根據這些參數，小縫的寬度，硅襯底的厚度等確定出通過CAD設計保偏膜的參數。
對每一列室裝載目標物載體小縫加蓋和喇叭口密封后可以首先存入目標分子文庫里，如急需可以直接插入拼裝器內。
圖1-3為列室與起密封和減震作用的橡皮封條(rubber buffer)，起保護作用的剛性護套(holder)的裝配示意圖。
圖1-4為裝配起來的列室與E型軟磁鐵鋁合金磁芯的裝配圖(主視圖)。它是作為圖1-5的A-A方向的橫截面主視圖(附加了用以表示裝配后相互位置關系的列室的結構)。圖1-5中氮氣從上方進氣口進入，經下方的出氣口導出，同時將吸引出來的光纖或毛細管垂直推下并緊密地二維平行排列起來。隨即被下部的涂膠孔涂膠，固化后形成光纖列片或毛細管列片(sheet)。
圖1-6是列片的疊放裝置-芯片拼裝器原理示意圖。它是由若干個以支架(cartridge)形式表現的支架陣。其中的每一個支架都有一套可以轉換電流方向和強度(用于消除剩磁的)電極，一套通氣孔和一個涂膠孔。這些“電氣水”的供給途徑都是接觸式的或一插即通，一拔即斷的。這種設計宗旨是為了使得芯片拼裝器在選錄具體的列室-“選字”及安排其地址-“排版”時可以受到活字排版思想的啟發并能根據具體的實際需要靈活地加以運用。借助于現在的自動化控制技術要做到通過僅僅操作計算機鍵盤即可實現具體生產中對拼裝器的排版工作完全是可能的。
信號檢測及數據處理系統信號檢測方式取決于信號本身的特征。對于上述可見光信號的特點，可以采用光學顯微技術。這是一種十分成熟的光學透鏡系統，顯然，對于高密度芯片也可以使用它。但是，采用這種體系有它不便的一面，即它必須將芯片要么進行分區檢測將信號傳遞到小巧的感光部位上，要么一次成像到龐大的信號接受系統上去。二者對于上述高密度芯片的可見光信號的檢測都是不現實的。這里采用一種新型的適合于高密度芯片需要的檢測系統。其特征是，結構緊湊，小巧，一次性信號載荷大，最大可滿足一次傳遞和檢測每平方厘米2,160,900個超弱光點信號的要求(由于目前國際國內所能提供的光纖的直徑尺寸在5～10微米，所以這個信號傳輸量尚未突破我們所能制作的芯片密度極限。
信號檢測由檢測系統和與之相適應的芯片結構兩個方面組成。檢測系統的原理如圖2所示，它由科學制冷電荷轉移器件(Scientific Cooled CCD Camera)和信號導引光纖束組成。
電荷轉移器件(Charge Coupled Device，簡稱CCD)是一種可以同時做到在兩維空間的視野內對每一點光信號的位置和強度進行同時積分式記錄并轉換成數字形式的檢測儀器。原理上，由于半導體硅的能隙較窄(1.12eV)，受波長范圍在400～1100納米的光激發后可以產生電子-空穴對，從而實現光電轉換。借助微電子學中對硅片的微細加工技術目前可以做到將這些單元硅片做的很小(當前CCD中使用的最高密度的像素點(pixel)尺寸為6.8微米)。將這些分立的單元硅片產生的電荷通過時鐘電壓，移位寄存器進行分列轉移并通過模擬-數字轉化器(ADC)進一步轉化為數字信號，最后在計算機中儲存和在熒屏上顯示出來。適合于高密度芯片檢測要求的科學CCD有如下幾個方面的特殊要求1.采用背面光照。采用這種方式是為了獲得最大限度的光量子效率，因為CCD采用背面光照式硅芯片時具有最大的填充系數，現在有的CCD硅芯片的填充系數可以高達100％(fill factor＝100％)，即在相鄰像素點(pixel)之間沒有死空間(dead space)。
2.致冷CCD(Cooled CCD)。制冷溫度要達到-40～-60℃，最好達到-60℃。目前有商品出售的科研用制冷CCD可以達到這個溫度要求的一股采用乙二醇或空氣制冷。制冷溫度在這個溫度下，由熱振動產生的電子-空穴對造成的熱噪音-暗電流(Dark Current)降低到～0。制冷溫度在4℃以下時需要對CCD感光硅芯片預先進行并維持真空操作以防止水蒸氣凝結。否則，其周圍的水蒸氣會給低溫檢測帶來不少麻煩。
3.光纖束信號導引式檢測，無網格像素點方陣(CCD Chip)。像素點方陣(CCD Chip)直接和信號導引光纖束對準并緊密連接。這種光纖束信號導引方式的采用十分有利于將CCD感光硅芯片與待檢測的樣品作為兩個密閉的系統隔離開來，為單獨針對CCD感光硅芯片進行高真空和深制冷操作提供了技術支持，同時也為待檢測的生物或化學芯片在檢測過程中有特殊要求的溫度，氣壓和濕度等條件提供了必要的技術支持。因為一般的生物或化學反應都要求足夠的溫度和溶液條件，真空和低溫對于一般的化學和生物反應來說是一個不可逾越的障礙。在這里光纖束的信號導引起了關鍵的橋梁作用。當然，對于待測生物或化學芯片如果具有很高的信息儲存密度，即每根光纖或毛細管的直徑都很小的情況，信號導引光纖束不僅要和CCD感光硅芯片精確地對準，而且要和待測生物或化學芯片上的每一個將要發出的點信號精確的對準。也就是說，最好是CCD感光硅芯片-信號導引光纖束-待測生物或化學芯片三位一體精密配套。
這種精密對準的連接可以得到現有技術條件的支持。利用工業上成熟的精確連接技術將光纖方陣束以內嵌的方式作為數碼相機的一部分。
4.多位ADC(一般應達到12位以上)。這種要求是針對為了降低ADC的量化噪音(Quantization Noise，QN)而設置的。因為在ADC轉換過程中存在一個舍入誤差，這是量化噪音的來源，在量化噪音存在的前提下信號檢測的信噪比(Signal-to-NoiseRafio，SNR)與ADC的位數有如下關系SNRQN＝(6b+11)dB其中b為ADC的位數。所以一個高質量的科研用CCD需要高的ADC位數，現已商品化的科研用CCD一般具有8～16位，我們采用的CCD應盡量具有較多的ADC位數。
這種要求同時也考慮到最大程度地增大CCD可以檢測的動態范圍(Dynamic Range)和提高檢測相對靈敏度，從而有效防止檢測中的信號瀉溢(Blooming)現象。
