專利名稱：來自有蹄動物胚胎的培養內細胞團細胞系的制作方法
技術領域：
本發明提供了新的培養內細胞團(CICM)細胞、細胞系，以及它們的制備方法。在延長培養期間，本發明的培養內細胞團(CICM)具有與發育中胚胎的內細胞團相似的形態，并與其同樣或高度相似地表達細胞標記。這些培養內細胞團(CICM)是通過新的培養技術和/或通過導入可調節的分化抑制基因(DI)而產生的。可將本發明的培養內細胞團(CICM)細胞系用于生產分化細胞、組織、器官和/或整只動物，優選有蹄動物，理想的是那些已被遺傳修飾從而基因組中含有合適的異源DNA、或已經選擇得到的含有遺傳理想性狀的分化細胞、組織、器官和/或整只動物。這項工作是利用體外培養技術或通過嵌合或核移植胚胎、胎兒和/或后代來完成的。而且，此培養內細胞團(CICM)細胞也可用于克隆(核移植過程)以產生在遺傳上完全相同的胚胎、胎兒和/或后代。
背景技術：
在體外從早期植入前小鼠胚胎中得到胚胎干細胞系(ES cell lines)的方法是眾所周知的(可見如，Evans等，自然，29:154-156(1981)；Martin，美國國家科學院院報，78:7634-7638(1981))。只要存在成纖維細胞飼養層(Evans，等，出處同前)或分化抑制源(Smith等，發育生物學，121:1-9(1987))，即可在未分化狀態下對ES細胞進行傳代。
以前已有報道表明ES細胞有許多應用。例如，曾有報道說ES細胞可用做研究分化、尤其是研究參與早期發育調節的基因的體外模型。當小鼠ES細胞被引入植入前的小鼠胚胎中時，它們能產生種系嵌合體，這證明了小鼠ES細胞的多潛能性(Bradley等，自然，309:255-256(1984))。
由于ES細胞具有將其基因組傳遞給下一代的能力，通過利用含有或不含有所需遺傳修飾的ES細胞，在牲畜的種系加工中具有潛在的效用。而且，就牲畜類動物如有蹄動物而言，來自類似植入前的牲畜胚胎的核可以支持去核卵母細胞發育完整(Smith等，Biol.Reprod.,40:1027-1035(1989)；和Keefer等，Biol.Reprod.,50:935-939(1994))。這一情況與據報道8細胞期以外的小鼠胚胎的核轉移后不能支持去核卵母細胞發育的結果相反(Cheong等，Biol.Reprod.,48:958(1993))。因此，由于來自牲畜類動物的ES細胞可以為核移植過程提供經遺傳操作或未經操作的全能性供體核的可能來源，這種ES細胞是非常合乎需要的。
許多研究組報道了據稱為多能性的胚胎細胞系的分離。例如，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.,43:255-260(1991)報道了來自豬和綿羊胚泡的據稱是穩定的多能性細胞系的建立，該細胞系顯示出與經免疫外科術自綿羊胚泡分離的內細胞團的原代培養物中的細胞相似的一些形態和生長特性(出處同前)。還有，Notarianni等，J.Reprod.Fert.Suppl.,41:51-56(1990)公開了來自豬胚泡的、被認為是多能性胚胎細胞系在培養中的維持和分化。此外，Gerfen等，動物生物技術，6(1):1-14(1995)公開了從豬胚泡分離胚胎細胞的方法。在不使用條件培養基的情況下，這些細胞可在小鼠胚胎成纖維細胞飼養層中穩定地維持。據報道這些細胞在培養過程中分化為幾種不同的細胞類型(Gerfen等，出處同前)。
另外，Saito等，Roux′s Arch.Dev.Biol.,201:134-141(1992)，報道了培養的牛胚胎干細胞樣細胞系，該細胞系經過三次傳代仍能存活，但第4次傳代后就會丟失。更進一步的是，Handyside等，在Roux′s Arch.Dev.Biol.,196:185-190(1987)公開了在可允許從小鼠內細胞團分離小鼠ES細胞系的條件下，培養經免疫外科術分離的綿羊胚胎內細胞團的方法。Handyside等，(1987)(出處同前)報道了在這樣的條件下，綿羊內細胞團附著、鋪開并發育成ES細胞樣和內胚層樣細胞區，但在延長培養后，只有內胚層樣細胞是明顯可見的(出處同前)。
最近，Cherny等，Theriogenology,41:175(1994)報道了長期培養物中維持的來源于牛原始生殖細胞的細胞系，據稱該細胞系是多能性的。在培養約7天后，這些細胞產生對堿性磷酸酯酶(AP)呈陽性著色的ES樣集落，顯示出形成胚狀體的能力，并自發分化成至少兩種不同的細胞類型。據報道這些細胞還表達轉錄因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，這被認為是僅ES細胞中存在的同源框基因(homeobox genes)表達模式。
同樣最近，在一個摘要中，Campbell等Theriogenology,43:181(1995)報道了九日齡綿羊胚胎來源的、在可促進小鼠ES細胞系分離的條件下培養的胎盤(ED)細胞進行核移植后，可生產出活的小羊。基于他們的實驗結果，作者斷定來自第9天的綿羊胚胎的ED細胞在核移植中是全能性的，而且高達3次傳代后的培養物仍保持了全能性。
甚至更近一些，Campbell等，自然，380:64-68(1996)報道了通過核移植從培養細胞系中克隆綿羊。他們使用的細胞與本發明的培養內細胞團(CICM)細胞不同。Campbell等人所用的細胞在組織培養中形成單層，而本發明中的CICM細胞則并非如此。作者指出這些細胞好象“被弄平”了，或呈現出一種“上皮狀”的外觀。相反，本發明的CICM細胞在以未分化狀態生長時，能繼續保持為多層集落或集落部分。此外，Campbell等人所用的細胞為細胞角蛋白和層粘連蛋白A/C陽性。相反地，本發明的CICM細胞為細胞角蛋白陰性。
此外，并無跡象顯示Campbell等人的細胞是未分化的。確切地說，此參考文獻只指出了這些細胞在核移植過程中是有用的。還有，這些細胞并非在與成纖維細胞飼養層保持經常接觸的條件下培養的。確切地說，Campbell等人(1996)的培養細胞在培養過程中明顯地將成纖維細胞推到邊上，而它們自己生長在培養板的上面。
Van Stekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev.,40:444-454(1995)報道了來自牛胚泡內細胞團細胞的據稱是永久細胞系的分離和鑒定。作者在不同的條件下從第8或9天的牛胚泡中分離和培養內細胞團(ICM)，以確定哪一種飼養細胞和培養基對支持牛內細胞團(ICM)細胞附著和生長是最有效的。基于其實驗結果，他們斷定，通過使用STO(小鼠成纖維細胞)飼養細胞(取代牛子宮上皮細胞)和利用去炭血清(優于正常血清)補加到培養基中，培養ICM細胞的附著和生長能力得到了提高。然而，Van Stekelenbury等人報道，他們的細胞系更象是上皮細胞，而不太象多能性ICM細胞(出處同前)。
