專利名稱：胰島素樣生長因子－1工程菌構建及制備類胰島素生長因子－1的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備胰島素樣生長因子-1過程中所使用的新型重組質粒，以及采用該質粒轉化生成的遺傳工程菌株，特別是涉及胰島素樣生長因子-1的改進的制備方法。
胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是分子量為7648的70個氨基酸組成的單鏈多肽，含三個二硫鍵。它的結構、生物學性質和化學性質與胰島素有相似之處，故稱胰島素樣生長因子(MaCauley VM，Annu Rev Physiol 1993；55131-153)有關研究證明IGF-1介導生長激素的作用而促進生物的生長，因此像骨骼生長、細胞復制和另外一些與生長相關的過程均受IGF-1水平的影響(Timsit J.etal，J.Clin.Endocrinol.Metab，192；75183-188)。
胰島素樣生長因子-1的生理濃度受甲狀腺疾病、糖尿病和營養不良的影響(Horm et al。Blood 1983；4108)胰島素樣生長因子-1與另外一些生長因子有協同作用，如他可以促進軟組織和間葉組織損傷的修復(Suh DY，et al.Endocrinology 1992；1312399-2403)，它可以促進哺乳動物細胞在無血清培養基中的生長等(Burleigh et al.American Biotech Lab 1986；448)。近年來胰島素樣生長因子-1在國外主要用于ALS(肌營養不良性脊髓側索硬化癥)、周圍神經疾病、運動神經元疾病和脊髓灰質炎后綜合癥。Cephalon公司的基因工程產品的胰島素樣生長因子-1已完成三期臨床工作即將投入市場。另有pharmacia用之于生長激素受體缺乏癥(GHRD)的治療和生長遲緩抗體陽性GH缺乏癥LA的治療也已進入三期臨床工作。此外Genentech公司用于糖尿病的治療和Chiron公司用于腎衰的治療也都進入了二期臨床實驗階段。
考慮到胰島素樣生長因子-1在臨床和科學研究上的應用，以及天然產品在分離純化技術上的難度，應用重組DNA技術即基因工程的方法制備胰島素樣生長因子-1有著重要的意義。
重組蛋白可以從各式各樣的基因工程菌宿主細胞中獲得，如大腸桿菌系統和哺乳動物細胞系統。但大腸桿菌無力形成正確的二硫鍵，表達蛋白將形成包涵體，純化時需將蛋白變性后再復性這易造成多種異構體，影響純度和產量(Grossgian et al.Gene 1985；18199)。而哺乳動物細胞體系產量低而且成本高昂。但啤酒酵母菌生長迅速，成本低廉并可以表達及分泌出重組蛋白，從而可簡化分離純化步驟，而且重組蛋白可經過分泌過程形成正常二硫鍵而有正確的四維結構，缺點是產量較低如每升培養液只生產2mg產品(Bayneet al.Gene1988；66235)。
為克服酵母體系現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種新型的制備胰島素樣生長因子1的表達載體以及采用該質粒轉化成的遺傳工程菌。本發明的另一個目的在于采用所述的遺傳工程菌的高密度發酵以提高產量而有利于開發應用。
本發明是這樣實現的這種啤酒酵母細胞，它含有編碼人胰島素樣生長因子的基因的表達質粒，所述的胰島素樣生長因子-1的基因序列的5′端連接有一個α-因子前導肽編碼順序，而在該α-因子前肽DNA序列前又融合有一個Kozak順序，然后再克隆到乙醇脫氫酶啟動子的下游以構建成游離體性的表達質粒。
所述的啤酒酵母細胞，所述胰島素樣生長因子-1的基因序列，含有能表達編碼69個氨基酸的組成。
所述的編碼69個氨基酸的人胰島素樣生長因子-1的基因序列為1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13G P E T L C G A E L V D AGGA CCC GAC ACG CTC TGC GGG GCT GAG CTC GTG GAT GCTCCT GGC CTG ACG GAG ACG CCC CGA CTC GAG CAC CTA CGA14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26L Q F V C G D R G F Y F NCTG CAG TTC GTG TGT GGA GAC AGG GGC TTT ATA TTC AACGAC GTC AAG CAC ACA CCT CTG TCC CCG AAA TAT AAG