由于我們的芯片也是以光纖或毛細管方陣的形式存在，而且它本身也可以起到導光的作用。所以我們需要的只是將這些配套的方陣(同樣的排列方式，點間距和密度。這里的點是指芯片上的每個與目標物固定端面相對應的另一端拋光端面和數碼相機的每個像素點(pixel))精確地對準和緊密地連接起來。光纖基芯片的目標物固定端面或毛細管基芯片的目標物固定面-毛細管內壁用來與觸發劑接觸。對于光纖基芯片而言，可以用后向散射的方式將光反射進去，而且為了增大光纖的導光效率，采用多模(multimode)大數值孔徑(NA)光纖。為了防止信號的隨即散射引起的鄰近光纖之間的信號干擾，本發明特意將目標物固定端面在固定目標物之前通過化學刻蝕技術刻蝕出一個淺的凹面(凹面的深度略微超過目標物雜交后的顆粒總尺寸但又不至于影響到雜交和與觸發劑接觸的流體力學和試劑擴散所必要的目標物及其雜交后與觸發劑的足夠的接觸程度)并將目標物固定在這個凹面上。為此要求在光纖上鍍上一層化學惰性金屬鍍層，如鎳，銀等。考慮到光纖內信號傳導中的倏逝場(Evanescent Wave)與光纖的強度和韌性等問題，這種金屬鍍層的厚度至少應有1微米。它的形成工藝一般是通過蒸鍍或化學鍍的方法將鎳沉積在裸光纖上，通過這種方法可以在光纖表面形成一層厚度均一的約0.6～2微米厚的鍍層。鎳等磁性金屬鍍層的形成將為以后光纖的磁性操作提供方便。另外，在化學蝕刻過程中，采用氟氫酸系列蝕刻劑對銀等金屬呈惰性而可以有效地對石英或玻璃質的光纖纖芯進行蝕刻，從而利于形成我們所需要的凹面。比較蒸鍍和化學鍍，化學鍍法相比而言具有所需要的設備簡單，成本底，鍍層均勻致密等優點，所以我們傾向于采用化學鍍。在光纖上鍍金屬鍍列室大體可以分以下幾個步驟1.化學預鍍銀化學預鍍銀的目的是為了在玻璃或石英光纖的表面形成一層很薄的銀鍍層，這層銀表面可以作為化學鍍鎳的表面催化劑，從而有利于化學鍍鎳。化學預鍍銀過程中所使用的硝酸銀溶液較稀，配方如下AgNO38g/l； NH3·H2O(25％) 適量；酒石酸鉀鈉KNaC4H4C6·4H2O 10g/l；溫度 10～20℃，時間10分鐘配置時，先將硝酸銀溶解于水，不斷攪拌并加入氨水，生成沉淀后再不斷加入氨水直到沉淀完全溶解，然后在加入已溶于水的還原劑。
2.化學鍍鎳堿性化學鍍鎳的組成和工藝條件如下NiSO4·7H2O 25(g/l)； NaH2PO4·H2O25(g/l)；Na4P2O7·10H2O 50(g/l)； pH10～11；溫度65～75℃； 沉積速度 15微米/小時；鍍列室中含磷量～5％(鍍層略具磁性)3.化學鍍銀化學鍍銀的主要目的是為了在化學鍍鎳的表面上再覆蓋一層化學惰性保護列室，已經受得住以后的酸堿高溫等處理過程。化學鍍銀的基本步驟和上述過程相同，只是硝酸銀和酒石酸鈉的濃度增大AgNO320g/l； NH3·H2O(25％) 適量；酒石酸鉀鈉 KNaC4H4C6·4H2O 100g/l；溫度10～20℃，時間 10分鐘注光纖或毛細管上也可以鍍上鐵鋁合金(含鋁9％)以形成剩磁極小的軟磁鍍層從而利于光纖或毛細管的拾取器的操作。
為了進一步減少鄰近光信號的干擾，在信號觸發劑的配方中加入反向散射顯著的Mie散射粒子(Mie scattering particles)。效果顯著的這一類粒子較好來源有聚丙烯酰胺膠體和聚苯乙烯乳膠等，粒子的尺寸一般等于光譜儀可見光波長的大小。
二、對于固定細胞的毛細管基芯片，由于細胞的尺寸本身要比生物大分子大得多，在幾十個微米左右，所以細胞芯片的密度只能做到5000/平方厘米。各種細胞被固定在玻璃毛細管內表面并制作成芯片以后，其在檢測方面與光纖基芯片的檢測原理相似，區別在于與CCD感光硅芯片精確對準的信號導引光纖束不再需要與毛細管基芯片進行精確對準。因為前二者的單元尺寸與后者的相比要小的多。另一個區別就是在檢測中毛細管基芯片與觸發劑的接觸方式不是使觸發劑流經芯片表面，而是使觸發劑穿透它。
數據處理系統適應科研用制冷CCD量化的二維定位檢測的數據處理軟件目前已可以從因特網上得到，但是這些軟件一般都是用于圖象處理。我們具體需要的是開發出高密度芯片檢測需要的系統軟件。這些軟件應能夠建立起CCD檢測得到的圖象上的每一個點與其所代表的有關生物或化學的具體的信息內容。顯然建立這樣的一一對應關系(基因文庫或蛋白質文庫-隨著蛋白組研究的不斷深入將要建立的話-中每一個基因或蛋白質的具體的特性內容與CCD檢測到的每個點的亮度和位置對應起來)的軟件在理論上并沒有大的技術性難關，需要的只是工作量。
注由于光纖或毛細管的導光性質，由這種材質制成的芯片同樣適用于對于其上以其它方式發生的可見光或熒光等的檢測。比如通過在芯片一側用激光等方式激發，而產生的熒光可以從另一側用CCD進行檢測。這在技術上是十分容易做到的。
全自動雜交及系統整合為了實現芯片應用的快速高效，重復性好和精確性高，并使用戶使用簡便易學，將芯片檢測和雜交等的各主要操作實現自動化完全是必要的。一個適合于上述FB-cDNA芯片的全自動雜交系統如圖5所示包括以下兒個系統1.空載芯片和雜交芯片的循環傳輸系統，包括芯片盒(chip cartridges)，運送軌道(tracksor belts)及相關的精確定位和傳動系統；2.自動溫度調制系統包括檢測后芯片的變性溫度控制，雜交溫育系統溫度控制；3.流體給排系統包括檢測時觸發劑原位注射，變性液清洗，空載芯片雜交液給排。
系統整合是將自動化雜交系統和信號檢測及數據處理系統整合成一個完整的體系，實現由一個終端控制。
實施例一cDNA芯片的制作及應用目前已經知道人類基因組共有十萬個表達基因，這些可以表達的結構性功能基因決定著人類的生老病死等諸多有關每個人生理特征的方方面面。
(1)從生物學上講，這些基因的活動直接決定著涉及到生物學研究的諸多方面，考察基因的調控成為研究工作的極其重要的手段。
(2)在醫學上，現代研究結果表明，不僅僅是遺傳病，癌癥，愛滋病，人類的絕大多數疾病都直接或間接地與基因有關。而且許多疑難病癥如糖尿病，紅斑狼瘡，牛皮癬等都往往涉及到諸多基因，稱多基因病。高密度基因芯片將為分子醫學研究從總體上綜合分析和考察這些大病和疑難病提供大量確鑿和全面的基因根據。另外了解與基因相關的遺傳病對于優生優育提高全民族人口素質有著迫切的需要。而高密度基因芯片就可以提供一個簡便而全面的遺傳病學上的婚前檢查根據。
(3)在法學上，目前已經知道人類的個體特異性是由大約500種等位基因的多態性決定。也就是說，根據一個人的這些基因就可以推測出該人的長相及體格特征。這無疑為人們提供了一條更具直觀性和全面的法學身份鑒定的新途徑。而cDNA芯片正可以作為一種方便的分析系統。
(4)在制藥領域及藥理學研究方面，為了了解一種藥物化合物結構的具體作用特征，研究工作者不得不對表達基因進行大規模測序，以了解具體的基因表達譜特征。
國外很多大型制藥廠每天都將巨額的資金和人力投入到簡單而枯燥的基因測序。這種測序方法不僅投資巨大而且還很慢。最急需高密度基因芯片的，同時高密度基因芯片能夠帶來最大效益的莫過于這個領域。
