專利名稱：用于貯存和分析遺傳物質的干固體介質的制作方法
技術領域：
本發明領域涉及以適于貯存或隨后分析形式用于收集遺傳物質的一種干固體介質和方法。本發明進一步提供貯存遺傳物質的分析，包括適用于自動化分析系統的方法。
背景待分析的含有遺傳物質(包括DNA或RNA)的血液，通常由采自人或動物的采血地點，以純化的遺傳物質、液態全血、冷凍全血或干于紙上的全血的形式運送到分析地點。但是，所有這些方法都有缺點。血液中遺傳物質以干的提純的遺傳物質運輸是最稱心的，但它需要從人或動物采血處有可用的高標準技術援助。當在采血地點無技術援助可用時，通常將全血或其它未提純的樣品送到中心實驗室，在該處提純遺傳物質。
液態全血的運輸通常包括必需無菌收集。在某些情況下，例如樣品是自嬰兒腳后跟針刺取樣時，這是極其不方便的。液態全血或冷凍血液的運輸可能還需要溫度受控的運輸或正規的郵政系統之外的運輸系統。甚至在考慮公共衛生關系之前，也是如此。此外，涉及與全血相關的病原體，諸如HIV，除了是在適當的和耗資的監督情況下，一般是拒絕運輸潛在傳染性液態或冷凍樣品的。
在濾紙上干燥的血的運輸被證實是上述步驟的一種可替代步驟。遺傳物質能從干于濾紙上的全血斑點提取和分離出來，其形式以及足夠的量適用于遺傳分析。McCabe，E.R.B等報道“從濾紙吸印紙上的血斑進行DNA微量提取潛在篩選應用于新生兒篩選”Hum.Genet.第75卷，第213-216頁(1987)。但是，此步驟仍有許多缺點，例如，通常沒有仔細和迅速地破壞與血相關的微生物。病原微生物的存在對處理血的全體人員可能造成一種潛在的危險。此外，某些微生物可能對遺傳物質造成損害。雖然通過干燥可以對微生物產生某種抑制，但已知緩慢干燥，或者甚至是在高相對濕度條件下細微程度的再水化，可以允許能破壞DNA或RNA的微生物區系生長。
用現行方法對血液中遺傳物質干運輸的另一個缺點是缺乏對降解遺傳物質過程的有意抑制。因此，甚至在有抑菌劑存在時，仍有條件允許遺傳物質的酶促、非酶促和自溶性損壞。此外，利用現在可行的干貯存方法，若需要解附高分子量DNA或RNA會遇到相當大的困難。表面吸附影響能造成遺傳物質的喪失，這可能會引起最少降解的、即最想要的一類DNA或RNA分子優先喪失。
因而需要一種安全、方便和最低勞動強度的方法來貯存液態樣品中所含的遺傳物質。
但是，即使一種遺傳物質樣品以一種安全、方便而且可靠的貯存方式收集起來，但對貯存樣品的隨后分析可能會產生計算上的問題。當在一種收集的樣品上進行許多不同類型的分析時，尤其如此。當多種樣品提交分析時，計算趨向于變得更復雜些。
例如，用于特殊遺傳序列的某些遺傳物質分析方法，諸如聚合酶鏈反應(PCR)分析，需要使用一種寡核苷酸的引物對。通常每一次進行的序列分析使用一種不同的引物對，而且因為有極其大量可能的引物對(例如，人、動物和所有其它生物有機體，包括人和動物的病原體的基因內每一序列都有一引物對)，在一種單個樣品中的多種序列分析可能產生巨大的計算問題。當接受遺傳物質的多種樣品來分析時，諸如在中心分析實驗室，這些問題可能會更大些。
遺傳物質的自動化分析對處理大量的樣品提供較高的效率。但是，含遺傳物質的一種樣品的自動化分析，仍需要自動化系統對每一套不同的引物具有分開的傳送設備，以防止交叉污染的發生。因此，能同時進行遺傳序列分析的范圍，由于引物交叉污染的內在問題而可能受到限制。因此，需要用自動化系統減少分析遺傳物質多種序列或多種樣品時的限制。
發明概述本發明為貯存和分析液體介質中所含的遺傳物質提供一種安全、方便和最低勞動強度的設備和方法。本發明進一步為遺傳物質的貯存提供這樣一種方式，以便容許利用自動化系統來簡化一種或多種遺傳物質樣品的分析。