更進一步的是，Smith等人，1994年10月27日公開的WO94/24274,Evans等人，1990年4月5日公開的WO90/03432，以及Wheeler等人，1994年11月24日公開的WO94/26889，均報道了據稱能用于制作轉基因動物的動物干細胞的分離、篩選和增殖。公開于1990年4月5日的WO90/03432(Evans等人)也報道了來自豬和牛品種的、據稱具有多能性的胚胎干細胞的獲得，據稱該胚胎干細胞對于轉基因動物的制作是有用的。此外，發表于1994年11月24日的WO94/26884(Wheeler等人)公開了據稱對于嵌合體和轉基因有蹄動物的制作有用的胚胎干細胞。因此，從上述內容可以明顯看到，由于ES細胞系在如克隆胚胎或轉基因胚胎的產生以及核移植中具有潛在應用，許多研究小組已在試圖生產ES細胞系。
有蹄動物內細胞團(ICM)細胞在核移植中的使用也已有報道。例如，Collas等人在Mol.Reprod.Dev.,38:264-267(1994)中公開了通過將裂解的供體細胞顯微注射入去核的成熟卵母細胞中而進行的牛內細胞團細胞的核移植。該文述及，將胚胎體外培養7天以產生十五個胚泡，將這些胚泡植入牛受體后，結果有4只受孕，出生兩只小牛。Keefer等人在Biol.Reprod.,50:935-939(1994)中也公開了將牛內細胞團(ICM)細胞用作核移植中的核供體以產生胚泡，將這些胚泡移植入牛受體后，結果產生了若干活后代。此外，Sims等人在美國國家科學院院報，90:6143-6147(1993)中述及，通過將短期體外培養的牛內細胞團(ICM)細胞的核移植到去核的成熟卵母細胞中，可產生小牛。
除此之外，也有報道表明，短期培養的胎盤細胞(多達三次傳代)經核移植后產生了活的小羊(Campbell等，Theriogenology,43:181(1995))。另外還有有關在核移植中使用牛多能性胚胎細胞和產生嵌合胎兒的報道(Stice等，Theriogenology,41:301(1994))。
盡管前述文獻已有有關報道，然而，對具有改良特性如與發育中胚胎、尤其是有蹄動物胚胎的ICM細胞的形態特征相同或基本相似，且同樣或基本相似地表達細胞標記的培養ICM細胞和細胞系仍然存在很大的需求。此外，在本領域內對生產這些改良的培養ICM細胞和細胞系的方法也有很大的需求。
發明目的本發明的一個目的是提供新的和改良的培養內細胞團(ICM)細胞和細胞系。
本發明的較具體的目的是提供與發育中胚胎的ICM形態特征和表達細胞標記相同或基本相似的新的改良的培養ICM細胞和細胞系。
本發明的一個更具體的目的是提供具有一定的形態特征并與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記的新的改良的有蹄動物培養ICM細胞和細胞系。
本發明的另一具體目的是提供改良的培養ICM細胞和細胞系，優選來自有蹄動物的這類細胞和細胞系，它們在延長培養期間具有一定的形態特征并與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記。
本發明又一具體目的是提供分離和/或生產這類改良的有蹄動物培養ICM細胞和細胞系的新方法。
本發明的一個更具體的目的是提供分離和/或生產培養的有蹄動物ICM細胞或細胞系(長期培養物則更好)的新方法，所說的ICM細胞或細胞系呈現一定的形態特征并與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記。
本發明的一個具體目的是提供培養和篩選呈現一定的形態特征并與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記的培養的有蹄動物ICM細胞或細胞系的新方法，該方法包含以下步驟(ⅰ)用機械和/或酶促方法獲得胚泡的ICM或從前胚泡期胚胎中獲得ICM祖細胞；(ⅱ)在飼養層培養物上，優選成纖維細胞上培養所說的ICM；和(ⅲ)從所述培養細胞中鑒定出具有以下特征的細胞(a)細胞質/細胞核體積比例較小；(b)有胞質小泡；和(c)單個細胞較小；
(ⅳ)從剩下的培養細胞中分離出具有上述特性的細胞；和(ⅴ)在可使分離細胞與飼養層直接物理接觸的條件下，將所述分離的細胞傳代至飼養層、優選成纖維細胞上。
本發明的一個更具體目的是通過以下步驟生產改良的培養ICM(ⅰ)通過適當的機械和/或酶促方法獲得胚泡期胚胎的ICM，優選有蹄動物的胚泡期胚胎的ICM；(ⅱ)在長滿的、優選厚的飼養細胞單層(優選含有成纖維細胞)上培養上述獲得的ICM；(ⅲ)在可以產生多層細胞集落的條件下培養所述ICM，所說的多層細胞集落包括第一種基本上位于內部的平整上皮樣細胞群體，以及另一種基本上圍繞著所述內層上皮樣細胞的多層細胞群體，所說的多層細胞群體中含有具胞質小泡、細胞質/細胞核體積比例較小的、相對較小的細胞；(ⅳ)通過適當的非降解性方法，即機械和/或酶促方法，將基本上包括在多層細胞集落周邊的所說的第二種多層細胞群體分離出來；和(ⅴ)在可使分離細胞與飼養層直接物理接觸的條件下，將所述分離的細胞傳代到新的飼養層、優選包含成纖維細胞的飼養層上。
本發明的另一目的是通過含有下述步驟的方法，提供具有一定的形態特征并與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記的培養ICM(ⅰ)獲得有蹄動物ICM細胞或已建好的培養的有蹄動物ICM細胞系；(ⅱ)將一個或多個抑制分化的基因(DI gene)導入所說的ICM細胞或所說的已建好的ICM細胞系的核中，優選這個(些)DI基因在誘導型啟動子控制下進行表達；(ⅲ)在可保證所述分化抑制基因(DI gene)表達的條件下，在飼養層上、優選長滿的成纖維細胞層上培養獲得的轉基因ICM細胞或培養ICM細胞系；在前述培養方法中使用可表達一個或多個DI基因的ICM細胞和細胞系也是本發明的一個目的。
本發明的另一具體目的是將本發明的改良的培養ICM用于ICM或培養ICM具有適用性的任何用途上，此改良的培養ICM呈現一定的形態特征并與發育中的有蹄動物胚胎ICM相同或基本相似地表達細胞標記。這些用途包括諸如通過體外細胞培養技術生產分化細胞、器官和/或整只動物，或者制作嵌合體或核移植胚胎，這些胚胎可以是也可以不是轉基因的。
本發明的一個具體目的是提供可用于克隆(核移植過程)的培養ICM細胞，以生產具有遺傳同一性的有蹄動物胚胎、胎兒和/或后代，或制作嵌合的有蹄動物胚胎、胎兒或后代。
本發明的另一具體目的是將本文中的培養ICM或由此衍生的細胞系用于所需的異源DNA的整合中，以及將由此產生的轉基因的培養ICM用于生產轉基因有蹄動物胚胎、胎兒和/或后代，或者制作轉基因嵌合的有蹄動物胚胎和/或后代。
附圖簡述

圖1是在無飼養層接觸時生長的培養CICM細胞的照片，從中可觀察到胚狀體。
圖2是細胞角蛋白呈陽性的培養CICM細胞的照片。
圖3是在成纖維細胞飼養層上的CICM細胞的照片。只經過兩天的培養就可見多層細胞集落。
圖4和圖5是顯示堿性磷酸酯酶陽性而細胞角蛋白陰性的CICM細胞集落的照片。
圖6和圖7顯示了在CICM細胞培養期間獲得的上皮樣細胞。這些細胞是堿性磷酸酯酶(AP)陰性而細胞角蛋白陽性的。
圖8是CICM細胞集落的照片。該照片顯示出多層細胞集落正在變平成為上皮樣細胞片。位于集落中間的細胞是堿性磷酸酯酶陰性并呈現扁平上皮樣外觀。相反，周邊細胞較小，呈現多層的形態并具有胞質小泡。