如果能夠將所有這些基因信息都存儲在一個平方厘米見方的基因芯片上必將為相關的各個領域提供極大的方便。事實上，光纖基芯片不僅能將人類十萬個基因信息全息地存儲在1平方厘米見方的芯片上，還能夠對它們進行定量檢測。這將為生物學，醫學和制藥領域研究人類基因表達譜提供一個全息，高效，量化，廉價的策略性人類基因檢測工具。I--cDNA芯片的制作首先將一束石英或玻璃光纖(在纖芯上具有一層金屬或其它順磁性反光鍍層，如鎳等鍍層)裁剪成等長光纖束，然后將兩端拋光。所有用來制作芯片的光纖經裁剪，拋光后都必須具有均一的長度，端面光潔度和垂直于纖芯的端面(所依賴的光纖處理技術在涉及到光纖生產的各個領域里業已發展成熟，這里不再述及)。這些光潔的端面將用來直接或間接地固定cDNA分子。下面將著三種方法分別予以闡述一，硅基化法固定cDNA分子通過將玻璃表面硅烷化或其它表面處理的直接固定長鏈核苷酸的方法已在玻璃基因芯片技術中得以采用，這種技術顯然也適用于制作以石英或玻璃為材質的光纖或毛細管芯片。迄今為止，已發展出根據不同需要將有機分子共價連接到玻璃表面的烷基化方法，大致可以分為氣相和液相兩類。下面將液相法的主要過程闡述如下(1)預處理首先將光纖束(具有鍍銀惰性保護層)裁剪整齊，兩端研磨，拋光，浸入氟氫酸和鹽酸腐蝕液中刻蝕，掌握時間和溫度條件，可以在光纖的兩端腐蝕出兩個凹面(也可以僅在一個端面上形成凹面)。凹面的深度依目標分子的大小來確定。
(2)將光纖放入鉻酸中浸泡一小時，再用6M鹽酸清洗24小時。最后再用大量的水進行沖洗。
(3)用100毫升10％的已用磷酸調至pH3.5的GOPS((3-甘油醇丙氧基)-三甲基氧基-硅烷，96％)處理上述光纖，將混合物加熱到90度2小時。然后，光纖再分別用100毫升的水，無水丙酮和無水乙醚依次沖洗一次，過夜涼干。
(4)然后用可溶性碳二亞胺(carbodiimide，CDI)縮水法將鏈親和素(SA)直接將鏈親和素連接到玻璃或石英光纖的凹面上。
(5)也可以活化連接到石英或玻璃表面的GOPS。即，將光纖用50毫升的無水丙酮沖洗三次，將光纖轉移到干凈，干燥的容器內。再向容器內加入毫升無水丙酮和0.70毫升的無水吡啶。輕輕攪拌溶液同時緩慢加入200微升的tresyl chloride.然后將反應混合物溫度控制在零度25分鐘，再將光纖依次用100毫升體積配比為30/70，50/50，70/30(丙酮-5mM HCl)的溶液和100毫升的1mM HCl沖洗一次。
(6)將0.1毫升的SA溶液(～1毫克/毫升)放入一個小的玻璃試管中，再在其中加9.90毫升0.10M pH6.0的堿金素磷酸鹽緩沖液(PBS)，25毫升EDTA，6mM DDT(dithiothreitol)。
接著沖氮氣2小時。此后SA被固定到玻璃或石英表面上。用0.1M pH7.4的PBS和0.1M磷酸反復清洗光纖表面。這樣可以清除未牢固連接的蛋白質。再用1mM TRIS緩沖液(pH8.2)清洗一邊。
二，氣相硅烷化法固定cDNA分子氣相硅烷化法在石英或玻璃表面固定生物大分子化合物速度相對較慢，但是蛋白在基質表面分布均勻而且稠密，因此是比較好的一種方法。程序如下(1)將預處理的光纖用NH4OH-H2O2-H2O(1∶1∶5)的溶液在80度溫度下洗滌5分鐘，再用配比為HCl-H2O2-H2O(1∶1∶5)的溶液在80度溫度下洗滌5分鐘，最后再在雙蒸水中徹底清洗一次。這種處理方法使得玻璃表面更加親水性。
(2)用氮氣流將上述光纖吹干，并立即轉入一圓底燒瓶。硅烷被放入一個放有冰水混合物攝氏零度的杜瓦瓶里。緩慢升高該瓶的溫度使其中的3-((2-胺基乙基)胺基-)丙基)三甲氧硅烷(Union.Carbide，USA)蒸出，此時將系統抽真空使硅烷緩慢地從杜瓦瓶中進入圓底燒瓶再引出，過程持續24小時。當硅烷的真空蒸餾溫度達到160度時，再蒸餾12小時。之后可以將系統冷卻到室溫，硅烷化的光纖放入乙醇中待用。
(3)上述硅烷化引入的胺基可以通過碳二亞胺為耦聯劑用以共價連接一些生物大分子。
這種合成方法是首先在表面上引入一個保護巰基，然后通過巰基-二硫鍵置換反應將蛋白質連接到表面上去。交換反應使用雙功能試劑N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。這種固定法消除了分子交聯和共聚問題從而產生一致密單分子層。
(4)通過上述各種方法獲得的固定在光纖端面的SA單分子層膜與過量的末端生物素化的cDNA分子--B-cDNA溶液進行親和反應生成耦聯到光纖端面上的cDNA分子。
cDNA末端生物素化的方法見方法四一核酸的末端生物素化法。
(3)’上述第(2)步由硅烷化法引入的胺基也可以通過戊二醛法將3’端或5’端具有引入胺基的cDNA片段直接連接到石英或玻璃表面。例如在3’端引入胺基的方法如下
在30ml吡啶的15mmol1，3-丙二醇中在15分鐘內逐滴加入4，4-’氯化二甲氧基三苯甲基溶液13mmol，攪拌3小時；
之后加5％的NaHCO3水溶液60毫升；用二氯甲烷(50ml×2)，分別用水及無水硫酸鈉洗滌有機相；
用旋轉蒸發器蒸發溶劑，獲取油狀殘余，并將之過硅膠柱，之后用二氯甲烷洗脫，得黃色油狀終產物1-O-二甲氧基三苯甲基-1，3-丙二醇，HO-(CH2)-O-DMT)；
將10克烷胺基控制多孔玻璃珠(LCAA-CPG)放入裝有50毫升吡啶的容量瓶中，在其中加入2mmol琥珀酸，4-二甲基胺基吡啶(3.3mol)，加蓋，搖晃16～20小時；
用漏斗過濾CPG，再分別用吡啶，二氯甲烷和乙醚清洗；
在真空下干燥長鏈烷胺基-丙酮酸-CPG(LCAAP-CPG)，并將干燥物放入15毫升的吡啶再加入HO-(CH2)-O-DMT 0.5mmol，0.1mmol 4-二甲基胺基吡啶，80微升三乙胺，和二乙基碳二亞胺2mmol。搖晃24小時，加入0.5mmol五氯苯酚，振蕩過夜；
過濾CPG，分別用吡啶，二氯甲烷和乙醚清洗之，并放入容量瓶中；
在容量瓶中10毫升哌啶，搖晃6小時，再用二氯甲烷洗滌，再經真空干燥得3’端胺基化的cDNA片段；
加入適量濃度的戊二醛反應；
將端面引入胺基的光纖或毛細管浸入反應混合液，振蕩24小時取出。最后脫去CPG，再用二次蒸餾水清洗多次。三，光纖-磁珠耦聯法固定cDNA分子為了進一步增大芯片的有效表面積，這里重點介紹一種間接固定cDNA分子的方法，即光纖-磁珠耦聯法。這種方法首先是在纖芯端面上形成一SA涂層，然后用以直鏈烷烴連接起來的雙生物素與固定在纖芯端面上的SA進行親和反應形成雙生物素-親和素-光纖復合體。使用雙生物素的目的是為了將光纖和磁珠耦聯起來。為此，用來與SA親和的雙生物素必須滿足一定的條件，如起連接作用的直鏈烷烴的亞甲基數目最好為9或10個，因為過長或過短都會影響連接效率。這種雙生物素-親和素-光纖復合體與過量的SA包被的光學磁珠進行親和反應，生成光纖-磁珠復合體。對未結合的磁珠經簡單的沖洗分離后，純化的光纖-磁珠復合體與生物素化的cDNA分子進行親和反應形成光纖-磁珠-cDNA復合體。這種光纖-磁珠-cDNA復合體就是構成cDNA芯片的基本要素。它們以光纖的形式存在。用上述方法以各種不同的cDNA目標分子可以制作不同的光纖-磁珠-cDNA復合體，把它們分類集中存放從而可以構建光纖-磁珠-cDNA文庫。制作cDNA芯片時，先將光纖-磁珠-cDNA裝入光纖排列器中，由光纖排列器按既定的順序將光纖-磁珠-cDNA平行排列，排列好的光纖-磁珠-cDNA再經光纖拼裝器排列成FB-cDNA方陣(FB-cDNA array)。