本發明包括一種用于貯存遺傳物質樣品的干固體介質。本發明的干固體介質是由一個固體基質和一種組合物所組成，當將組合物應用于干固體介質時能保護貯存在干固體介質上的遺傳物質免遭降解。干固體介質同可進一步提供條件使微生物失活，包括那些可能對人有可能致病的微生物。
干固體介質的組合物可以包括一種弱堿、一種螯合劑和一種蛋白變性劑，諸如一種去污劑。在另一實施方案中，若希望長期貯存遺傳物質樣品，該組合物可以進一步包括一種自由基捕集劑。
按照本發明，貯存于干固體介質上的遺傳物質可以用本領域已知的方法進行分析，例如聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、逆轉錄酶起始的PCR、DNA或RNA雜交技術(包括限制性片段長度多態性(RFLP)和其它利用基因探針或DNA或RNA探針的技術)、基因組序列分析、酶測定、親和標記、利用標記或抗體進行檢測的方法以及其它類似的方法。
貯存在本發明干固體介質上的遺傳物質可以進行原位分析或從干固體介質分離后進行分析。
在本發明的另一實施方案中，本發明的干固體介質可以包含一種組分，它在貯存的遺傳物質樣品的隨后分析中起作用。按照該實施方案，用于隨后分析的一種組分包括例如，核苷酸序列(諸如PCR引物)、靶序列穩定劑、基因探針、用于基因測序的引物或用于LCR分析的多套寡核苷酸底物。正如于此公開的，用于隨后分析的化合物還可以包括一種適當穩定的酶。
本發明也提供使用干固體介質的方法。在一實施方案中，本發明提供了以一種基本上未降解的形式在干固體介質上貯存一種遺傳物質樣品的方法。本發明還提供了貯存和隨后分析一種貯存的遺傳物質樣品的一種方法。在一個優選實施方案中，貯存的遺傳材料在分析之前可洗滌，以除去可能與遺傳材料樣品相聯的一些化合物和可能抑制隨后分析的化合物。這樣的化合物包括例如蛋白質、血紅蛋白以及干固體介質組合物的組分。本發明提供了利用一種含水或非水的洗滌系統洗滌貯存的遺傳材料的方法。
用于洗滌遺傳材料樣品的含水或非水洗滌系統，最好達到去除可能抑制隨后分析的化合物，而基本上不影響貯存的遺傳材料或可能包含在干固體介質上并可用于隨后分析的組分。此外，本發明的含水或非水洗滌系統還可用于洗滌貯存在例如固體基質上的遺傳材料，該固體基質未吸著本發明的組合物。
在一實施方案中，本發明的非水洗滌系統提供使本發明的干固體介質上貯存的遺傳材料樣品與于此描述的單相酚溶液的接觸。將單相酚溶液除去，并將含有遺傳材料樣品的干固體介質隨后與含水酒精洗滌溶液相接觸。除去含水酒精洗滌溶液，遺傳材料樣品可以進一步用含水的離子溶液洗滌。然后將洗滌后的遺傳材料樣品用本領域已知的方法(包括上述的那些方法)進行分析。
含水洗滌系統是本領域已知的。在某些情況下，一種洗滌系統可能引起包含在本發明干固體介質上并可用于隨后分析的組分的一些損失。在本發明的一實施方案中，于此公開的保留劑可用來減少在遺傳材料樣品處理期間用于隨后分析的一種組分的損失。
本發明干固體介質上貯存的遺傳材料樣品還可用標準的酶促試驗進行分析，例如用于檢測苯丙酮酸尿癥(PKU)或半乳糖血癥的酶促試驗，最好在用例如于此公開的轉化劑溶液(converter solution)中和干固體介質中使蛋白質變性組分的作用后，再進行酶促試驗。
干固體介質以及包含一種用于隨后分析的組分的干固體介質，對利用自動化系統分析遺傳物質樣品是特別有用的。
附圖簡述

圖1由貯存在本發明干固體介質上的血液樣品所得的PCR擴增DNA的溴化乙錠染色的凝膠照片。
圖2由貯存在本發明干固體介質上的血液樣品所得的PCR擴增DNA(包括用于PCR分析的寡核苷酸引物)的溴化乙錠染色的凝膠照片。
圖3貯存于本發明干固體介質上經EcoRI消化的人血DNA的溴化乙錠染色的凝膠照片。