圖9顯示了顯微注射五天后表達β-半乳糖苷酶構建體的培養豬CICM細胞。
發明詳述在對本發明進行更詳細的討論之前，先提供下述定義。
內細胞團細胞(ICM細胞)這是早期胚胎發育過程中即胚泡期產生的兩種截然不同的細胞類型中的一種，最終形成飼養層的一部分。這些細胞已知可應用于核移植技術中，以及嵌合和克隆后代的生產中。
滋養外胚層(TE細胞)指早期胚胎發育即胚泡期產生的兩種截然不同的細胞類型中的另一種，最終形成為胎盤的一部分。
ICM祖細胞這是前胚泡期胚胎中所含有的細胞，它們發育成ICM細胞。
培養內細胞團細胞指在體外培養了一個延長期時間的內細胞團細胞。
培養內細胞團(CICM或培養ICM)是呈現一定的形態特征并與發育中胚胎的內細胞團細胞相同或基本相似地表達細胞標記的細胞在本發明中，這是指與發育中胚胎如有蹄動物胚胎的ICM所呈現的形態相同或高度相似的培養ICM細胞。通常，這類細胞將以小的多層集落的形式生長；然而，如果一個集落大小超過大約50-100個細胞，一些細胞就可能分化。
與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同地表達細胞標記的CICM，是指該CICM以發育中的有蹄動物胚胎的未分化ICM的特有方式表達或不表達細胞標記。可用于鑒別合適的CICM的適當細胞標記包括諸如細胞角蛋白，尤其是細胞角蛋白8和細胞角蛋白18，酶類如堿性磷酸酯酶，以及其它一些在ICM中表達的細胞標記，如rex-1、1amin ac和oct4。理想的狀況是，這些細胞標記的表達水平(如果有的話)與來自有蹄動物胚胎的未分化ICM的表達水平是一樣的。
與發育中的有蹄動物胚胎的ICM基本相似地表達細胞標記的CICM是指該CICM所表達的細胞標記與未分化的發育中有蹄動物胚胎ICM所特有的細胞標記大部分相同，例如細胞角蛋白諸如細胞角蛋白18，酶類諸如堿性磷酸酯酶，以及其它細胞標記諸如rex-1ac和oct4。基本相似是指與有蹄動物胚胎的未分化ICM相比，本發明的CICM中有些細胞標記的表達量可以有所改變，有些細胞標記的表達方式可以有所不同，只要這種變化不會負面影響所產生的CICM按照本發明的方法進行培養和維持的能力。
總之，與發育中有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記的CICM細胞不會表達細胞角蛋白18，但表達堿性磷酸酯酶。檢測這些細胞標記及其它細胞標記表達的方法在本領域中是已知的(其中的一些在下文引作參考文獻)，包括諸如免疫檢測等方法。例如，基于細胞與適當免疫探針(如可提供特異性檢測的標記抗體)的反應性，可利用這樣的方法檢測某種特殊細胞標記的表達與否。
然而，如下文所討論的，細胞標記的表達可能會存在種類差異(例如，來自豬的CICM是堿性磷酸酯酶(AP)陽性的，而來自牛的CICM絕大多數是AP陰性的)。而且，本發明的培養ICM也可能包含正常情況下不包含于ICM中的基因，例如，編碼所需產物的基因和/或一個或多個抑制分化的基因。
分化抑制基因在本發明中，分化抑制基因通常是指可抑制ICM分化的任何核酸序列，包括諸如tsA58基因，以及編碼其它T抗原和癌基因產物、細胞因子和轉錄因子如OCT3、LIF和LIF受體的其它基因。這些分化抑制基因在本領域中是已知的，并且在WO91/13150、Okamoto等，細胞，60:461(1990)；Rosner等，自然，345:686(1990)和Smith等，自然，336:688(1988)中都有描述，所有這些文章都全文引入本文作為參考。其它的合適基因還包括REX-1(Rodgers等，發育，113:815-824(1991))和FGF-5(Herbert等，發育，112:407-415(1991))。
誘導型或可調型啟動子這是指當其與目的結構基因如分化抑制基因有效相連時可以被“打開”，即在特定條件下可啟動轉錄的任何啟動子。通常這要求在培養基中存在或缺乏一種或多種取代物，如金屬離子，或要求有其它特殊的培養條件，如特殊的溫度條件，等等。熟知的誘導型或可調型啟動子的例子包括反應元件，諸如四環素(WO94/29442)、干擾素(Kimura等，細胞，44:261(1986))、類固醇和金屬硫蛋白的啟動子(Yarranton,G.T.,Curr.Opin.Biotech.,3:506(1992))、溫度誘導型啟動子等等。這些文獻均全文引入本文作為參考。
飼養細胞指可被用于獲取和/或增殖未分化的培養ICM細胞系的任何細胞。這些飼養細胞優選為成纖維細胞，更優選為小鼠胚胎成纖維細胞，例如來自12-16日齡的小鼠胎兒。其它的合適飼養細胞包括諸如來自有蹄動物的成纖維細胞和子宮上皮細胞、小雞成纖維細胞、大鼠成纖維細胞、STO和SI-m220飼養細胞系，以及BRL細胞。
培養的多層ICM集落指在飼養層上生長的培養ICM的多層集落，它呈現出具有兩種不同且明顯的細胞群體的多層結構。第一種細胞群體基本上構成了多層細胞集落的周邊，并且是多層的，這樣的細胞包括相對較小、具有胞質小泡并對AP活性著色呈強陽性的細胞。另一種細胞群體基本上包含于此細胞集落的中間，它基本上由扁平上皮樣細胞群體組成，這類細胞的AP活性極小或者沒有。
正如所述，本發明通常指與以前所報道的培養ICM相比具有改良特性的培養ICM細胞和細胞系。具體地說，這些培養ICM和細胞呈現一定的形態特征并與發育中胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記。
本發明提供了培養ICM，其具有與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似的新特性組合，該培養ICM具有上文所述的多層細胞集落形態，并與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記，例如，它們不表達細胞角蛋白18，可能表達或不表達堿性磷酸酯酶(取決于具體的品種來源)。
以前的研究者已將堿性磷酸酯酶標記或細胞角蛋白18標記獨立地用于檢測培養細胞是否與發育中的有蹄動物ICM具有原來推測的相似性(Piedrahita等，Theriogenology,34:879(1990),Wheeler等，Reprod.Fert.Dev.,6:563(1994)及Talbot等，Mol.Reprod.Dev.,36:139(1993))。因而，本文所制備的CICM中這些細胞標記的表達很好地證明了可將本發明的培養技術用于獲取與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似的ICM。
這與以前所公開的培養ICM如Talbot等人(出處同前)的培養豬ICM相反，后者在體外培養僅兩星期就會分化并失去AP活性。本發明的培養ICM與Sims等人(出處同前)的培養牛ICM也有所不同，后者只短期培養，但在細胞懸液體系中被解聚并以單個細胞的形式生長。本發明的培養ICM更不同于前文所述的ES樣細胞，后者以上皮單層形式生長，且是AP陰性和細胞角蛋白陽性的。此外，本發明的培養ICM也不同于Wheeler,Reprod.Fert.Dev.,6:563(1994)和WO94/26884中的ICM，后二者盡管以多層集落形式生長且為細胞角蛋白陰性(與本發明的CICM細胞系相似)，但它們是飼養層非依賴型的。