TTG27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39K P T G Y G S S S R R A PAAG CCC ACA GGG TAT GGC TCC AGC AGT CGA CGG GCG CCTTTG GGG TGT CCC ATA CCG AGG TCG TCA GCT GCC CGC GGA40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52Q T G I V D E C C F R S CCAG ACA GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGTC TGT CCG TAG CAC CTA CTC ACG ACG AAG GCC TCG ACA53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65D L R R L E M Y C A P L KGAT CTA AGG AGG CTC GAG ATG TAT TGC GCA CCC CTC AAGCTA GAT TCC TCC GAG CTC TAC ATA ACG CGT GGG GAG TTC66 67 68 69P A K S * *CCT GCC AAG TCA TAA TGAGGA CGG TTC AGT ATT ACT
所述的人胰島素樣生長因子基因序列的第69個氨基酸的末端連接有兩個終止子順序TAA和TGA。
一種重組表達質粒，它含有能夠表達編碼69個氨基酸的胰島素樣生長因子-1的基因序列所述的編碼的69個氨基酸的胰島素樣生長因子-1的基因序列為1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13G P E T L C G A E L V D AGGA CCG GAC ACG CTC TGC GGG CCT GAG CTC GTG GAT GCTCCT GGC CTG ACG GAG ACG CCC CGA CTC GAG CAC CTA CGA14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26L Q F V C G D R G F Y F NCTG CAG TTC GTG TGT GGA GAC AGG GGC TTT ATA TTC AACGAC GTC AAG CAC ACA CCT CTG TCC CCG AAA TAT AAG TTG27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39K P T G Y G S S S R R A PAAG CCC ACA GGG TAT GGC TCC AGC AGT CGA CGG GCG CCTTTG GGG TGT CCC ATA CCG AGG TCG TCA GCT GCC CGC GGA40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52Q T G I V D E C C F R S CCAG ACA GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGTC TGT CCG TAG CAC CTA CTC ACG ACG AAG GCC TCG ACA53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65D L R R L E M Y C A P L KGAT CTA AGG AGG CTC GAG ATG TAT TGC GCA CCC CTC AAGCTA GAT TCC TCC GAG CTC TAC ATA ACG CGT GGG GAG TTC66 67 68 69P A K S * *CCT GCC AAG TCA TAA TGAGGA CGG TTC AGT ATT ACT
所述的重組表達質粒，所述的基因序列在第69個氨基酸末端連接有兩個終止子順序TAA和TGA。
所述的重組表達質粒，所述的質粒是質粒pD2-IGF1-69。
一種表達外源基因的表達載體，沿著轉錄方向排列著乙醇脫氫酶啟動子、Kozak順序、編碼酵母α-因子前導肽85個氨基酸的核苷酸順序、編碼69個氨基酸的人胰島素樣生長因子-1的基因順序以及終止順序。一種利用啤酒酵母細胞制備人胰島素樣生長因子-1的方法，包括人工合成編碼69個氨基酸的胰島素樣生長因子-1基因；將所述的胰島素樣生長因子-1的基因序列與一個α-因子前導肽編碼順序的DNA片段融合，而在該α-因子前導肽DNA序列前又融合有一個Kozak順序，再克隆到乙醇脫氫酶啟動子的下游以構建成胰島素樣生長因子-1的表達載體；將該表達載體轉化啤酒酵母株BJ-1990后篩選出trp+遺傳工程菌株BJ-IGF-1；高密度培養使所述菌株分泌人胰島素樣生長因子-1。