發明的詳細描述本發明提供了在形式上適宜于貯存或隨后分析收集的遺傳物質的一種干固體介質。本發明還提供了收集在本發明干固體介質上的遺傳物質的隨后分析方法。于此公開的干固體介質和使用方法，通常提供了一種安全、方便而且可靠的、并考慮到精確分析結果的貯存遺傳物質樣品的介質。此外，例如在中心分析實驗室利用自動化系統分析多種樣品時，本發明還提供較高的分析效率。
在貫穿于本說明書的幾個地方，通過實例一覽表提供指導。本發明人希望清楚地表明的是，列舉的表僅用作代表性的一組，但它并不意味著列舉的那些實例是排他性的。
在此所用的短語“遺傳物質”(GM)是指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)中的任一種或者是兩者。按照本發明，通過由來源取樣，并把樣品加到于此描述的干固體介質上，將一種GM樣品收集在本發明的干固體介質上。將GM樣品由來源取樣的方法是本領域已知的。例如，血液中的一種GM樣品可由人或動物來源通過靜脈穿刺取樣，然后將取樣的樣品加到本發明的干固體介質上。
此處所用的“遺傳物質樣品”或“GM樣品”包括一種液體(它含有溶解的、懸浮的、混合的或者以其他形式在其中含有DNA或RNA或兩者都有)、含有DNA或RNA或兩者的細胞，或是含有DNA或RNA或兩者的細胞組分。一旦GM樣品加到干固體介質上，液體趨向于蒸發(蒸發可通過本領域已知的干燥方法例如一種暖風干燥器來增強)而使攜帶的DNA或RNA以干燥形式留在干固體介質上。以“干燥形式”留在干固體介質上的GM可以是提純的DNA或RNA、半提純的DNA或RNA、或者是在細胞中的DNA或RNA。
加到干固體介質上的GM樣品可以得自任何來源。這包括例如生理/病理體液(例如分泌物、排泄物、滲出物和漏出物)或人和動物的細胞懸浮液(例如血液、淋巴液、滑液、精液、含有口腔細胞的唾液、皮屑、發根細胞等)；植物的生理/病理液體或細胞懸浮液；細菌、真菌、質粒、病毒等的液態產物、提取物或懸浮液；包括蠕蟲、原生動物、螺旋體等寄生物的液態產物、提取物或懸浮液；人或動物軀體組織(例如骨、肝、腎等)的液態提取物或勻漿；來自DNA或RNA合成的媒介；用化學法或生物學法合成的DNA或RNA的混合物；以及DNA或RNA在或可能在一種液態媒介中的任何其他來源。
本發明的干固體介質是供GM樣品的貯存或隨后分析用的。干固體介質是由一種固體基質所組成的，在其上已吸著一種能保護貯存在介質上的GM免遭降解的組合物。該組合物也能使微生物失活。這包括與GM樣品相聯的微生物，它可潛在地使GM樣品降解或可潛在地對貯存的GM樣品的處理者有致病性。
一種干固體介質和一種吸著在固體基質上的組合物公開在國際專利申請PCT/AU89/00430(WO 90/03959)中，它通過引用結合到本文中。
在此使用的術語“用來貯存的”“(Storing)”、“貯藏”“(Storage)”、“被貯存的”“(Stored)”以及“貯存”“(Store)”這字的其他衍生詞是指GM以一種適合于隨合分析或未遭到實際降解的形式進行保存。按照本發明，GM的貯存時間周期可短至將GM樣品由取樣處轉移到隨后進行分析地點所必需的時間。GM樣品能貯存在本發明干固體介質上的條件是可變的。樣品通常貯存在由-200℃至40℃的溫度范圍內。此外，貯存的樣品可以可選地貯存在干的或干燥的條件下，或貯存在隋性氣體中。貯存可以是幾秒鐘直到許多年，最好是大約幾秒鐘直到100年。
在本發明的另一實施方案中，干固體介質還能包括一種組分，它是在對貯存的GM樣品上進行的隨后分析中起作用的。可以對貯存在干固體介質上GM樣品進行的隨后分析包括本領域已知的分析方法，例如聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、逆轉錄酶起始的PCR、DNA或RNA雜交技術(包括限制性片段長度多態性(RFLP)以及利用基因探針(DNA或RNA)的其他技術)、基因組序列分析、酶測定、親合標記、利用標記或抗體的檢測方法以及其它類似的方法。此外，本發明人認識到許多新的分析和診斷方法在將來可能被開發出來，本發明的干固體介質和方法對它們可能是合適的，這些方法在這里所附的權利要求書的精神和范圍內。