因而，本發明提供了新的CICM細胞和細胞系，該CICM細胞和細胞系若具有正確的形態和細胞標記特征，應是非常適合用于嵌合體和核移植的研究中，以產生分化細胞、胎兒和后代。通常說來，本文的新CICM細胞系是通過以下兩種方法中的任意一種而產生的。
第一種方法包括獲取胚泡的ICM或從前胚泡期胚胎中獲取ICM祖細胞，優選來自有蹄動物胚胎。有蹄動物包括許多重要的家畜類動物，如豬、牛、綿羊、馬和山羊。因此，迫切需要可能適合有蹄動物生產的培養有蹄動物細胞。除此之外，相比于其它已知可有效用于生產培養ICM和轉基因動物或克隆動物的物種，如嚙齒類動物，有蹄動物具有更大的優越性，因為它們在免疫和生理上都與人類更相近。
胚泡或前胚泡期的有蹄動物胚胎可以通過熟知的方法得到。例如，可以經外科剖腹術，從死后的豬或牛等有蹄動物的生殖道通過外科手術收集胚泡或前胚泡胚胎，或可通過非外科手術收集。通常這些胚胎為2-15日齡，優選8日齡。收集到胚胎后，部分分離胚泡或前胚泡期有蹄動物胚胎的ICM(如將ICM與滋養層細胞分離)或任由其保持完整。如果進行部分分離，通常是通過適當的機械和/或酶促方法如利用培養玻璃針和/或將它們與胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶一起保溫等方法來完成。
然后將部分分離的或完整的含有ICM和至少一部分滋養外胚層的胚泡ICM或來自前胚泡期胚胎的ICM祖細胞置于一合適的有飼養細胞層的培養基中。來自前胚泡期胚胎的全部細胞都置于合適的飼養層上。如前所述，飼養細胞層包括可便于未分化ICM的篩選和/或增殖的任何細胞層。飼養細胞層優選包含成纖維細胞，更優選來自小鼠胚胎成纖維細胞原代培養物。然而，我們認為可以用成纖維細胞系或其他類型的成纖維細胞來代替。
本發明人發現，對于在培養中獲取和增殖未分化CICM細胞系來說，飼養層的形態特征是一個重要因素。更具體地說，已發現用于培養ICM的培養板優選含有一層厚的長滿的飼養細胞單層，更優選厚的長滿的小鼠成纖維細胞單層。
如實施例中更為詳細的論述，飼養層優選得自胚胎成纖維細胞的原代培養物，如來自12-16日齡的小鼠胎兒的細胞。成纖維細胞的分離方法在本領域中是眾所周知的。例如，通過無菌去除合適小鼠胎兒的頭、肝臟、心臟和消化道，然后切碎這些小鼠胎兒并在可保證細胞分離的合適條件(如將其與含有胰蛋白酶的組合物一起保溫)下溫育，然后將分離的成纖維細胞鋪到含有合適培養基的組織培養板中，可收集到成纖維細胞。
可以使用適于維持培養的飼養細胞如小鼠成纖維細胞的任何培養基。具體地說，本發明人選擇將成纖維細胞鋪到組織培養板中，并在補充有10％胎牛血清(FCS)(Hyclone,Logen,UT)、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(50ug/ml)的α-MEM培養基(Bio Whittaker,Walkersville,MD)中培養。然而，估計也可換用其它培養基，包括諸如補充有谷氨酰胺、葡萄糖、2-巰基乙醇、MEM非必需氨基酸、5-20％血清、抗體、核苷和谷氨酰胺的DMEM培養基(參見Strojek等，Theriogenology 33:981(1990)；Notarianni等，J.Reprod.Fert.43(Suppl):255(1990))，以及CM β和BRL條件培養基(參見Handyside等，Roux′s Arch.Dev.Biol.,196:185(1987))。
培養成纖維細胞至長滿后，將其傳代到其它的組織培養板上或直接用于培養ICM細胞和細胞系。優選地，在傳代后加入ICM之前的某一時間也用一定量的包含于適當培養基如α-MEM中的抗生素如絲裂霉素C處理(絲裂霉素C的用量優選為5-100ug/ml，更優選約10ug/ml)、或者輻射處理飼養細胞如成纖維細胞以終止或阻礙成纖維細胞的生長。
優選在允許培養板中細胞長成鋪滿單層的條件下培養飼養細胞如成纖維細胞。例如，為此，可在37℃、濕潤氣氛中如含有5％ CO2的空氣中培養成纖維細胞。然而，取決于各種因素如飼養細胞的類型、傳代數、種類以及其它因素等，具體的培養條件可以有所變化。
如前文所述，隨后將包含所需飼養層最好是厚且長滿的細胞單層的培養平板用于獲取和培養本發明的CICM細胞和細胞系。優選此過程包括將含有至少一部分滋養外胚層的部分分離的或完整的有蹄動物ICM直接鋪到經絲裂霉素C處理過的長滿飼養層上。這可通過可促使培養ICM和飼養細胞之間直接物理接觸的任何方法來完成。為此，可用不同的方法。例如，可使用玻璃吸管起始ICM和成纖維細胞間的接觸。或者，可通過將ICM細胞置于飼養層下面、培養板的底部，或通過離心ICM細胞以使它們直接鋪于飼養細胞層上而達到飼養細胞層和培養ICM之間的物理接觸。
利用可允許ICM的生長和維持并獲得所需的多層集落形態的任何培養基，在飼養層上培養ICM。優選在含有補加了FCS和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)的α-MEM的生長培養基中維持CICM細胞和細胞系。然而，也可換用其它培養基，包括諸如前文所公開的培養基。
在培養期間，必要時將生長培養基換成新鮮培養基以利于細胞生長。通常每2-3天換液一次。然而，根據具體的飼養細胞和所選用的培養基的情況，換液間隔時間可以有所不同。培養數天(通常約4天)后，可觀察到最早的培養ICM或CICM集落，然后在此后的某個時間，通常至少約1天后，可將培養ICM傳代到含有成纖維細胞飼養層的其它培養板上。
也已發現，若將CICM細胞與一些相連的飼養細胞一起傳代至新的飼養層上，其傳代效率會有所提高。因此，新代細胞含有一些來自前代的飼養細胞。將CICM細胞與一些相連飼養細胞(成纖維細胞)一起傳代時，已發現傳代效率(可形成新集落的CICM細胞團的百分比)有了明顯提高。
如上所述，本發明的一個重要內容包括發現優選對含有特定形態特征組合的CICM細胞進行傳代，以及生產具有所需特性的培養ICM細胞和細胞系。具體地說，優選具有下述形態特征的細胞(ⅰ)細胞質/細胞核的體積比例較小(約10/90-50/50，更優選約10/90-30/70，最優選約25/75)；(ⅱ)可見胞質小泡；和(ⅲ)單個細胞較小，直徑約10-20μm、優選小于約15μm。
在顯微鏡下觀察培養細胞、適當測量并進行適當的體積計算，可容易確定細胞質/細胞核體積比的計算值。類似地，在培養細胞中可很容易觀察到胞質小泡。最后，通過測量包含于飼養層培養物上的CICM的細胞直徑可容易地測出細胞大小。
本發明人已驚奇地發現，對分離和增殖培養ICM細胞，以及生產具有所期望的形態和細胞標記特性且在組織培養延長期間(即重復傳代后)仍保持這些特性的細胞系而言，上述形態特征是很重要的。