所述的菌株BJ-IGF-1是一種遺傳工程啤酒酵母，該酵母細胞已于1998年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏號為NO.0343。
本發明的積極效果在于在酵母菌嗜用密碼子化學合成人胰島素樣生長因子I的基因基礎上，再將該基因與編碼酵母a因子前導肽的DNA片段融合，再在a-因子前導肽前加入Kozak順序，然后再以之克隆到乙醇脫氫酶啟動子的下游從而構建出人胰島素樣生長因子I的表達載體。
該載體轉化入酵母菌株BJ-1990后篩選出Trp+的酵母遺傳工程菌株BJ-IGF-I。
高密度培養酵母遺傳工程菌株BJ-IGF-I后即可獲得分泌性的人胰島素樣生長因子I。另外本發明的化學含成的人胰島素樣生長因子-I的基因與天然胰島素樣生長因子-I相比在羧基端少編碼一個氨基酸，且在第69個氨基酸的末端連接有兩個終止密碼TAA和TGA，這種設計有利于表達產物的分離純化和該基因轉錄的終止，而Kozak順序的加入的高效表達加入該因子提供了基礎。
本發明試用了強啟動子的酵母體系，由于應用強啟動子因而該系統表現為遺傳穩定，表達高效，在表達類胰島素生長因子-I上也獲得了高產的成功。
附圖簡要說明

圖1重組質粒pUC19-IGFI-69的構建2人工合成的人胰島素樣生長因子-I的核苷酸順序及相應的氨基酸順序圖3重組質粒pUC19-α-IGF構建4α-因子前導肽與IGF-I編碼順序融合位點處核苷酸順序圖5重組質粒pUC19-Kα-IGF-I的構建6Kozak順序、α-因子前導肽與IGF-I編碼順序融合位點處核苷酸順序示意7表達質粒pD2-IGF-69的構建8IGF-1的SDS-PAGE圖譜圖9IGF-1的生物活性檢測圖以下將結合附圖和實施例詳細描述本發明。實施例1基因來源天然的、成熟的人胰島素樣生長因子-1由70個氨基酸組成，我們的研究工作表明，第70位氨基酸的有無對該蛋白的生物活性沒有影響。由人工合成編碼69個氨基酸的人胰島素樣生長因子-1基因，經表達后，依然有完好生物活性也證明了該結論變異了的人胰島素樣生長因子-1的核苷酸編碼順序。用DNA合成儀及亞磷酸三脂法合成四條寡聚合苷酸鏈，并用聚丙烯酰胺-7M尿素變性凝膠電泳分離純化，其順序分別為DNA片段15’ctcga GGA CCG GAC ACG CTC TGC GGG GCT GAG CTCGTG GAT GCT CTG CAG TTC GTG TGT GGA GAC AGGGGC TTT ATA TTC AACDNA片段25’CGG GCG CCT CAG ACA GGC ATC GTG GAT GAG TGCTGC TTC CGG AGC TGT GAT CTA AGG AGG CTCGAGATG TAT TGC GCADNA片段35’gaattc TCA TTA TGA CTT GGC AGG CTT GAG GGGTGC GCA ATA CAT CTC GAG CCT CCT TAG ATC ACACT CCG GAACA GCA CTCDNA片段45’ATC CAC GAT GCC TGT CTG AGG CGC CCG GCT ACTGCT GGA GCC ATA CCC TGT GGG GTT GTT GAA TATAAACCCCT GTC TCC AGA實施例2重組質粒pUC19-IGFI-69的構建經上述實施例1所得的寡聚核苷酸鏈的5’末端經磷酸化、四個寡聚核苷酸鏈間的復性、鏈的延伸、連結而克隆入pUC19的SmaI位點及重組克隆的鑒定參照《分子克隆》，DNA序列測定應用熒光引物的雙脫氧末端終止法在美國ABI公司373DNA測序儀上進行。獲得重組質粒命名為pUC19-IGF69。重組質粒PUC19-IGF69的構建見附圖1。實施例3人工合成的人胰島素樣生長因子-I的核苷酸順序及相應的氨基酸順序上述實施例2質粒測序結果表明該合成基因順序正確且在基因的5’端加上了預期的XhoI酶切位點，3’端加上了TAA TGA兩個終止子順序和預期的EcoRI酶切位點，故人工合成的hIGF-1基因的核苷酸順序及相應的氨基酸順序圖，如下及見圖2。