對于貯存的RNA，特別是不穩定的RNA，可包含在干固體介質上用于隨后分析的一種組分能保護RNA免受降解。這種組分包括RNA酶抑制劑和滅活劑、基因探針、互補DNA或RNA(或功能相同的化合物)、蛋白質以及穩定RNA或阻止其降解的有機部分。
一般地講，本發明的干固體介質也是一種適用于貯存一種組分的介質，該組分可用于隨后分析，并可包含在干固體介質上。
一旦GM被收集在干固體介質上，它能被包入保護材料(例如一種塑料膜)中，后者能進一步保護GM在貯存期間免受降解。貯存在本發明的干固體介質上GM的隨后分析可在原位進行，另一方法是在隨后分析前，可首先從干固體介質取出GM。I.干固體介質本發明的干固體介質提供了將GM帶到干固體介質上的方法。此處所用的術語“帶”“(entrain)”及其衍生詞是指在貯存期間GM被結合到干固體介質上，而基本上不依賴離子的、共價的或范德華的相互作用。于此所用的“基本上不依賴”是指這種相互作用在使GM保持在干固體介質上可能不是一種重要的因素。最好離子的、共價的或范德華的相互作用對將GM帶到干固體介質上是非必需的。
本發明的干固體介質包括一種吸著到固體基質的組合物。于此所用的術語“吸著”是指本發明的組合物被吸收、吸附或摻入或摻到固體基質上，使得不容易從基質移開，除非遭受到有意或不慎從固體基質移開吸著的組合物的條件。吸著的組合物在正常的貯存條件下最好不容易移去。
適用于本發明干固體介質和方法的固體基質，包括將組合物吸著到其上的任何材料，而且該材料不抑制加到干固體介質上GM的貯存或隨后分析。這包括一種二維平而干的基質或三維基質，諸如與粘合劑結合而形成一個小團或小塊的一種基質，而組合物則被吸著在其上。
在一種優選的實施方案中，固體基質具有多孔性質，以將GM帶至干固體介質上。一種適合于此目的的固體基質包括(但不限于)一種基質，它是以基于纖維素(例如，纖維素、硝化纖維素或羧甲基纖維素紙)的親水性聚合物，包括合成的親水性聚合物(例如聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物)、聚四氟乙烯(EmporeTM、3M，圣保羅、明尼蘇達)、纖維玻璃以及多孔陶瓷。
按照本發明，GM也可收集在缺乏下述本發明組合物的固體基質上。此外，用于GM樣品隨后分析的組分也可包含在缺乏本發明組合物的固體基質上。此外，利用下述含水的或非水的提取步驟，可將血紅蛋白、蛋白質或其它與GM樣品相聯的化合物從貯存在固體基質上的GM樣品中除去，這些化合物可以包括或可以不包括一種用于貯存的GM隨后分析的組分。但是，由于僅使用一種固體基質貯存GM，本發明組合物保護GM不受降解和使微生物失活的作用可能不存在。
為了制備一種本發明的干固體介質，將一種保護GM免受降解的組合物吸著到固體基質上。此處所用的短語“保護GM免受降解”是指本發明的干固體介質使貯存的GM保持在基本上未降解的形式。這使GM樣品適合于進行許多不同類型的隨后分析步驟。保護GM不受降解可包括保護GM不受由于GM受損事件造成的實質損壞，諸如化學試劑或生物學因素(包括細菌、自由基、核酸酶)、紫外輻射、氧化劑、烷化劑或酸性試劑(例如空氣中的污染物質)所引起的損壞事件。
吸著到本發明固體基質中的組合物可包括一種或多種弱堿、螯合劑或蛋白質變性劑，諸如去污劑或表面活性劑。此外，吸著到干固體介質上的組合物還可以包括一種自由基捕集劑。
于此所用的“自由基捕集劑”是一種化合物，它作為一種與自由基的反應物，所具有的充分反應性超過了DNA分子或其組分所具有的反應性，而且它足夠穩定，本身不會產生有破壞性的自由基。