更具體地說，本發明是基于觀察到當ICM或傳代的CICM細胞系開始附著于飼養層上時，不久(通常約2天后)就可見到一些多層集落。可是，當細胞在體外增殖時，這些多層集落通常會開始變平形成上皮片狀細胞。與此觀察結果相關，已發現包含于集落多層部分的細胞是AP陽性和細胞角蛋白18陰性的，而扁平上皮樣細胞則為AP陰性和細胞角蛋白18陽性。因此上皮樣細胞與發育中胚胎的ICM表達細胞標記有所不同。相應地，已發現在飼養細胞層上超時培養的ICM逐漸顯示出與未分化的發育中胚胎的ICM不一致的形態和表達細胞標記情況。這種情況是不合乎需要的，因為與發育中胚胎的未分化ICM特性相同或基本相似的CICM才有可能是全能性的，從而在嵌合和核移植(NT)技術中有所用處。
因此本發明的目標是開發可保持或回復這些ICM細胞集落以使它們含有所期望的多層集落形態的培養方法。根據所描述的ICM集落的形態可以推論，應可分離出特定細胞并用于傳代，這些分離細胞有可能會生成具有所期望的多層形態的培養ICM。
如上面所提到的，觀察到盡管生長的ICM細胞集落開始完全是多層的，但它們很快變平并在集落中產生具有兩種截然不同的細胞群體的上皮細胞片。第一類群體包含于細胞集落的外周并具有多層結構，其中包括具有以下形態特征的細胞(ⅰ)細胞尺寸較小(直徑約為10-20μm，優選小于15μm的細胞)；
(ⅱ)可觀察到胞質小泡；和(ⅲ)細胞質/細胞核的體積比例較小(約10/90-50/50，優選約10/90-30/70，最優選約25/75)。
也發現該細胞集落的外圍部分對AP活性呈著色強陽性。相反地，集落中間的細胞趨向于含有極少或無AP活性的扁平上皮樣細胞。
基于可觀察到AP活性和多層結構，本發明人決定選擇性地僅對或基本上僅對細胞集落的外周細胞特別是細胞質體積/細胞核的體積比例較小、其中可觀察到胞質小泡并且細胞尺寸較小(如前文所限定)的細胞進行傳代，以期這些培養細胞可產生具有所期望形態的額外的多層CICM細胞集落。然而，這一結果還未完全確定。相反地，這種傳代反而可能產生完全由扁平上皮樣細胞組成的集落；當觀察到的上皮樣外觀和改變的細胞標記表達情況是在體外超延長期培養的結果或ICM細胞傳代的結果時尤為如此。
相當令人驚奇的是，本發明人發現，對包含于多層細胞集落外圍、具有上述形態特征的細胞選擇性地傳代，產生了ICM多層集落。除此之外，本發明人還驚奇地發現這些多層集落含有與發育中胚胎的ICM同樣或基本相似地表達細胞標記的細胞。而且，還發現本發明方法為理論上無限地生產與發育中的有蹄動物胚胎的ICM形態和表達細胞標記相同或基本相似的CICM提供了可能。按照本發明產生的CICM在培養的延長期間即經至少一次傳代、優選約5-10次傳代后、更優選約10-50次傳代后仍保持這類特性。
可通過已知的細胞分離方法對具有所需形態特征的細胞進行選擇性傳代。舉例說，可通過物理學途徑如利用玻璃吸管或細針將構成集落周邊的多層部分與集落中間部分分離，隨后可通過物理和/或化學和/或酶促方法進一步分離上面產生的大細胞團。例如，可利用酶如胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶實現細胞的分離。或者可通過利用細胞吸管反復吸取大的細胞群或細胞塊，或使用針或剃刀片將大細胞塊切成更小塊而對細胞進行機械分離。優選地，這樣的化學和/或機械細胞分離可產生適于傳代的CICM群，即包含約5-100個細胞的細胞群。
用于傳代的分離細胞優選由包含于細胞集落的多層周邊部分(優選具有上述形態特征)的細胞所組成。然而，在有些情況下，按本發明進行處理后，甚至來自細胞集落內部的細胞在傳代至新的飼養層上后也能產生多層集落。
人們認為造成這一現象是由于傳代過程或由于與新的飼養層之間重新建立了細胞-細胞間接觸而使細胞回復到所期望的多層集落。但是，本發明人不希望被他們的觀念所束縛。
在傳代過程中，有必要將小的ICM細胞或細胞群直接與飼養層接觸以阻止CICM集落分化。已發現如果這些細胞或細胞群生長時未與飼養層充分接觸，將會產生胚狀體。這樣的胚狀體可見于圖1中，該圖是一張顯示了未與飼養層充分接觸時生長的培養ICM細胞的照片。
為促使直接接觸，可使用能保證傳代CICM細胞和飼養細胞層間直接細胞接觸的任何方法，該方法對CICM是非降解性的，而且對集落產生沒有不利影響。效率最低的方法是簡單地將小細胞塊置于飼養層上面。更優選使用可確保CICM細胞和飼養層間更有效的細胞-細胞接觸的方法。已發現這樣能產生更多的多層CICM細胞集落。
可使用能促使CICM細胞和飼養細胞間形成更強的物理接觸的任何物理學方法，但這種方法應不是過分破壞性的，即對產生所需多層類型細胞和CICM細胞系沒有不利影響。舉例來說，可提高傳代的CICM與飼養層間直接接觸的方法包括利用吸管將單個的細胞塊壓到飼養層上；將CICM細胞群置于飼養層下面以使該細胞夾在飼養層和平板底部之間；以及將細胞塊離心到飼養層上，如在100-5000g離心約10分鐘-5小時以使細胞塊貼到飼養層上。這些方法僅僅是可用于迫使CICM細胞塊與飼養層緊密接觸的多種方法中的幾個示例。也可換用其它方法，只要那些方法對所期望的多層CICM細胞集落的形成沒有不利影響。如前面所論述的，還發現通過將CICM細胞與一些相連的飼養細胞一起傳代到新的飼養集落上可以進一步提高傳代效率。顯而易見，來自前代的一些飼養細胞的存在提高了產生新集落的CICM細胞塊的百分比。
一般說來，以上培養CICM細胞的培養方法適用于任何有蹄動物來源的CICM細胞。例如，最初發現適合培養豬CICM細胞的方法已發現也適用于牛CICM細胞。然而，可觀察到的一個區別就是來自牛胚胎的大部分細胞是AP陰性，而來自豬胚胎的那些細胞則是AP陽性的。推測牛和豬ICM在AP表達上可能存在種間差異。但這一假設尚未證實，因為本發明人已生產出一個具有弱AP陽性且以小團塊生長的牛細胞系(見圖2)。
而且，所述牛細胞與所述豬細胞不同之處還在于其集落邊界不易區分。然而，與豬來源的細胞相似，包含于集群周邊區的牛來源細胞是AP陽性的而集落中間的細胞則趨向于喪失AP活性。這一點也可通過重新參考圖2而觀察到。與豬來源的CICM類似，這些細胞是細胞角蛋白18陰性的。
如實施例所示和下文更詳盡的描述，本發明的CICM在異源DNA的引入中是有用處的。具體地說，已經獲得了基因組中包含有異源DNA(β-半乳糖苷酶DNA構建體)的轉基因CICM細胞系。本發明人最近使用上述培養方法也得到了與所述的CICM細胞在形態、分化能力、內源β-半乳糖苷酶活性水平(更高)和表達β-半乳糖苷酶DNA構建體的能力上稍微有些不同的細胞。另外，這些細胞從開始培養時就是AP陰性的，而前面提到的豬CICM細胞則是在培養過程中隨時間推移而趨向于失去AP活性。在來自于牛的CICM中也觀察到類似的細胞并對它們進行了增殖。盡管這些細胞沒有AP活性，它們還是呈現出一些與ICM細胞一致的特性。因此，它們在轉基因克隆胚胎的產生中、以及其它所說的CICM的應用中也可能是有用的。
本發明進一步提供了制備具有所期望的形態和細胞標記特征的培養ICM細胞和細胞系，如AP陽性和細胞角蛋白18陰性的CICM。這第二種方法也包括獲取和培養ICM(優選從飼養層培養物上的有蹄動物胚泡或前胚泡期胚胎)。優選的培養技術和傳代方法如上文所述。