XhoICTCGAGAGCT1-13GGA CCG GAC ACG CTC TGC GGG GCT GAG CTC GTG GAT GCTCCT GGC CTG ACG GAG ACG CCC CGA CTC GAG CAC CTA CGA14-26CTG CAG TTC GTG TGT GGA GAC AGG GGC TTT ATA TTC AACGAC GTC AAG CAC ACA CCT CTG TCC CCG AAA TAT AAG TTG27-39AAG CCC ACA GGG TAT GGC TCC AGC AGT CGA CGG GCG CCTTTG GGG TGT CCC ATA CCG AGG TCG TCA GCT GCC CGC GGA40-52CAG ACA GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGTC TGT CCG TAG CAC CTA CTC ACG ACG AAG GCC TCG ACA53-65GAT CTA AGG AGG CTC GAG ATG TAT TGC GCA CCC CTC AAGCTA GAT TCC TCC GAG CTC TAC ATA ACG CGT GGG GAG TTC66-69CCT GCC AAG TCA TAA TGA gaattcGGA CGG TTC AGT ATT ACT cttaagEcoRI實施例3人胰島素樣生長因子-1編碼基因前α-因子前導肽的加入典型的啤酒酵母表達載體包括啟動子基因片段(啟動子及其終止子序列)，其間含有克隆位點以供外源基因插入互補性篩選標志如Trp gene；表達載體中應有酵母復制起點順序2μ，因而可隨酵母的生殖傳代，穩定存在。作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質粒，它還應有部分pBR322質粒的序列如復制起點順序及抗菌素抗性基因作為在大腸桿菌中的篩選標記。
將表達載體轉化到啤酒酵母菌BJ1990(trp-)，并在營養缺陷培養基(trp-)上培養就產生了Trp+表型的重組克隆。
為將IGF-1基因連入上述的酵母表達載體中，進行了下述一系列體外DNA重組工作。
即以如下方式獲得人胰島素樣生長因子-1基因與α-因子前導肽基因的融合及融合基因的克隆。
將我們構建的含α-因子啟動子及α-因子前導肽及細胞色素C終止子的質粒pSKSB以HindIII酶切、S1酶削平，再以SalI酶切作為載體與從pUC19-IGF69經XhoI酶切及削平粘性末端及SalI酶切所獲DNA片段體外連結、轉化得到重組克隆pUC19-αIGF1，見圖3。
α-因子前導肽與IGF-1編碼順序融合基因及融合位點處的核苷酸順序測定表明在IGF-1基因前有編碼85個氨基酸的α因子前導肽順序，這為酵母表達可分泌IGF-1創造了條件。因為α因子前導肽及IGF-1基因在轉錄翻譯后的加工及分泌過程中，84位及85位氨基酸Lys-Arg后恰是KEX2基因產物，一種內源性蛋白酶的切割位點，見圖4。
α因子前導肽IGF-11 2 3 82 83 84 85 1 2 34ATG AGA TTT ... ... TTG GAT AAA AGA-GGA CCG GAG ACGTAC TCT AAA... .....AAC CTA TTT TCT-CCT GGC CTC TGC實施例4α-因子前導肽與IGF編碼順序融合基因前Kozak順序的加入設計出人工合成的5′端含有Kozak順序的寡聚核苷酸引物GGAATT引物GGAATTCACCATGAGATTTCCTTCAATT(上海生工公司其中ACC ATG，是Kozak保守順序，它的存在將有利于翻譯的起始)及相應于IGF-1的3′端的含EcoRI識別順序的序的寡核苷酸引物。以PUC19-a IGF為模板擴增出的DNA片段將含Kozak順、α因子前導肽的85個氨基酸及IGF編碼順序，而且兩端為EcoRI識別位點。該片段經EcoRI酶切后連入pUC19測序(或連入pD2表達，所得克隆為pUC19-KαIGF或pIGF)，見圖5。
經過測序結果表明在IGF-1基因前有完整的自ATG起始的編碼85個氨基酸的α因子前導肽順序，且在前導肽順序前加入了Kozak順序如下幾圖6。
Kozak-α因子前導肽 hIGF1 2 382 83 84 851 2 3 4GGAATTC ACCATGAGATTT...TTGGATAAAAGA...GGACCGGAGACGCCTTAAG TGGTACTCTAAA...AACCTATTTTCT...CCTGGCCACTGC實施例5表達載體pD2-IGF1-69的構建質粒pD2為自建表達載體，它是游離體型質粒，是用來表達非分泌性胞內蛋白的表達載體。其ColE1復制起點順序，及氨芐抗性基因來源于pBR322，使質粒可在大腸桿菌中復制和篩選。含在酵母菌中可自我復制的核苷酸順序2μ，尚有來源于酵母染色體DNA上的Trp基因，為酵母菌的篩選標志。ADH啟動子與終止子間的EcoRI位點為克隆位點，可使含ATG順序的外源基因在該位點插入后在胞內獲得表達，本發明在IGF基因前加入了Kozak順序及α因子前導肽而使外源基因表達產物的分泌成為可能。