這些FB-cDNA方陣經過裁剪形成3～5厘米厚，1平方厘米見方的薄片，再將裁剪形成的薄片新端面拋光，這樣就形成了FB-cDNA芯片(FB-cDNA chips)。
四，核酸的末端生物素或地高辛化法后合成衍生法(postsynthetic derivatization)是對從天然生物或酶法合成得到的核酸進行修飾的唯一方法。通常情況下3’-和5’-末端衍生修飾基團在與互補序列雜交中相當有利，而鏈內衍生修飾基團卻往往干擾雜交。這種末端衍生法可以分為以下幾步反應(1)核酸3’-或5’-伯氨基的合成10微升(0.005～5A260U)長鏈核酸在室溫下與5微升1.5M CDI(水溶性碳二亞胺，如1-乙基-3，3-二甲基-胺基丙基碳二亞胺)和10微升0.5M 1-甲基咪唑，pH7.2的溶液反應1小時后盡快通過凝膠過濾的方法從反應體系中除去，生成化合物IIIA，該化合物進一步在50攝氏度的0.2～0.4M的胺NH2(CH2)nNH2中反應2～4小時即生成末端帶有自由伯胺基的核酸。
(2)生成5’-或3’-生物素化的核酸上述(0.01～10A260U)氨基末端核酸與過量(1mg)的NHS-生物素(N-羥基-琥珀酰胺基生物素)在0.2ml的0.2M HEPES緩沖溶液(pH8.0)中(振蕩)反應1小時生成5’-或3’-生物素化的核酸。過量未反應的生物素用離心法除去，而5’-或3’-生物素化核酸用HPLC或凝膠電泳方法分離純化。
(3)生成5’-或3’-地高辛化的核酸反應(1)的產物直接用于地高辛化的反應。在反應體系0.2ml 0.2M HEPES緩沖液(pH8.0)中，(0.01～10A260U)氨基末端核酸與過量(～1.2mg)地高辛琥珀酸酯室溫反應1小時，用HPLC進行產物分離，純化。
五，直接共價固定法由第四(1)步生成的末端帶有自由伯胺基的核酸可以用戊二醛法直接結合到表面具有游離胺基的經硅烷化的石英或玻璃表面上，具體步驟參見I二(3)。
六，酶法加尾標記程序
加尾反應在20微升裝有0.2M potassium cacodylate，25mM Tris-HCl(pH6.6)，0.25g/l牛血清白蛋白，5mM CoCl2，0.5mM dATP，50μM Dig-dUTP，25U末端轉移酶和100pmol的探針分子mRNA。在1小時37度的溫浴后，加尾探針用分子大小色譜的Nap-5(Sephadex G-25柱，Pharmacia，Montreal，PQ，Canada)柱純化兩次，探針分子的最終濃度為60nM。這種方法同樣可以合成地高辛加尾的DNA探針。
目前加尾探針標記法已經商業化對于大多數對有機合成不很熟悉的生物工作者可以直接購買相關的試劑盒，只要精確地按照商家的指示去做一般都可以很好地標記。II--信號標記用于與芯片上的目標分子結合并顯示與之結合的標記方法因情況而異，種類繁多，各有千秋，而且都已十分成熟，這里不在贅述。可以說，像熒光標記，酶聯放大標記法，如堿性磷酸酶放大系統，和化學發光標記等，這些方法都已達到了非常靈敏的程度，基本上可以滿足高密度芯片的檢測的要求。這里僅介紹一種生物標記法。有別于同位素標記等上述方法，這里選擇的生物發光體系兼具上述體系的許多優點，如高靈敏度，高效率(快速)的發光特性(該特性決定了它具有比同位素標記和酶聯放大法更低的檢測極限和更高的檢測效率)，可以長期常溫儲存，安全無毒害(無放射性污染，無毒，無致癌性，為生產，儲運和使用帶來方便)。而且這里還引用了一種特殊的放大方法，使這種方法可望檢測到單個分子。這種生物發光體系就是水母發光蛋白(aequorin)體系。在發光蛋白中，具有類似發光效率的還有水蛭發光蛋白(obellin)等。水母發光蛋白的發光反應如圖3所示。
發光蛋白的發光反應都是以鈣離子為觸發劑，如圖3所示，水母發光蛋白從脫輔基水母發光蛋白(apo-aequorin，簡寫為Apo-aeq)開始。先后分別與蟲熒光素(luciferin)和分子氧結合形成水母發光蛋白，之后與鈣離子逐步結合形成生物發光分子。現在已經通過基因工程技術產生出可以在大腸桿菌或真核細菌中大量表達的量子效率更高的Apo-aeq cDNA載體。無論是野生的還是重組的脫輔基水母發光蛋白都有很高的熱穩定性，可以長期儲存，因此為生產和儲運帶來方便。
脫輔基水母發光蛋白的標記采用地高辛-抗地高辛抗體的親和反應。地高辛是一種心血管藥物，標記用量的地高辛是無毒的。使用地高辛的好處是人體和其它動植物組織不存在這種相關抗原，所以，抗地高辛抗體抗體檢測時不會發生非特異性結合問題，當然也不會發生與生物素-親和素的交叉反應。這樣也就可以大幅度提高信噪比。用于與高密度FB-cDNA芯片雜交的mRNA分子不采用PCR標記法，因為它遠遠不能滿足待測樣品中分子種類龐大的分析要求，縱使采用最近發展起來的多重PCR(multi-PCR)技術。這里采用加尾式標記方法，即，將從組織中提純的mRNA，甚至是總量RNA末端通過直接的方式統統加上生物發光分子構成分子探針。
關于構筑分子探針，我們遵循在不影響雜交特異性的前提下盡量提高雜交效率。根據對非同位素標記的膜雜交和檢測研究報道，僅含有20～30個單體的寡聚核苷酸探針雜交的特異性與有幾千個堿基的長鏈核酸的雜交特異性實際上是一樣的，而雜交的效率卻高得多，一般可以在即分鐘內內完成。而幾千個堿基的核酸的雜交卻需要幾個小時。因此我們傾向于構筑由內切酶酶切的短寡聚核苷酸為探針去與長鏈cDNA目標分子雜交。即將總RNA或mRNA用RNA內切酶酶切，再將酶切產物用過量的活化地高辛以末端標記法(見上述方法I-四-(3))全部標記。反應產物直接用以雜交。
不具有信號放大作用的標記方法常規是直接將信號分子連接到分子探針上，如將熒光分子，化學發光分子，酶分子等直接于核酸連接。這里不作為介紹重點。