然而，這第二種方法在事實上有所不同，其培養ICM細胞會表達分化抑制基因(DIgene)(更好是只在特定條件下進行表達)。為此，優選通過在培養或傳代過程中的某一階段將包含一分化抑制基因的核酸序列導入ICM細胞而完成，更好是該分化抑制基因在誘導型或可調型啟動子控制下進行表達。
如上文所提到的，DI基因指可抑制CICM細胞集落中細胞分化并且對分離具有所期望的形態特征和細胞標記表達的CICM細胞系不會有不利影響的任何一個或多個基因。可將DI基因(優選以適當的閱讀框架與可調型或誘導型啟動子有效連接)導入傳代過程中衍生CICM細胞系的胚胎細胞的核中，或者導入已建立好的CICM細胞系中。
可通過將DI基因(或準確地說是轉基因)整合入胚胎ICM或培養ICM細胞或細胞系的基因組中的方式而達到上述目的。將目的DNA引入哺乳動物細胞尤其是胚胎細胞的方法在本領域中是已知的，包括諸如顯微注射、電穿孔、脂轉染、逆轉錄病毒插入、鈣沉淀和脂質體插入等方法。到目前為止，顯微注射看起來是將DNA引入CICM細胞系的最有效方法。然而，我們認為其它的方法經適當的優化后也將是有效的。
適用于本發明的抑制基因包括諸如tsA58(見WO91/13150)、已知可抑制分化的其它T抗原和癌基因產物(見WO91/13150中的實施例)、OCT3(Okamoto等，細胞，60:461(1990),Rosner等，自然，345:686(1990))、LIF和LIF受體(Smith等，自然，336:688(1988))等。這些DI基因僅僅是可用于本發明的DI基因的一些例子。
優選將DI基因置于誘導型或可調型啟動子的控制下。正如所提到的，本領域熟知誘導型啟動子的例子，包括諸如金屬硫蛋白啟動子(金屬離子誘導型)，以及四環素、干擾素和類固醇的應答元件(見WO94/29442；Kimura等，細胞，44:261(1986)；Yarranton,Curr.Opm.Biotech,3:506(1992))。
轉移基因被整合入胚胎或培養ICM細胞或細胞系中，并在飼養細胞培養物上建立起由此得到的轉基因細胞后，通過誘導特定的誘導型啟動子可啟動DI基因。這通常是通過調整培養條件來完成。例如，如果該啟動子是金屬硫蛋白啟動子，則可通過加入含有適當的可誘導(啟動)該啟動子的金屬離子的培養基而進行誘導。因而，在誘導條件下培養時，該培養ICM細胞在組織培養物中應持續或長期保持所期望的CICM細胞形態和基因表達特征。更具體地說，所述細胞應該具有所期望的多層細胞集落形態，并與發育中胚胎的ICM表達細胞標記相同或基本相似，即通常這些細胞是AP陽性和細胞角蛋白(細胞角蛋白18)陰性。因此，應可以將諸如ICM細胞集落分化為AP陰性和細胞角蛋白18陽性的扁平上皮細胞片(當ICM在常規條件下培養時可觀察到這些現象)之類的問題減到最小或甚至消除。而且這也可以避免ICM細胞在傳代期間和維持培養期間發生分化。
用上述方法得到的培養ICM細胞和細胞系有許多用途。最特別的是，可將這些CICM細胞系用于產生具有全部或部分CICM遺傳組成的后代。
通過將CICM細胞直接注射入受體胚胎的囊胚腔中或將其與前胚泡期胚胎相結合，可獲得嵌合后代。隨后將由此產生的嵌合胚胎植入雌性受體中。由此獲得的后代在所有器官系統包括生殖器官的生殖細胞都應具有CICM的遺傳組成。因此，嵌合動物能將CICM遺傳信息傳遞給隨后的各代后代。而且導入的CICM可能在它們的基因組中引入了一個或多個目的基因，從而有可能獲得表達目的基因的嵌合后代。舉例說，可將能提供強化牲畜特性的基因如編碼激素的基因、提供疾病抗性的基因(如淋巴因子、病毒抗性基因、細菌抗性基因)、提高乳汁產量的基因、改變脂肪百分比的基因、增加體重的基因及其它強化特性的基因導入CICM中。同樣，也可導入編碼所需基因產物的基因，例如編碼產物對人類治療或異體移植有用的基因。
也可將本發明的CICM細胞用于核移植過程中，以獲得核移植的胚胎、胎兒和后代。核移植技術在本領域中是已知的，并且在本發明的背景中述及的許多參考文章中都有描述。特別可參見以下文獻Campbell等，Theriogenology,43:181(1995)；Colles等，Mol.Reprod.Dev.,38:264-267(1994)；Keefer等，Biol.Reprod.,50:935-939(1994)；Sims等，美國國家科學院院報，91:6143(1994)；Stice等，Theriogenology,43:301(1994)；Sims等，美國國家科學院院報，90:6143-6147(1993)；WO94/26884；WO94/24274和WO90/03432，這些文獻全文引入本文作為參考。同樣，如果此CICM參與發育成胎兒生殖細胞，那么它的遺傳信息就能被傳遞給隨后的各代動物。類似地，可對CICM細胞進行遺傳加工以在其基因組中整合入一個或多個所需基因，如可加強牲畜特性的基因，或編碼所需基因產物，如人類治療用或其它多肽的基因。
更進一步的是，可將核移植所產生的或來自嵌合胎兒或后代的分化細胞、組織或器官用于移植療法中。例如，來源于含有抗排斥作用基因的CICM細胞的核移植或嵌合胎兒可提供一個在補充或取代人造血干細胞方面有用處的造血細胞源。這有可能對免疫損傷的病人如愛滋病人或其它會影響造血干細胞的疾病患者是有用的。此外，干細胞可能在亨廷頓病(Huntington′s)、帕金森(Pakinson′s)病和阿爾茨海默病的治療中有用處。還有，胰腺細胞可能在糖尿病的治療中有用處。進一步移植的肝細胞可能在肝疾病的治療中有用處。或者，有可能可以將完整柔軟的器官從來源于已被遺傳學改變之CICM的有蹄動物中移植到人體內(見Durling等，Curr.Omp.Immunol.,6:765(1994))，此文已在此全部引入作為參考。
除上述作用之外，本發明的CICM細胞系還可用做分化的體外模型，尤其是用于參與早期發育調節的基因的研究中。
以上只是按照本發明的方法所獲得的CICM細胞系的可能應用中的一些范例。
本發明將在以下實施例中進一步描述。
實施例1按下述通用方法從前胚泡和胚泡期豬胚胎中生產CICM細胞系。首先，從12-16日齡的鼠胎兒中獲取胚胎成纖維細胞的原代培養物。無菌切除其頭、肝、心臟和消化道后，將胚胎切碎并在已預熱好的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO,Grand Island,NY)中37℃保溫30分鐘。將成纖維細胞鋪于組織培養板中，并在補充有10％胎牛血清(FCS)(Hyclone,Logen,UT)、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(50ug/ml)的α-MEM培養基(Bio Whittaker,Walkersville,MD)中培養。傳代3-4天后，將35×10 Nunc培養板(Baxter Scientific,McGaw Park,IL)中的胚胎成纖維細胞經配制于補充α-MEM培養基的絲裂霉素C(10ug/ml,Sigma)處理至少3小時。成纖維細胞是在37℃，空氣中含5％CO2的潮濕氣氛下培養和維持的。僅將具有厚且長滿的單層細胞的培養平板用于培養CICM細胞系。對于獲取和增殖未分化CICM細胞系來說，飼養層的特性是一個重要因素。