將含Kozak順序、a-因子前導肽85個氨基酸及IGF編碼順序，且兩端系EcoRI識別位點的DNA片段經EcoRI酶切后連入pD2表達載體，重組克隆經酶切鑒定篩選出正向克隆為pD-IGF1-69，見圖7。
質粒pD-IGF測序結果證明IGF-1在ADH基因啟動子調控之下且有正確的表達框架。經核苷酸順序測序表明含Kozak順序的α-因子前導肽及IGF-1的融合基因片段已正確連入ADH啟動子下游。另外也證明IGF-1基因存在于插入片段的α-因子前導肽下游。實施例6宿主菌的制備、轉化及工程菌的篩選本發明中采用啤酒酵母細胞作為表達宿主，所用菌株為BJ1990，為此，本發明采用的經實施例5得到的表達載體pD2-IGF1-69轉化該宿主菌、篩選重組克隆后檢測表達。有關過程如下啤酒酵母BJ1990(trp-)本所保存，將之接種于YPD平板培養基上，30℃培養2天，分離出單克隆。單克隆再接種于5ml YPD液體培養基，30℃培養至培養液光密度值(OD)約為0.5，離心收集菌體，TE緩沖液漂洗、離心后混懸于1ml 10mMTris-HCl，1mMEDTA，0.1MLiCl溶液中。30℃振蕩60分鐘后。取100μl該混懸液及5μl10μg超盤旋表達質粒pD2-IGF1-69混合，30℃保溫30分鐘。加入0.7ml 70％聚乙二醇溶液，30℃再次保溫30分鐘，并37℃熱休克5分鐘。離心后將菌體混懸于0.1ml消毒水中，然后傾鋪于篩選培養板上在30℃培養。如用電打孔則宿主菌的單克隆應接種于5ml YPD液體培養基，30℃培養過夜后接種于50ml YPD培養基至其光密度(OD)約為1.5。離心收集菌體，用消毒冷卻水漂洗、離心后混懸于1ml冰冷的1M山梨醇溶液。取80μl經上制備好的宿主菌與pD2-IGF1-69混和于電打孔杯中，0℃預冷5分鐘。設置Bio-Rad基因打孔儀程序，使產生7500V/cm，10ms的電脈沖以完成轉化。立即加入1ml冰冷的1M冰冷的1M山梨醇于電打孔杯中，取200μl鋪篩選培養板，30℃培養至重組子出現。轉化過程中以水代替質粒DNA，鋪篩選板應無克隆出現。
實施例7IGF的表達應用2L發酵罐培養遺傳工程菌株BJ-IGF-1。以10％過夜培養基接種后，30℃培養，持續滴入氨水維持pH6.0，氧飽和度60％，流加甘油至每L濕菌達100-300g后，維持酵母細胞處于飽和期24-48小時以確保IGF-1的表達。
根據本發明表達時相的篩選，本發明方法的表達量確定2天為最佳誘導時間。本發明中為了使菌體快速增殖而提高了基礎料中的甘油含量，使其由1％至3％，并在培養過程中流加甘油，流加氨水補氮并維持最適生長pH，以及維持氧溶解度等從而使菌體迅速生長，進而使表達產量可達100mg/L。
重組胰島素樣生長因子-1分子量的確定得到的重組人胰島素樣生長因子-1使用SDS-PAGE蛋白電泳，參照Laemmli方法確定其分子量。
該方法的具體步驟如下1.材料(1)Pharmacia LKB PhastSystem，由電泳分離單位和染色單位兩部分組成IGF-1樣品在該系統電泳分離并染色，需1小時完成。(2)PhastGel Separation Media選用預制好的8-25％的濃度梯度膠，或普通15％膠。(3)Pharmacia 多肽分子量標準 商品號80-1129-83各分子量為16949，14404，10700，6214，2512。
2.方法(1).輸入SDS-PAGE程序后，將樣品100℃變性5分鐘后上樣電泳。電泳至溴酚蘭到頭，停止電泳，取出凝膠條放入染色器中，輸入染色和脫色程序后進行染色。(2)照相留擋。
3.結果標準分子量蛋白與本實施例中得到重組IGF-1還原變性后上樣于SDS-PAGE以測定分子量。IGF-1樣品電泳染色后均為單一條帶，作圖分析分子量約為7000，符合69個氨基酸組成的IGF-1的分子量。見圖8。實施例8IGF-1生物活性的測定IGF-1生物活性的測定用BalB/C-3T3細胞以MTT法進行，其具體方法如下1.材料和試劑(1)DMEM培養液(購自美國BRL公司)；(2)完全培養液1DMEM培養液添加10％FBS；(3)完全培養液2DMEM培養液添加0.4％FBS；(4)BalB/c-3T3細胞株(購自美國ATCC 20864)；(5)磷酸鹽緩沖液(6)MTT溶液5mg/ml磷酸鹽緩沖液，用0.22u濾膜過濾除菌，4℃避光保存備用；(7)裂解液DMSO或10％SDS，50％DMSO；(8)IGF-1標準品及經實施例7得到的IGF-1樣品。