具有信號放大作用的生成分子探針的方法可分為如下幾個步驟一，光學磁珠的信號放大作用將抗地高辛抗體和脫輔基水母發光蛋白按一定比例共價地連接到光學磁珠上去。使用光學磁珠是為了大幅度地進行信號放大，因為現在已經可以找到方法在一個直徑僅1微米的光學磁珠上固定大約1000～10000個蛋白質分子，通過這一步，我們就可以將信號放大3～4個數量級。下面介紹往羧基化的磁珠(carboxylated superparamagnetic microspheres，CSM)上結合抗地高辛抗體和脫輔基水母發光蛋白的方法和操作過程。所使用的羧基化磁珠已有商品出售(0.8微米，10％w/w懸浮液，Bangs laboratories，Carmel，IN，USA)。共價結合的原理是通過可溶性碳二亞胺反應。由于脫輔基水母發光蛋白極易與鈣離子結合，又由于高密度基因芯片要求高度靈敏的檢測，因此，實驗過程中涉及到與脫輔基水母發光蛋白接觸的任何儀器和試劑都必須是高度無鈣的，因為這直接影響到檢測的靈敏度。實驗中所使用的所有玻璃器皿都必須是無鈣玻璃制品，而且在使用前必須經過鈣離子絡合劑-洗液多次清洗。洗液配方如下50mM Tris，0.15M NaCl，2mM EDTA，0.05％(v/v)Tween-20，pH7.5.操作程序如下1.用1ml 0.1M NaHCO3，2mM EDTA，pH8.0(耦合緩沖液)洗滌羧基化磁珠以去除其表面的表面活性劑；2..用一個磁性分離盤將懸浮液分相，并棄去液相；3..重復三次上述操作；用上述洗液洗滌羧基化磁珠，重復三次；4..將羧基化磁珠重新懸浮在耦合緩沖液中，然后將100微升的上述懸浮液移入試管中；5.在試管中加100微升1-乙基-3-(二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDAC[1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺](Sigma公司生產))，振蕩，同時加入1毫升0.002mg/ml的抗地高辛抗體和8mg/ml脫輔基水母發光蛋白(兩種蛋白的相對配比需要通過實驗摸索出一個最佳值以得到最大的放大倍數)到耦合緩沖液中；(1)擺動溫育2小時；(2)分相，棄上清液，將結合有抗地高辛抗體抗體和脫輔基水母發光蛋白的羧基化磁珠(anti-digoxigenin-conjugated CSMs，AD-CSMs)用1毫升緩沖液清洗2次，并將其重新懸浮于1毫升緩沖液中待用。(3)可以通過1000倍以上的光學顯微鏡或電子顯微鏡直接觀察經過雙染色處理的脫輔基水母發光蛋白和抗地高辛在羧基化磁珠上連接的密度和均勻分布情況。或將其用熒光染料或熒光素標記在熒光顯微鏡下觀察也可以達到同樣的目的。其它的光學檢測方法如酶聯放大法來標記抗地高辛抗體和脫輔基水母發光蛋白以檢測二者在羧基化磁珠上結合量，分布情況等，從而有利于找到最佳的耦聯條件。6.通過免疫反應將DIG-mRNA分子耦聯到羧基化磁珠上去生成mRNA耦聯羧基化磁珠。耦聯與未耦聯DIG-mRNA的羧基化磁珠不用分離純化可以直接用于雜交，雜交后通過清洗即可將未耦聯的羧基化磁珠去除。7.用標記有脫輔基水母發光蛋白的地高辛與上述mRNA耦聯羧基化磁珠親和反應生成mRNA-羧基化磁珠耦聯脫輔基水母發光蛋白，簡寫為AB-mRNA)。二，微玻璃珠的信號放大作用由于光學磁珠的不透明性，在光信號足夠強時，其將無法再維持應有的線性關系，信號強度將達到飽和。因此，為了增大測量線性范圍，可以采用透明的微玻璃珠(silicabeads，φ0.2μm)。在微玻璃珠上烷基化固定生物大分子等方法與往玻璃或石英光纖端面上固定生物大分子的程序相同，這里不再述及。III一雜交，變性再生及生物發光檢測總程序一，雜交固定于玻璃表面上的RNA預雜交，雜交(Northern雜交)及淋洗等條件，與DNA雜交(Southern雜交)的條件基本相同。雜交中使用的試劑配制，配方及程序如下1.配制預雜交液每個芯片(面積1cm2)約需預雜交液0.2ml.用0.45μl的一次性乙酸纖維素膜(Schleicher&Schuell單流式針筒型濾膜(Uniflow syringe flter)No.57204或與之相當的產品)過濾雜交液。
50×Denhardt試劑5克聚蔗糖(Ficoll，400型；Pharmacia)，5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白(Sigma)，加水至終體積500ml。
預雜交液0.5％SDS，5×Denhardt試劑，100μg/ml經變性并被打斷的鮭精DNA，6℃水浴中溫育1～2小時或6×SSPE2.將芯片浸于一盤6×SSC或6×SSPE中完全濕潤，浸泡2分鐘。
3.將潤濕的芯片裝入可加熱封接的袋如Sears Seal-A-Meal等中，按每個芯片0.2ml的量加入預雜交液。將袋內空氣排出，封袋，浸入68℃水浴中溫育1～2小時。
4.從水浴中取出雜交袋，剪開一角，加入0.1ml 2mM EDTA，混合均勻，再加入0.5mlAB-mRNA溶液，盡快排除空氣，封袋，浸入68℃水浴中雜交20分鐘左右(具體雜交時間可根據探針半復性時間公式計算)。
5.取出雜交袋，剪開一角，傾倒雜交液于棄置的容器內，取出芯片并置入盛有數百毫升2×SSC和0.01SDS托盤中，于室溫溫育1～2分鐘。二，生物發光檢測由于脫輔基水母發光蛋白始終要求無鈣環境下存在，因此在施加發光觸發劑之前必須對芯片用2mM EDTA溶液充分清洗。發光觸發劑配方為100mMCaCl2，100mM Tris-HCl，pH7.5，Mie散射粒子膠體(濃度依情況而定)。發光觸發劑加入后用CCD進行光量子積分3秒鐘即可。三，雜交芯片的再生雜交后的芯片100度水浴中加熱使其變性，迅速在冰浴中將芯片驟冷。此時芯片可以進入心新一輪的循環使用。注本實施例所提供的cDNA芯片制作及應用技術在基因芯片中具有代表性，其它如DNA芯片，cRNA芯片等無論核酸鏈的長短，基本原理一樣，技術環節也大同小異，不作贅述。
實施例二免疫(蛋白)芯片的制作及應用隨著科學的發展，現在免疫分析已成為一種簡單快速，靈敏可靠而且經濟的醫學臨床診斷手段。目前免疫檢測的范圍已經非常廣泛，除了傳統的抗體，抗原，激素，生長因子，蛋白質，多肽，核酸，神經遞質等生物活性物質之外，還有細胞表面標志物，腫瘤特異性抗原，受體，細胞因子，體內藥物濃度及傳染源等各種微量物質。但是在醫療實踐中美中不足的是，醫生為了確診(比如對于肝炎病人)有時不得不讓病人對幾個指標(亞型)進行逐一檢測，以排除其它的可能性。對于一些疑難病例的診斷和治療效果的隨訪中又需要對大量的指標進行綜合的考察和評價。然而這些全面的指標的獲取往往不得不以醫務人員和病人的大量時間，勞動量和資金為代價。如果能夠制作出包含大量免疫學檢測信息的免疫芯片從而僅僅通過一次性檢測即可提供一系列全面的免疫學檢測清單對于醫務人員而言無疑為他們提供了一個進行確診所需要的綜合考察的最佳手段，對于病人而言也是一種省事省錢的好方法。由此可見，免疫芯片的制作在以下幾方面有著非常現實的意義一，在確定某一病的亞型的并行檢查中使用可以大大提高診斷效率；二，在診斷疑難病情中可以為醫生提供一個確診的全面而確鑿的根據；三，如果同時地綜合檢測各種腫瘤標志物，腫瘤抗原如αFP，CEA，CA50，CA19-9，CA125等，再輔以其它檢查對于腫瘤的早期診斷從而為腫瘤的早期發現，及早治療，延長病人生命和根治提供了一個重要途徑。