從死后或外科剖腹術中的豬生殖道中外科手術式地收集豬胚胎。胚泡期胚胎的ICM或者用切割針從滋養層細胞中部分分離，并用胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶消化，或者任由其以完整形式存在。將ICM和至少一部分滋養外胚層直接鋪到經裂霉素C阻斷的成纖維細胞上，常用一玻璃吸管來起始ICM和成纖維細胞飼養層之間的接觸。在含有補充了10％胎牛血清(FCS)和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)的α-MEM的生長培養基中維持CICM細胞系。每2-3天更換生長培養基一次。培養至第4天可觀察到初始集落，并可在第5天后的任何時間對其傳代。只分離具備以下三個形態特征的細胞用于傳代細胞質/細胞核的體積比例較小、具有胞質小泡和單個細胞通常較小(直徑小于15μm)。這些細胞常常分離自與飼養層保持直接接觸的集落的多層部分。在傳代到新的飼養層上后，符合上述標準的集群部分常為AP陽性和細胞角蛋白陰性的。
當此ICM或傳代的CICM細胞開始附著到飼養層上時，經兩天培養后可見由小細胞組成的多層集落，如圖3所示。這些多層集落是AP陽性和細胞角蛋白陰性的(見圖4和圖5)。但是，有些集落開始形成上皮樣細胞片。此上皮樣細胞是AP陰性和細胞角蛋白陽性的(圖6和7)。此外，在體外增殖時，多層集落經常開始變平成為上皮細胞片(圖8)。
本發明人觀察到，正在生長的多層集落開始變扁平，集落內形成具有兩種截然不同的細胞群體的上皮細胞片。第一種細胞群體位于集落的周邊區域，集落的這一部分是多層的，而且單個細胞較小并具有胞質小泡(圖8)。這一區域對AP活性的著色也呈陽性。集落的另一區域包含扁平上皮樣細胞群體。這些細胞趨向于位于集落中間。在顯微鏡下觀察該集落時，能看到這一細胞群體中的單個細胞和細胞邊界(圖8)。同樣，這些細胞具有極小的或根本沒有AP活性。
推測為了維持所需的多層型細胞，優選選擇性地僅對周邊的細胞進行傳代以產生額外的多層集群。
利用玻璃吸管、剃刀或針切出集落的多層部分(周邊細胞)很可能可以完成上述工作。可通過機械分離或利用胰蛋白酶(0.05％胰蛋白酶/0.2％EDTA)與機械分離相結合的方法對大塊細胞進一步破碎。機械分離是通過用小孔徑吸管反復上下吹吸細胞大團塊來進行。或者可利用針或剃刀片將大塊細胞切成小塊。令人驚奇的是，通過所有這些方法所獲得的CICM塊(5-100個細胞)隨后可傳代到新的飼養層上從而產生具有所需多層形態的培養物。在有些情況下，經過上述同樣方式處理，甚至來自集落內部的細胞在傳代到新的飼養層上后也能產生多層集落。估計這是由于傳代過程或由于與新飼養層之間重新建立了細胞與細胞的接觸，從而使這些細胞回復到多層集落狀態。
我們觀察到必須將這些小塊細胞重新置于與飼養層直接接觸的狀態才能阻止CICM集落的分化。反之，與飼養層無接觸的狀態下生長的細胞則形成了胚狀體(圖1)。有幾種方法可用于重新起始培養細胞與飼養層的接觸。效率最低的方法是將細胞培養平板放回到培養箱中后，讓小團細胞自然沉降到飼養層表面上。優選的方法包括迫使CICM細胞與飼養層之間發生細胞與細胞接觸。由此能產生更多的新形成的CICM細胞集落。迫使細胞與細胞接觸的一種方法是用吸管將單個細胞團按壓到飼養層頂部。另一方法是將CICM細胞團置于飼養層下面以迫使這些細胞處于飼養層和培養板底部之間。還有另一種方法是通過在100-5000g對飼養層頂部的細胞團離心10分鐘-5小時以迫使這些細胞貼在飼養層上。基本上，可迫使傳代的CICM細胞團與飼養層緊密接觸的任何方法都會得到具有所需多層形態的CICM細胞集落的生成。此外，如前面所述，通過將CICM細胞與一些相連的飼養細胞一起傳代到新的飼養層上可進一步提高傳代效率。
實施例2將按照實施例1所得到的CICM細胞用于插入異源DNA。具體地說，將包含有置于β-半乳糖苷酶基因和/或新霉素磷酸轉移酶基因之前的不同啟動子的線性及超螺旋DNA構建體顯微注射到這些細胞中。所用的具體啟動子是巨細胞病毒啟動子(CMV啟動子)、磷酸甘油酸激酶啟動子(PGK啟動子)、乳腺啟動子(MAM啟動子)、reCMV啟動子和雞β-肌動蛋白啟動子。這些基因構建體被稀釋于緩沖液(含有80mM KCl和70mMHEPES)中。然而，也可換用其它緩沖液，如Tris-EDTA。溶液中的DNA構建體的濃度是5-10μg/ml。但0.1-100μg/ml的濃度都應該是有效的。然后將這些DNA制備物顯微注射入按實施例1得到的培養CICM細胞中。
在此過程中，通過倒置顯微鏡對集落進行觀察而對集群內的單個CICM細胞進行定位。此后，用一帶有DNA制備物的小注射針單獨刺穿細胞膜或附帶著刺穿核膜。針頭開口約1μm。選用這種直徑的針以避免CICM細胞裂解。此外，通過使用附著于倒置顯微鏡的顯微操作儀可簡便地進行顯微注射操作。
將注射針管插入核內后，注入近700拷貝的DNA到核中。隨后將微吸管移離細胞。對CICM集落中的其它細胞重復這一處理過程。在理想的情況下，每小時可顯微注射1000個細胞。
使用不同的啟動子得到的結果總結于下表中。顯微注射的CICM細胞中異源基因的表達
以上結果表明，含有任一種被檢測啟動子的載體均得到了可表達所插入的異源DNA的細胞。還觀察到幾個構建體一起顯微注射對基因表達無任何加和效果。
圖9是含有CMVβ-半乳糖苷酶構建體的顯微注射的豬CICM細胞的X-gal染色結果。照片中可觀察到表達β-半乳糖苷酶的細胞群。這表明β-半乳糖苷酶基因已被有效地摻入到細胞基因組中，并在子細胞中不斷傳遞和表達。
上述結果是用豬CICM細胞得到的。此外，用類似方法，也將CMV和PGK-β-半乳糖苷酶構建體注射到牛CICM細胞中。這兩種DNA構建體均得到了可表達β-半乳糖苷酶的細胞。
因此，這些結果表明，可將按照本發明所培養的CICM成功地用于所需異源DNA的整合和表達中。同樣，這些基因表達特性可傳遞給子細胞。
實施例3在這種培養方法中，DI基因條件性地在CICM細胞集落中表達以阻止細胞的分化。細胞傳代和培養技術與實施例1中所用的相同，但CICM細胞的基因組成有所不同。具體地說，此處DI基因被導入到衍生CICM細胞的胚胎細胞的細胞核中，或已建好的CICM細胞系中。隨后將轉基因整合到CICM細胞的基因組中。任何已知的、可將轉基因導入胚胎細胞的方法都可使用，包括諸如顯微注射、電穿孔、逆轉錄病毒插入、鈣沉淀和脂質體插入等方法。
插入的轉基因在誘導型啟動子的控制下表達。誘導型啟動子包括諸如四環素(WO94/29442)、干擾素(Kimura等，1986)、類固醇和金屬硫蛋白(Yarranton,1992，綜述)等的應答元件。相應地，DI基因的插入的方式使其以適當的閱讀框架與誘導型啟動子有效相連。
嵌合基因構建體整合到胚胎細胞的基因組中并且建立起多層ICM細胞集落后，通過誘導型啟動子進行誘導可促使DI基因表達。這種表達使ICM細胞集落持續地、或在組織培養的延長期間維持所期望的多層形態，并表達與發育中胚胎的ICM一致的基因。這樣，可將諸如細胞分化為失去AP表達并表達細胞角蛋白18的扁平上皮細胞片之類的問題減到最小，或甚至可以完全避免。這一方法也可有效用于阻止在長期培養期間發生的細胞分化。