2.方法(1)收集培養的BalB/c-3T3細胞。用磷酸鹽緩沖液漂洗兩次，重懸于完全培養液1中，使細胞濃度為5.0-10×104/ml。(2)將細胞懸液接種于96孔培養板中，每孔100μl，37℃，5％CO2培養過夜。(3)棄去上清，加入完全培養液2，每孔100μl，37℃，5％CO2培養4-24小時。(4)將由BRL所購買的標準品及帶測樣品用完全培養液2溶解至特定體積。按蛋白含量用完全培養液2稀釋成如下40，10，2.5，0.625，0.156，0.039，0.0ng/ml(5)每孔依次加入稀釋好的樣品100μl。37℃，5％CO2培養48-72小時，(6)鏡檢后每孔加入MTT溶液20-25μl。37℃，5％CO2培養5小時。(7)棄去上清，每孔加入裂解液100μl。37℃，放置1小時后。實驗波長570nm，參比波長630nm。(8)實驗結果計算在坐標紙上以OD570對稀釋倍數或濃度作圖，查出半效量的稀釋度或EC50。IGF-1活性(IU/ml)＝標準品效價×A×BA＝標準品半效量稀釋度/樣品相當于標準品半效量稀釋度B＝樣品預稀釋倍數/標準品預稀釋倍數3.結果OD570對IGF-1濃度作圖可計算出IGF1蛋白的EC50＜10ng。
有關細胞培養情況參見圖9。
權利要求
1.一種啤酒酵母細胞，它含有編碼人胰島素樣生長因子的基因的表達質粒，其特征在于所述的胰島素樣生長因子-1的基因序列的5’端連接有一個α-因子前導肽編碼順序，而在該α-因子前導肽DNA序列前又融合有一個Kozak順序，然后再克隆到乙醇脫氫酶啟動子的下游以構建成游離體性的表達質粒。
2.如權利要求1中所述的啤酒酵母細胞，其特征在于所述胰島素樣生長因子-1的基因序列是含有能表達編碼69個氨基酸所組成。
3.如權利要求2中所述的啤酒酵母細胞，其特征在于所述的編碼69個氨基酸的人胰島素樣生長因子-1的基因序列為1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13G P E T L C G A E L V D AGGA CCG GAC ACG CTC TGC GGG GCT GAG CTC GTG GAT GCTCCT GGC CTG ACG GAG ACG CCC CGA CTC GAG CAC CTA CGA14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26L Q F V C G D R G F Y F NCTG CAG TTC GTG TGT GGA GAC AGG GGC TTT ATA TTC AACGAC GTC AAG CAC ACA CCT CTG TCC CCG AAA TAT AAG TTG27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39K P T G Y G S S S R R A PAAG CCC ACA GGG TAT GGC TCC AGC AGT CGA CGG GCG CCTTTG GGG TGT CCC ATA CCG AGG TCG TCA GCT GCC CGC GGA40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52Q T G I V D E C C F R S CCAG ACA GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGTC TGT CCG TAG CAC CTA CTC ACG ACG AAG GCC TCG ACA53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65D L R R L E M Y C A P L KGAT CTA AGG AGG CTC GAG ATG TAT TGC GCA CCC CTC AAGCTA GAT TCC TCC GAG CTC TAC ATA ACG CGT GGG GAG TTC66 67 68 69P A K S * *CCT GCC AAG TCA TAA TGAGGA CGG TTC AGT ATT ACT
4.如權利與要求3所述的啤酒酵母細胞，其特征在于所述的人胰島素樣生長因子基因序列的第69個氨基酸的末端連接有兩個終止子順序TAA和TGA。