此處所用的適合于發明組合物的“弱堿”可以是路易氏堿，它的pH值大約是6-10，最好是約為pH8-9.5。弱堿的一種功能是可用作緩沖液以維持組合物的pH約為6-10，最好是約為pH8.0-9.5，例如pH8.6。因此一種適合于本發明組合物的弱堿與組合物的其它組分相結合時，提供組合物的pH為6至10，最好是約為pH8.0至9.5。按照本發明，合適的弱堿包括有機堿和無機堿。合適的無機弱堿包括例如，一種堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽或硼酸鹽(例如碳酸鈉、碳酸鋰或碳酸鉀)。合適的有機弱堿包括例如，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙醇胺、三乙醇胺和甘氨酸以及有機酸的堿性鹽(例如檸檬酸三鈉)。一種推薦的有機弱堿是一種弱的單價有機堿，例如Tris。弱堿可能或者是一種游離堿，或者是一種鹽，例如碳酸鹽。
雖然本發明人不希望局限于一種單一的理論，但相信弱堿可提供多種功能，包括保護GM免受降解。除了提供一種緩沖液系統外，相信弱堿還能起到保證下述螯合劑在結合金屬離子時起恰當的作用。此外，弱堿還可防止酸性核酸酶的作用，該酶起作用可能不完全依賴于二價金屬離子。
干固體介質的組合物也可以包括一種螯合劑。于此所用的一種螯合劑是能絡合多價離子的任何化合物，多價離子包括第II族和第III族多價金屬離子和過渡金屬離子(例如Cu、Fe、Zn、Mn等)。按照本發明，一種推薦的螯合劑是一種強螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)。螯合劑諸如一種檸檬酸鹽或草酸鹽對本發明也是合適的。螯合劑可在將GM樣品加到干固體介質的同時加到組合物中去。
雖然本發明人不希望局限于一種特殊的理論，但相信本發明螯合劑的一種功能是結合多價離子。多價離子若與貯存的GM一起存在時，就能參與使GM受到損壞的過程。能被螯合劑螯合的離子包括多價的活性金屬離子(例如鎂和鈣)以及過渡金屬離子(例如鐵)。鈣和鎂二者都已知通過作為能破壞GM的酶(例如最著名的核酸酶)的輔因子而促進GM降解的。此外，過渡金屬離子(諸如鐵)能輕易地經受氧化和還原，并且通過產生自由基或通過直接氧化而破壞核酸。
干固體介質的組合物還可以包括一種蛋白質變性劑。于此所用的一種蛋白質變性劑所起的作用是使非GM化合物變性，例如使與貯存的GM相聯的蛋白質變性。若蛋白質變性劑是一種去污劑或表面活性劑，表面活性劑也能起潤濕劑的作用，以利于樣品被干固體介質所吸收。術語“表面活性劑”和“去污劑”是同義的，并可以在整個說明書中互換使用。按照本發明，使蛋白質變性而不實質上影響GM樣品的任何試劑都可適合于本發明。推薦的蛋白質變性劑包括去污劑。此處所用的“去污劑”包括離子去污劑，最好是陰離子去污劑。
一種適合于本發明的推薦陰離子去污劑可具有烴部分，諸如脂族或芳族部分，并有一個或多個陰離子基團。特別推薦的陰離子去污劑包括十二烷基硫酸鈉(SDS)和十二烷基肌氨酸鈉(SLS)。
在一種推薦實施方案中，本發明的離子去污劑引起在其外膜或衣殼中具有蛋白質或脂類的微生物(例如真菌、細菌或病毒)失活。這包括可能對人類是致病性的微生物，或者能造成GM降解的微生物。
雖然不希望局限于一種單一的理論，但相信用去污劑使微生物失活是有機體外部蛋白質、內部蛋質、含蛋白的膜或生存所必需的任何其它蛋白質的二極結構破壞的結果。本發明人認識到去污染可能不能使某些形式的有機體失活，例如有高抗性細菌孢子和極穩定的腸道病毒粒子。此外，本發明人還認識到雖然使一種微生物失活可能是合乎需要的，但不論是與貯存的GM樣品相聯的還是不相聯的微生物GM，也適合于在發明的干固體介質上貯存或隨后分析。