盡管本發明已通過某些具體實施方案進行了描述，應理解本領域技術人員能對其進行許多改進和改變而不背離本發明的精神。因此所附權利要求涵蓋在本發明實質和范圍內的所有改進和改變。
權利要求
1．用于產生培養內細胞團(CICM)細胞的方法，包括以下步驟(ⅰ)獲取胚泡的ICM或前胚泡期胚胎的ICM祖細胞；(ⅱ)在可保證形成多層細胞集落的條件下，于飼養層培養物上培養所說的ICM或ICM祖細胞；(ⅲ)從包含于培養ICM細胞集落內的細胞中鑒別出具有以下特性的細胞(a)細胞質/細胞核的體積比例較小；(b)具有胞質小泡；(c)相對細胞集落的其余部分來說單個細胞較小；(ⅳ)從細胞集落的余下部分中分離出一個或一群所說的鑒定好的細胞；和(ⅴ)在可使飼養細胞層與分離細胞或細胞群之間至少存在一些物理接觸的條件下，將所說的已分離的ICM細胞或ICM祖細胞傳代到另一飼養層培養物上。
2．按照權利要求1的方法，其中所說的在步驟(ⅰ)中獲得的ICM包括至少一部分滋養外胚層。
3．按照權利要求1的方法，其中的飼養細胞層包含成纖維細胞。
4．按照權利要求3的方法，其中所說的成纖維細胞是小鼠胚胎成纖維細胞。
5．按照權利要求4的方法，其中所說的小鼠胚胎成纖維細胞是原代細胞。
6．按照權利要求3的方法，其中所說的成纖維細胞包含一厚且長滿的單層。
7．按照權利要求1的方法，其中用于促使分離的培養ICM細胞和飼養細胞層間產生物理接觸的方法選自由下述組成之組(ⅰ)將分離后的ICM細胞置于飼養細胞層上；(ⅱ)將CICM細胞群擠壓到飼養層上；(ⅲ)將CICM細胞群置于飼養細胞層和培養板之間；和(ⅳ)將CICM細胞或細胞群離心到飼養細胞層上。
8．按照權利要求1的方法，其中分離出的已鑒定好的細胞包含于多層CICM細胞集落的外圍部分。
9．按照權利要求8的方法，其中所說的分離細胞還包括一些包含于細胞集落內部上皮樣部分的細胞。
10．按照權利要求1的方法，其中至少利用以下方法之一從集落中分離已鑒定好的細胞物理的或化學的或酶促方法。
11．按照權利要求10的方法，其中所說的物理方法包括使用玻璃吸管、皮下針或剃刀片。
12．按照權利要求11的方法，其中還包括用胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶處理分離后的細胞。
13．按照權利要求1的方法，其中所說的分離細胞包含約5-100個細胞的細胞群。
14．按照權利要求1的方法，其中重復進行了步驟(ⅱ)至(ⅴ)。
15．按照權利要求1的方法，其中細胞質/細胞核比例為約10/90-50/50。
16．按照權利要求15的方法，其中所說的比例約為25/75。
17．按照權利要求1的方法，其中細胞大小為直徑約10-20μm。
18．按照權利要求2的方法，其中細胞直徑小于約15μm。
19．來源于胚泡ICM，或來源于有蹄動物胚胎前胚泡期的ICM祖細胞的培養內細胞團細胞(CICM細胞)，其中所說的培養內細胞團在培養中保持一定的形態特征并與發育中的有蹄動物胚胎的ICM相同或基本相似地表達細胞標記。
20．按照權利要求19的CICM，其表達堿性磷酸酯酶。
21．按照權利要求19的CICM，其不表達細胞角蛋白18。
22．按照權利要求19的CICM，其中所說的細胞在組織培養中呈現多層集落形態。
23．按照權利要求21的CICM，其中所說的多層集落形態含有一內部上皮型部分和一多層部分，該多層部分基本上圍繞著所說的上皮樣部分。
24．按照權利要求19的CICM，其中所說的有蹄動物胚胎來源于選自豬、牛、綿羊、馬和山羊的一種有蹄動物。
25．按照權利要求24的CICM，其中所說的有蹄動物是豬。
26．按照權利要求24的CICM，其中所說的有蹄動物是牛。
27．從權利要求19的CICM中獲得的培養內細胞團細胞系。
28．按照權利要求19的CICM，其含有一個或多個可抑制所說的CICM分化的基因。
29．按照權利要求28的CICM，其中所說的基因選自下述基團tsA58、OCT3、LIF、LIF受體、FGF-5、REX-1和其它癌基因產物、T抗原、細胞因子和轉錄因子。
30．按照權利要求10的CICM，其含有一段已整合至其基因組中的異源DNA。
31．按照權利要求30的CICM，其中所說的異源DNA編碼選擇性標記。
32．按照權利要求30的CICM，其中所說的異源DNA編碼所需多肽。
33．可獲得在組織培養延長期間呈現一定的形態特征并與分化的有蹄動物胚胎ICM一致或基本相似地表達細胞標記的培養內細胞團細胞的一種方法，該方法包括(ⅰ)獲得有蹄動物ICM細胞或已建好的培養有蹄動物ICM細胞系；(ⅱ)將一個或多個可抑制所述ICM細胞或細胞系分化的基因(DIgene)導入所說的ICM細胞或已建好的培養ICM細胞系的核中；(ⅲ)在可抑制分化并允許形成多層細胞集落的條件下，在合適的飼養細胞培養物上培養上述所產生的轉基因有蹄動物ICM細胞或細胞系。
34．按照權利要求33的方法，其中所說的DI基因選自下述基因tsA58、OCT3、LIF、LIF受體和其它癌基因產物或T抗原。
35．按照權利要求33的方法，其中所說的DI基因是在一誘導型啟動子的控制下表達的，且培養條件包括可誘導所說啟動子的那些條件。
36．按照權利要求33的方法，其中對所說的細胞進行了傳代。
37．按照權利要求36的方法，其中所說的傳代方法包括(ⅰ)在可允許多層細胞集落形成的條件下，于飼養層培養物上培養所說的ICM；(ⅱ)將顯示以下特性的細胞從培養ICM細胞集落中鑒定出來(a)細胞質/細胞核的體積比例較小；(b)具有胞質小泡；(c)相對于細胞集落其余部分而言單個細胞較小；(ⅲ)通過合適途徑從細胞集落的其余部分中分離出所說的已鑒定好的一個或一群ICM細胞；和(ⅳ)在可使飼養細胞層和分離細胞或細胞群之間至少存在一些物理接觸的條件下，將上述分離的培養ICM細胞傳代到另一飼養層培養物上。
38．按照權利要求33的方法，其中在步驟(ⅳ)中，所述分離的傳代ICM細胞中包含一些相連的飼養細胞。
39．按照權利要求33的方法，其中所述有蹄動物胚胎是來自選自豬、牛、綿羊、山羊和馬的有蹄動物。
40．按照權利要求39的方法，其中所說的有蹄動物是豬。
41．按照權利要求39的方法，其中所說的有蹄動物是牛。
全文摘要
本發明提供了來自有蹄動物尤其是豬和牛的新的培養內細胞團細胞和細胞系,以及它們的制備方法。在延長培養期間,本發明中的培養內細胞團(CICM)具有與未分化的發育中胚胎的內細胞團相似的形態,還與其相同或基本相似地表達細胞標記。可將異源DNA導入本發明的培養內細胞團(CICM)細胞和細胞系中以產生對轉基因胚胎、胎兒和/或后代生產有用的轉基因細胞,例如,通過核移植方法。
文檔編號C12N15/09GK1219198SQ9719475
公開日1999年6月9日 申請日期1997年3月24日 優先權日1996年4月1日
發明者S·L·斯蒂克, P·J·戈盧克 申請人:馬薩諸塞大學馬薩諸塞州高等教育公立研究所