5.一種重組表達質粒，它含有能夠表達編碼69個氨基酸的胰島素樣生長因子-1的基因序列，其特征在于所述的編碼的69個氨基酸的胰島素樣生長因子-1的基因序列為1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13G P E T L C G A E L V D AGGA CCG GAC ACG CTC TGC GGG GCT GAG CTC GTG GAT GCTCCT GGC CTG ACG GAG ACG CCC CGA CTC GAG CAC CTA CGA14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26L Q F V C G D R G F Y F NCTG CAG TTC GTG TGT GGA GAC AGG GGC TTT ATA TTC AACGAC GTC AAG CAC ACA CCT CTG TCC CCG AAA TAT AAG TTG27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39K P T G Y G S S S R R A PAAG CCC ACA GGG TAT GGC TCC AGC AGT CGA CGG GCG CCTTTG GGG TGT CCC ATA CCG AGG TCG TCA GCT GCC CGC GGA40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52Q T G I V D E C C F R S CCAG ACA GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGTC TGT CCG TAG CAC CTA CTC ACG ACG AAG GCC TCG ACA53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65D L R R L E M Y C A P L KGAT CTA AGG AGG CTC GAG ATG TAT TGC GCA CCC CTC AAGCTA GAT TCC TCC GAG CTC TAC ATA ACG CGT GGG GAG TTC66 67 68 69P A K S * *CCT GCC AAG TCA TAA TGAGGA CGG TTC AGT ATT ACT
6.如權利要求5所述的重組表達質粒，其特征在于所述的基因序列在第69個氨基酸末端連接有兩個終止子順序TAA和TGA。
7.如權利要求5所述的重組表達質粒，其特征在于所述的質粒是質粒pD2-IGF1-69。
8.一種表達外源基因的表達載體，其特征在于沿著轉錄方向排列著乙醇脫氫酶啟動子、Kozak順序、編碼酵母α-因子前導肽85個氨基酸的核苷酸順序、編碼69個氨基酸的人胰島素樣生長因子-1的基因順序以及終止順序。
9.一種利用啤酒酵母細胞制備人胰島素樣生長因子-1的方法，其特征在于包括人工合成編碼69個氨基酸的胰島素樣生長因子-1基因；將所述的胰島素樣生長因子-1的基因序列與一個α-因子前導肽編碼順序的DNA片段融合，而在該α-因子前導肽DNA序列前又融合有一個Kozak順序，再克隆到乙醇脫氫酶啟動子的下游以構建成胰島素樣生長因子-1的表達載體；將該表達載體轉化啤酒酵母株BJ-1990后篩選出trp+遺傳工程菌株BJ-IGF-1；高密度培養使所述菌株分泌人胰島素樣生長因子-1。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述的菌株BJ-IGF-1是一種遺傳工程啤酒酵母，該酵母細胞已于1998年3月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理會委員會普通微生物中心即CGMCC，其保藏號為NO0343。
全文摘要
本發明涉及人胰島素樣生長因子－1工程菌及使用該菌置備人胰島素樣生長因子－1的方法,該工程菌為啤酒酵母細胞,它含有能夠編碼69個氨基酸的人胰島素樣生長因子－1的基因序列,其特征在于所述的人胰島素樣生長因子－1基因序列的5’連接有一個α－因子前導肽序列,在該α－因子前導肽DNA序列前融合了一個Kozak順序,然后再克隆到乙醇脫氫酶啟動子的下游以構成表達載體,進而轉化啤酒酵母細胞得到可分泌人胰島素樣生長因子－1的遺傳工程菌株BJ－IGF－1。
文檔編號C12N1/19GK1229133SQ9810611
公開日1999年9月22日 申請日期1998年3月18日 優先權日1998年3月18日
發明者黃鸝蕙, 朱裕鼎 申請人:北京勝百奧生物技術研究所