本發明的組合物可以可選地包括一種自由基捕集劑。按照本發明，一種自由基捕集的定義如上。合適的自由基輔集劑的實例包括尿酸或尿酸鹽、甘露醇、苯甲酸鹽(鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽或tris鹽)、1，3-二甲基尿酸、胍、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、N-乙酰-組氨酸、組氨酸、去鐵胺、二甲亞砜、5，5’-二甲基吡咯啉-N-氧化物、硫氰酸鹽和硫脲。優選的自由基捕集劑包括甘露醇、硫氰酸鹽、尿酸或尿酸鹽。按照本發明，GM貯存的時間越長，則將自由基捕集劑包含在吸著到固體基質上的組合物中就越可能有利。然而，即使GM僅貯存幾分鐘，一種自由基捕集劑仍可加入組合物中。
雖然本發明人并不希望局限于任何單一的理論，但相信自由基捕集劑的一種功能是能捕捉使GM受損的自由基。例如，當所用的自由基捕集劑是尿酸或尿酸鹽時，它可轉變為尿囊素，后者也能起自由基捕集劑的作用，它優先接受在其它情況下將會損壞核苷酸堿基(例如嘌呤)的自由基。
最好是自由基捕捉劑與自由基反應，而不管其來源(包括存在于空氣中的自由基)。自由基可通過血液中鐵的氧化或還原而產生。
通常，自由基被認為是通過存在于例如血液的變性血清蛋白中的基團的自發氧化而產生的。自由基還可通過輻射諸如紫外線、α-射線和高能粒子而產生。
此外，也是一種弱酸的自由基捕集劑，例如尿酸，也能作為由上述弱堿提供的緩沖系統的一種組分起作用。同樣，正如尿酸或尿酸鹽的情況一樣，自由基捕集劑能作為一種可腐蝕的表面而起作用，因為它是微溶性的，以致干燥在其晶體上的GM樣品當尿酸鹽在下方腐蝕時被釋放出來。因此若不要求原位處理，組合物的組分(諸如自由基捕集劑)能增強貯存的GM樣品的取出。
此外，在GM樣品加到干固體介質中后，加有GM樣品的干固體介質可以包裝在一種保護材料(例如一種塑料膜內)，后者能進一步保護貯存的GM免遭降解。按照本發明，合適的塑料膜的實例包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯以及其它層合塑料。將干固體介質包裝在一種保護材料中可通過本領域已知的方法來完成。
把干固體介質包裝在塑料膜中的一種簡單方法是，將干固體介質放入一容器(例如聚乙烯袋)中，它有足夠的大小來容納干固體介質，以致當液態塑料膜加到容器中時，全部干固體介質都將被液體所包裹。液態形式的塑料膜加到容器中，以包裹干固體介質。讓液態塑料膜變干而提供一種塑料膜外套以包裝干固體介質。在分析之前，用本領域已知的方法從干固體介質去除掉塑料膜，例如用有機溶劑諸如三氯甲烷溶解或機械剝去。
本發明人進一步指明，帶有一種加了GM樣品并包含隨后分析用的組分(在下面討論)的干固體介質，也可以包裝在一種上述的保護材料中。II.貯存在干固體介質上的遺傳物質的隨后分析于此所用的“隨后分析”包括在貯存于本發明的干固體介質中GM樣品上能進行的任何分析。貯存在一種干固體介質上的GM可進行體外分析。另一方法是，GM可在分析之前從干固體介質取出。GM樣品可經受化學的、生物化學的或生物學的分析。能在貯存于干固體介質的GM樣品上進行的隨后分析實例，包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、逆轉錄酶起始的PCR、DNA或RNA雜交技術(包括限制片段長度多態性(RFLP)和利用基因探針的其它技術)、基因組序列分析、酶分析、親和標記、利用標記或抗體的檢測方法以及其它類似的方法。