四，在例行性身體檢查中可以提供一個綜合的健康狀況的指標清單。
另外，隨著蛋白組學研究的不斷深入，蛋白芯片的出現將為之提供一個大通量掃描的分析工具，因而也就具有廣闊的應用前景。I--免疫芯片的制作(蛋白芯片的制作及標記程序類似)由于免疫芯片在一定程度上是制作基因芯片的基礎，因此相對言較為容易。首先也是光纖的硅烷化。然后可以用戊二醛法將帶有大量賴氨酸殘基的免疫配體與通過石英等表面產生的烷胺基將免疫配體連接到固體表面上。除此以外，這里再介紹一種可再生性免疫芯片的制作方法。這種芯片的優點是顯而易見的，即它可以重復多次使用(在免疫表面顯著失活之前可以回收利用多達50次)，從而大大降低檢測成本。
可再生性免疫芯片的工作原理可以以在石英光纖端面固定熒光標記的抗人血清白蛋白抗體F(ab’)片段作為一個例子來說明。其它配體的固定等方法可以依次類推或尋找相應的方法。檢測時，如果樣品中存在人血清白蛋白它就會結合到光纖表面。這種熒光標記可以通過激光激發產生熒光再用CCD檢測熒光信號。之后免疫芯片可以通過簡單地浸入Chaotropic media中而得以再生。在這種情況下，抗原抗體復合物將被選擇性地分開而不影響芯片上生物標記物的活性。其操作程序如下一，抗人血清白蛋白抗體F(ab’)片段在光纖表面的固定及標記(1)清洗石英端面。用HF清洗10分鐘，浸入鉻酸溶液中1小時，再用6M HCl洗滌24小時，最后用大量的水沖洗。
(2)合成硅基化基底。將光纖用100毫升10％GOPS((3-縮水甘油丙氧基)-三甲氧基-硅烷，96％，Aldrich，Milwaukee，WI)并磷酸緩沖液調至Ph3.5，加熱至90度2小時并輕微振動。之后光纖分別用100毫升的水，無水丙酮，無水乙醚淋洗，過夜放置。
(3)GOPS活化。先用50毫升無水丙酮淋洗，加幾毫升的無水丙酮和0.70ml吡啶。
邊緩慢旋轉容器邊緩慢加入200微升tresyl chloride。將反應混合物保持在0度25分鐘，再用以下100毫升溶液依次洗滌光纖30/70，50/50，70/30(丙酮-5mMHCl(v/v))和1mM HCl。
(4)抗人血清白蛋白抗體F(ab’)片段的耦合。首先從完整的F(ab’)2中制備F(ab’)。即將0.10ml F(ab’)2溶液(約1mg/m總蛋白)放入一個小的玻璃容器中。加入19.90ml的由0.10M pH6.0 PBS，25mM EDTA，和6mM二硫代threitol組成的溶液。鼓N22個小時以混勻溶液。這時形成F(ab’)2的二硫鍵被還原而形成F(ab’)，并通過24h透析500ml的0.10M pH為6.0的含有25mM EDTA的PBS來分離之。整個溶液通過2小時鼓氮氣來凈化同時F(ab’)被立即固化在光纖表面，封好，并在4度放置24小時。之后將之反復用0.1M pH為7.4的PBS和0.1M的磷酸洗滌。這樣可以清除未固化或非特異性吸附的抗體。之后再用1mM的TRIS(pH8.2)緩沖液失活未反應的tresyl基團。
(5)熒光標記F(ab’)。首先將光纖用含有0.10mg/ml的HAS平衡。其目的是為了在標記之前保護F(ab’)的活性部位。之后用PBS(pH8.5)淋洗并轉移至0.1uM的pH為8.5的dansyl chloride的溶液中。之后取出反復用PBS和磷酸緩沖液淋洗以去除HAS之后存放在4度的PBS中。二，免疫表面固定效果的鑒定可以使用FITC標記的HAS滴定實驗兩個技術來獨立地檢測上述固定和標記程序中的每一步。光線端面的活性F(ab’)可用以知濃度的FITC-HAS的滴定。
注意直接在F(ab’)進行熒光標記十分有利于固定效果的檢測，它也僅僅用于尋找最佳固定條件，在確定了這個最佳條件之后我們并不采用這種方法進行免疫臨床分析。I-配體標記把大量的不同種類的抗體或抗原固定到光纖表面之后只有用一個通用的探針去檢測特異性結合情況對于免疫芯片來說才是可行的。在這個原則下可以選擇的方法仍然是很多的。這里僅推薦一種免疫結合和標記方式，即配體的生物素化，熒光標記法和酶偶聯法。
這種方法首先是讓抗原與固定的抗體片段結合，然后用生物素化的第二抗體作為報告分子與抗原-抗體復合物結合，再用鏈親和素與生物素發生親和反應，最后用通用的生物素化的標記分子與結合了的鏈親和素結合(注意鏈親和素在這里的放大作用)。最后或顯色或激發熒光或觸發生物或化學發光進行檢測。所以，這種方法需要對蛋白如抗體，抗原或酶分別進行生物素化。由于采用了非競爭法結合，因而該法檢測的靈敏度與線性范圍方面都都比競爭性結合有大大的提高。
這里提供一種廣泛適用的蛋白質生物素化方法，以根據需要分別對抗體，抗原和酶進行生物素化。這種方法是基于通常情況下蛋白質表面具有很多賴氨酸殘基，而且這些殘基又不參與結合反應，所以通過它們進行標記對生物活性影響極少。這種方法使用BNHS與蛋白質的賴氨酸偶聯。以制備生物素化抗體IgG(生物素化抗原的制備方法與此相同，只是要確定最佳BNHS用量)為例，其程序如下1.將2毫克純IgG溶解在0.1M的NaHCO3溶液里，在4度透析，過夜存放；2.在上述溶液中加10ul，0.1M的BNHS溶液(該溶液是用1mg的BNHS溶解在30ul的DMSO或DMF中制備而成)。在室溫下放置1h；3.用0.01M的PBS緩沖液(pH7.4)透析，過夜。加等體積的甘油后4度最好在零下20度存放。使用前用緩沖液稀釋。
被生物素化的特異性第二抗體在溫育前可以一同加入，也可以事先進行混合作成試劑盒與免疫芯片進行溫育。生物素化的通用標記物可以是熒光分子，也可以是ELISA中的酶如AP，HRP等，也可以是生物或化學發光的酶或化學分子。但無論是那一種方法，都適用于光纖基芯片的檢測。在這個方面從方法上講都已相當成熟，不作贅述。