此外，目前在全血樣品上進行的診斷步驟，例如用于苯丙酮酸尿癥(PKU)的Guthrie試驗或者酶試驗(例如半乳糖血癥)，都可以在首先例如使用一種“轉化劑溶液(converter solution)”中和干固體介質的使蛋白質變性組分的作用之后，在貯存于本發明的干固體介質中血液樣品上進行。一種轉化劑溶液的實例公開于實施例5中。
貯存在本發明干固體介質上的GM可作為一種模板，用于利用PCR方法進行的GM的隨后分析中。這包括利用DNA或RNA作為模板的PCR法。當RNA是待分析的GM時，RNA能作為利用逆轉錄酶起始的PCR法的模板。然后，由RNA模板產生的DNA序列，能用作進一步PCR擴增的模板。
與貯存的GM樣品相聯的化合物，包括血紅蛋白、蛋白質或干固體介質中組合物的組分，能干擾貯存在干固體介質的GM樣品的隨后分析。最好是在隨后分析之前，將這些干擾化合物基本上從干固體介質除去。例如，若貯存的GM樣品是在全血中，在用PCR、LCR、RFLP、逆轉錄酶起始的PCR、基因探針或其它技術分析之前，最好除去與貯存在干固體介質上GM相聯的血紅蛋白或蛋白質。例如，利用含水的或非水的提取步驟，能將與GM相聯的血紅蛋白或蛋白質除去。另外，一種干擾化合物，它是本發明組合物中的一種組分(例如一種離子去污劑)，在隨后分析之前，能用含水或非水的提取步驟或于此公開的轉化劑溶液除去。
在一種優選的實施方案中，利用非水提取步驟，例如下述單相酚洗滌方法，能將血紅蛋白、血液蛋白質以及與GM樣品相聯的其它蛋白質除去。此外，在單相酚洗滌后，可接著用下述離子含水酒精洗滌，以便為隨后的PCR、LCR或對貯存在干固體介質上的GM進行類似的分析提供必需的離子。有關PCR、LCR、逆轉錄酶起始的PCR、DNA或RNA雜交、基因組序列分析法以及其它隨后分析方法都是本領域已知的。
在本發明的另一實施方案中，貯存在本發明干固體介質上與蛋白質或血紅蛋白相聯的GM樣品，可利用水提取法除去。例如，一種這樣的含水提取步驟，使用含水的SDS和巰基乙醇。按照該步驟，帶有或不帶隨后分析用的組分并貯存在干固體介質上的GM樣品，用含水的pH8.5-9.0的6％SDS堿性溶液洗滌，該堿性溶液含有一種硫醇，例如，20mM的2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇。另一種這樣的含水提取步驟，例如用的是純水。然后用異丙醇洗滌GM，以大體除去所有的水、剩下的雜質和不需要的組分(例如利用下面描述的用于單相酚洗滌的含水酒精洗滌溶液可以完成異丙醇洗滌)。
對本領域技術人員將是顯而易見的是，貯存在帶有或不帶用于隨后分析組分的本發明干固體介質上的GM的原位隨后分析，在自動化系統中可能是特別有好處的。此處所用的一種“自動化系統”包括一種“自動的流體傳送系統”。按照本發明，“自動流體傳送系統”包括手持和自動控制的流體液傳送系統。自動的流體傳送系統通常是這樣一種裝置，它把流體試劑分配到多孔反應板的各個孔中，并從各個孔中取出流體試劑。一種手持自動流體傳送系統包括一種單一的活塞把柄，帶有多個流體吸取和分發端，以便同時從單一或多種流體反應孔中吸取和分發一種流體反應系統的流體。自動控制的自動流體傳送系統是計算機操縱的而非手持的，包括這樣的產品，例如BIOMEK2000(貝克曼儀器，Fullerton，CA)，Zymark Benchmate(Zymark，Hopkinton，MA)和Rosys PLATO，Rapperswil，端士。自動流體傳送系統在國際專利申請PCT/IB 95/00989(WO 96/11406)中也進行了討論，它通過引用結合到本文中。A.單相酚洗滌本發明的另一方面提供除去與貯存的GM樣品相聯的蛋白質或血紅蛋白的一種有機提取法。按照本發明，利用一種單相酚洗滌可以把血紅蛋白或蛋白質從貯存的GM樣品中除去。單相酚洗滌最好也除去本發明組合物中的組分(例如去污劑)。