實施例三細胞(受體)芯片的制作及應用激素，抗原，藥物，毒素和神經遞質等一系列廣譜的物質(配體)對于生物體的作用首先是從細胞受體開始的。主要從事激素和藥物作用原理的受體學的研究對于神經生理學，酶學，藥理學，病理學和細胞生物學等各學科都有著十分重要的意義。然而在研究受體實踐中卻面臨著受體含量少，很多受體作為細胞膜的組成成分在分離后因高級結構的破壞極易失去原有生理和藥理活性等困難。在分析品種繁多的配體和受體相互作用時，用常規的分析方法簡直無異于大海撈針。我們需要一種可以大規模篩選以建立各種配體和受體之間的關系網，從而為進一步研究或統計提供依據。創建細胞芯片—將各種特征細胞(各種組織細胞，正常細胞和病理細胞，細菌等)或表現不同特性的同一類細胞(用同一種細胞通過基因工程技術表達不同受體或細胞內結構蛋白)集成地固定在毛細管內壁上并拼裝成芯片。分析時將被報告分子標記的感興趣的物質與細胞芯片進行結合，通過檢測可以大范圍地篩選并建立這種聯系網。這對于具有特殊功能基團的藥物篩選或發現新藥物有著重要意義。I—細胞芯片的制作細胞芯片的制作主要是將細胞固定在毛細管的內壁上，其它諸如芯片拼裝皆與光纖基芯片相同，只是相應地將拼裝器的各有關尺寸作一些調整。細胞固定可以分以下幾個過程一，毛細管的預處理首先將毛細管束兩端燒結進行如前所述為光纖進行鍍鎳銀鍍列室的程序進行化學鍍，然后將兩端燒結部分裁剪，在研磨拋光之后進行內壁的處理。
二，毛細管內壁硅烷化可以采取上述氣相硅烷化法通過在玻璃或石英表面上引入烷胺基，然后可以用下述方法將蛋白如鏈親和素固定到內壁上1.使用戊二醛作為偶聯劑通過蛋白質表面的胺基將之固定上去；2.使用DCI(pH7，在磺基琥珀酰亞胺磺基-NHS存在下)通過縮水反應將蛋白質表面的羧基與胺基連接起來。
上述方法可以產生致密均勻的鏈親和素單分子層，可以直接用于親和反應。II--細胞表面生物素化及其在毛細管內壁的固定一.細胞表面生物素化1-溶液配置(1)PBS/CMPBS溶液中含1.0mM MgCl和1.3mMCaCl2。將Ca2+和Mg2+溶液緩慢加入裝有200毫升5×PBS的，然后用ddH2O稀釋到500毫升的燒杯中，以防金屬離子的沉淀。PBS/CM溶液一定要新鮮配置，盡快使用.(2)磺基-NHS-生物素或磺基-NHS-LC-生物素這些溶液使用前在PBS/CM溶液中的濃度稀釋到0.5mg/ml。(3)在PBS/CM中50mM的NH4Cl溶液。用以在標記反應結束時使過量的生物素失去反應性。再配置50mM NH4Cl的PBS/CM溶液。在48ml的ddH2O中加入0.26g的NH4Cl，1ml的1.3M CaCl2，1ml的1.0M MgCl2。2-生物素化程序下面所有試劑都經冰鎮處理而且所有步驟都在冰上操作。(1)在細胞懸浮液加入加入冰鎮的PBS/CM，然后加入新鮮配制的Sulfo-NHS-B(在PBS/CM中濃度為0.5mg/ml)；(2)在20min的4℃的溫育過程中輕輕晃動容器；(3)重復上步操作；(4)過濾細胞并將之轉移到另外一個燒杯中，換之以1ml的50mM NHCl的PBS/CM溶液以終止反應。在4℃下輕輕搖晃溫育10min；(5)用PBS/CM溶液透析細胞懸浮物兩次；(6)將生物素化細胞在-80℃存放，以使一些蛋白酶處于非活性狀態。
二，細胞在毛細管內壁的固定1-生物素化細胞用Tris-HCl(pH7.5)緩沖液形成懸浮液后，再讓過量的懸浮液緩慢不斷(4℃溫育，持續25min)流經僅約3-5毫米的毛細管束即可；2-用滅菌蒸餾水充分緩慢淋洗毛細管束，放置1小時待用。II—過渡金素活化支持物法細胞固定程序如下將1克酸洗的毛細管中加入3毫升在15％(w/v)的鹽酸溶液中的15％(w/v)TiCl4溶液。在45度的烘箱中將該化合物加熱48小時，以形成過渡金素的氯氧化和物。將該化合物用3×10毫升水洗滌得到過渡金素的水合氧化物。將10毫升2％的細胞懸浮液加入，并在4度保持2小時。將過多的懸浮液除去，并將固態的制備好的細胞固定物用3×10毫升水和10毫升0.01M乙酸鈉緩沖液洗滌。IV--探針標記由于受體的配體的結構多樣化，標記方法也只能根據配體的特征，如果是蛋白質類則上述的一些在蛋白質上連接酶如AP，HRP等方法依然是很好的方法；而如果是簡單有機化合物結構的藥物分子或多肽類激素等的話，可以使用化學發光試劑如丫淀酯AF等。這需要根據這些配體的活性尤其是非活性部位的具體結構特征找出一種較少影響配體生物活性的標記方法，這里不在一一闡述。
實施例四化學(材料)芯片的制作及應用在藥理學研究中往往想知道一個細胞里全部被表達的生物活性物質如蛋白質，糖蛋白，脂蛋白，受體，及酶等，然而對于它們的鑒定卻是一個讓人望而生畏或幾乎不可能做到的事。由于大多數蛋白質都有自己特異性的底物或親和物，而且這些物質往往是一些小分子的化合物(如輔基和輔酶)或配體(如多肽，激素，藥物分子，毒素，生物堿等)。由于相比之下固定這些小分子的方法有時侯不得不多樣化，但一旦這些物質被固定在芯片上形成化學芯片，這種芯片卻具有很多優越于生物大分子芯片的地方，比如在穩定性，保存條件的簡易性(無氧，干燥，避光，陰冷等即可長期保存)，制作成本的低廉性等方面都是生物大分子芯片所無法比擬的。這種芯片的檢測也極其簡易，只需將用于考察的總蛋白質(包括所有經修飾過的蛋白質)一概生物素化并用于與化學芯片親和反應，再用鏈親和素與生物素化的結合物進行親和反應，最后用生物素化的信號標記分子與前面形成的(配體-蛋白質-生物素-鏈親和素)復合物結合形成標記了的(配體-蛋白質-生物素-鏈親和素-生物素-標記分子)復合物，通過觸發信號分子產生信號進行檢測。通過首先分別將已知蛋白質逐種與化學芯片親和建立與芯片上的化學分子或生物小分子發生特異性親和的生物大分子對應關系網。由蛋白質文庫建立與之有特異性結合的化學小分子文庫，再用這些文庫拼裝新的化學芯片。按這種方法組建的化學芯片可以直接應用的領域首先是基因和細胞最終表達產物的廣譜研究和可以建立蛋白質文庫的蛋白組學研究等。
在材料科學研究中，將代表不同性能信息和結構信息的光纖或毛細管根據生命科學中的組合技術拼裝成微方陣并進行并行篩選便可以大大提高材料的合成和優化效率。可以通過離子注入或化學合成的方法使光纖或毛細管具有不同的性能信息和結構信息。
對于像天然或合成藥物，化學小分子，激素，毒素等的標記方法可以利用連接臂將化學分子固化到各種形式(具有烷胺基，羥基等)的硅烷化光纖端面上；蛋白質的固化及其生物素化參看前面有關內容。由于廣泛存在的依賴輔酶的酶無論在合成立體專一性化合物還是在分析應用中都有著廣泛的應用意義，下面介紹一些NADP+，NAD+，ATP，ADP等輔酶的固定方法作為這一方面的一些實例。以NADP+的固定方法為例(其它與此相似)合成NADP+，NAD+，ATP，ADP等輔酶的N6-羧甲基-和N6-((6-胺基己基)-甲氨酰基甲基)的衍生物(a)用碘乙酸(pH6.5)烷基化產生1-烷氧甲基核苷；(b)在過硫酸鹽，pH11，75℃下加熱一小時，之后在乙醛作用下重排產生N6-羧甲基核苷；(c)加入碳二亞胺和二胺基己烷(pH4.0)與1，6-二胺基己烷縮水產生N6-((6-胺基己基)-甲氨酰基甲基)-核苷；(d)在有溴化氰和經硅烷化后具有伯胺基的光纖和毛細管存在下，上述輔酶可被固定在這些載體上。該方法利用二胺基己烷為連接臂與輔酶形成輔酶類似物并固定到固相表面上，從而有利于保持甚至增強依賴輔酶的酶，如葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶，6-磷酸葡萄糖酯脫氫酶，1-谷酰氨酯脫氫酶，甘油激酶等的生物活性。
其它輔酶如FMN，cAMP等也都有相應的固定方法，不一一列舉。
實施例六聯合生物芯片的應用鑒于各種生物芯片各自從不同的角度對生物物質進行檢測從而提供不同側面的信息內容，又由于生物本身的內在聯系十分廣泛，所以由生物芯片從各個不同側面提供的大量綜合性信息必然有助于人們探索更深列室次和更廣泛的信息內容。由此可見芯片分析的聯合使用在科學研究領域里有著潛在而深遠的應用前景。在浩瀚的生命信息的海洋里，它們為人們提供了一套全新的方法學武裝。
就以細胞芯片與化學芯片或基因芯片的聯合使用為例來說明藥理學研究中如何運用這種武器。首先，可以通過細胞芯片篩選出許多僅對某些特異性受體結合的配體，這些配體可以是藥物分子或具有某個功能基團的化合物，激素或毒素等。顯然這些配體有可能成為特異性很強的藥物或者毒物。藥理學家在經篩選并建立起這個一一對應的配體-受體關系網之后還想進一步知道感興趣的每一種業已發現的關系的后效應有哪些。對于這些后效應的考察范圍和深度藥理學家希望盡可能地寬一些和深一些。為了考察哪些基因被調控被誘導而得以表達或被抑制而未被表達，需要運用cDNA芯片對組織中的基因表達譜進行研究。由此可以知道，研究的配體在轉錄列室次上對于生命體產生的綜合效應。這些信息對于判斷一個配體是否適合于作為一個藥物是非常可靠和科學的根據。而要考察配體的最終效應，則可以與化學芯片聯合使用。
說明書


附圖1-1.小室工作原理圖附圖1-2.列室的俯視圖。附圖1-3.列室與起密封和減震作用的橡皮封條(rubber buffer)，起保護作用的剛性護套(holder)的裝配示意圖。附圖1-4.裝配起來的列室與E型軟磁鐵鋁合金磁芯的裝配圖(主視圖)。附圖1-5.E型軟磁鐵鋁合金結構(俯視圖)。附圖2.信號檢測及處理系統示意圖。附圖3.生物發光反應原理圖。
權利要求
1.一種將大量不同生物或化學目標分子以方陣形式固定在石英，玻璃或其它惰性基質表面上用于生物學，醫學，材料科學研究和應用的微方陣，其特征是，這種微方陣是以大量獨立作為特定目標分子載體的纖維或毛細管狀物體以給定順序組裝成的具有特定二維空間地址的拼裝式微方陣，根據不同負載特性，可以作成基因芯片，免疫芯片，蛋白芯片，細胞芯片，受體芯片，化學芯片和材料芯片。
2.一種可以將大量具有獨立負載特征的纖維或毛細管狀物體以給定的序列地址組裝成微方陣的拼裝器，其特征是，這種拼裝器由一系列排列器以活字排版形式安插在方陣式支架上構成，用來將光纖或毛細管按一定的序列進行二維平行排列的裝置，該裝置是由在基片上加工的一系列平行排列的按給定序列裝載特定生物分子的小室組成的列室，在列室的對面安裝一個磁芯，在上方或下方安裝一個可控諧振器，小室是為載有特定同種目標分子的光纖或毛細管提供的地址性可存取庫室，每一個小室都有一個寬度略大于所存儲的光纖直徑或毛細管的外徑，長度略大于光纖或毛細管長度的從內及外逐漸變窄的楔形狹縫作為所存儲的光纖或毛細管的取出通道，小室垂直于狹縫的尺度須小于毛細管長度，為了確保每次有光纖或毛細管可被取出，狹縫須垂直于，而列室所在的平面須平行于重力線方向，狹縫的出口方向正對著與之間距僅略大于所存儲光纖或毛細管的直徑或外徑且與列室平行安裝的磁芯，當磁芯處于開的狀態時將有一個光纖或毛細管被取出并被磁力吸咐在磁芯表面，由于狹縫寬度和狹縫與磁芯間距的限制，被吸引的后隨光纖或毛細管將被卡在小室內，為了理順光纖或毛細管在小室尤其是在錐形狹縫附近的取向性確保每次有且僅有單根光纖或毛細管被取出，在正對著列室的平行于重力線方向安裝一個可控諧振器以施加一個與磁場協同作用的可控諧振機械波，可控諧振器與磁芯的協同作用，是將開關磁場及可控揩振機械波同時瞬間處于工作狀態從而僅將單個光纖或毛細管吸附到狹縫外的磁芯上，當二者同時處于停止狀態時由于重力的作用吸咐著的光纖或毛細管將垂直下落，而小室內的光纖或毛細管也會沿著楔形狹縫的斜面滑向小室的深處等待下一個周期可控諧振器與磁芯的協同作用，列室中有一個供光纖或毛細管下落的密閉軌道，其上部有一個進氣孔，下部有一個出氣孔，當磁芯和可控諧振器停止工作時，氣流開始工作由上而下將光纖或毛細管依次推下至方陣式支架形成列片，當磁芯和可控諧振器開始工作時氣流關閉，方陣式支架用以將列片疊放為方陣形式，首先將排列好的光纖或毛細管用膠固化，再將固化的光纖或毛細管列按給定的次序進行曲疊放形成方陣，固化，將未固定有目標分子的端面裁剪，研磨，拋光形成芯片，活字排版式拼裝器是指制作芯片時其所包含信息內容的確定可以自由地篩選，拼裝器的方陣式支架的每個單元內都有具有用于為磁芯提供的電流的電極，用于將列片膠固化的涂膠及固化部件和用于將這些列片傳送到可以以給定順序疊放的部分。
3.一種借助于制冷數碼相機(CCD)可以同時全范圍高靈敏檢測微方陣的通過各種方式產生的光信號的檢測儀器，其特征是，將方陣與制冷數碼相機的像素點方陣和待分析微方陣相匹配的光纖束與前二者的方陣對準連接，并將該光纖束從制冷腔里引出從而使得對微方陣的檢測在極大提高信噪比的前提下可以在常溫下操作。
4.一種微方陣檢測中的信號標記放大技術，其特征是，將探針分子用報告分子進行初步標記，然后用與報告分子有高特異性和高親和能力的報告分子配體與固定了大量信號分子的微小顆粒連接，檢測時，通過形成固相載體-目標分子-探針分子-報告分子-報告分子配體-微小顆粒-信號分子的方式進行，可以將信號放大幾個數量級。
5.根據權利要求1所述的在石英或玻璃表面上固定目標分子的表面預處理方法可以在下列方法中擇一(1)氣相，液相硅烷化，(2)硅基化，(3)非共價表面(親和)吸咐，以及(4)由上述這些方法結合產生的方法中的任何一種。
全文摘要
本發明提供了一種通過在二維空間按既定的地址將具有不同負載特性的光纖或毛細管為基元拼裝起來制成的微方陣的技術。該技術的優勢一是在于它可以提供高達100萬～400萬/cm
文檔編號C12Q1/00GK1255552SQ98122060
公開日2000年6月7日 申請日期1998年12月1日 優先權日1998年12月1日
發明者宋克 申請人:宋克