單相酚洗滌是通過將單相酚溶液與其上加有GM樣品的干固體介質相接觸而進行的。從含有GM樣品的干固體介質上除去單相酚洗滌液，然后將干固體介質與一種含水酒精洗滌液接觸。然后除掉含水酒精洗滌液。如果GM樣品要用PCR、LCR或其它依賴離子的方法進行分析，那么在進行PCR分析之前，GM樣品可與一種離子含水酒精洗滌液相接觸。一種非水洗滌系統諸如單相酚洗滌液(在下面描述)或一種含水洗滌系統(在上面已描述)也能用來洗滌貯存在固體基質上的GM樣品，該基質缺乏本發明的組合物并且它可以包含或可以不包含一種用于GM隨后分析的組分。
單相酚詵滌可用來除去蛋白質、血紅蛋白或干固體介質組合物的一種組分，該組分能影響在貯存于干固體介質的GM上進行的隨后處理，而不影響貯存的GM。不像現有技術方法，該洗滌系統在處理期間不需要兩相分離(水相和有機相)，并且傾向于不溶解血液中存在的GM。單相酚洗滌同樣經得起自動化系統的檢驗。
單相酚洗滌法也公開于國際專利申請PCT/AU 89/0043(WO90/03959)和PCT/IB 95/00989(WO 96/11406)。洗滌包括二種溶液，即下面提到的“單相酚溶液”(溶液A)和“含水酒精洗滌溶液”(溶液B)。假如使用需要額外離子的方法(例如PCR和LCR)去分析GM樣品，可在單相酚洗滌后使用第三種溶液，即離子含水酒精洗滌溶液(溶液C)。
溶液A單相酚溶液包括用Tris-醋酸鹽和巰基乙醇飽和的酚和羥基喹啉。最好是將50克(gm)酚與用10毫升1.0摩爾濃度(M)pH6-9、最好是pH8.0的Tris-醋酸鹽和1.0毫升2-巰基乙醇飽和的120毫克(mg)8-羥基喹啉混合。在大約0℃到20℃(最好是0℃到4℃)搖動使之飽和后，取去并丟棄水相。(本發明人注意到，單相酚洗滌液相信是用Tris-醋酸鹽和巰基乙醇在4℃飽和的，但是，在使用時溫度通常高于4℃，因而相信溶液是未被飽和的)。
溶液B含水酒精洗滌溶液利用任何C2-C5醇類(諸如異丙醇或正-丙醇)或其它類似的水可混溶的溶液并結合一種醋酸鹽或類似的有機可溶性鹽，它提供的pH約為7.0到9.0，最好是約為pH7.8。在一種優選的實施方案中，75％(體積)的異丙醇與25％(體積)的pH約為7.8的0.1M醋酸鎂合并。
溶液C離子含水洗滌溶液是一種洗滌溶液，它提供合適的離子，例如鎂、錳、鈉、魚精蛋白、Tris以及類似的可用于隨后分析步驟中的離子。對于PCR分析，優選鎂。因此，離子醇洗滌溶液利用任何C2-C5醇類(諸如異丙醇和正-丙醇)或任何其它類似的水可混溶的溶劑，結合以一種醋酸鹽或類似的有機可溶性鹽，以提供約為6.0到8.5的pH，最好是約為pH7.8。在一種優選的含鎂離子的實施方案中，將75％(體積)的異丙醇與25％(體積)、pH約為7.5的0.01M醋酸鎂混合。
按照本發明，貯存在干固體介質上并和血紅蛋白和蛋白質相聯的GM樣品，可與溶液A接觸大約15分鐘到大約3小時，最好是大約1.5小時到大約2小時，溫度高于37℃，優選約為45-65℃，更優選約為50℃。如果本發明的干固體介質還不包括一種用于隨后分析的組分，諸如一種引物(這在下面討論)，那么GM樣品與溶液A接觸的溫度并非關鍵性的。然后除掉溶液A。然后，最好是將GM樣品迅速地洗滌1-4次，每次用新鮮的溶液A洗幾秒鐘。
在除去溶液A后，將GM樣品用溶液B洗滌1-4次，每次幾秒鐘。最好是在大約10℃到25℃使用溶液B洗滌液。如果要使用溶液C，可在除去溶液B后，將溶液C加到GM樣品上大約1-60分鐘，最好是30分鐘，溫度約為10℃到25℃。除去溶液C并使干固體介質上的GM樣品干燥。
一般地說，本發明的單相酚洗滌提供了基本不含蛋白質或血紅蛋白的GM，這提供一個非常方便的起始點，用于基于核酸的各種分析步驟。在實施例中還描述了單相酚洗滌液和離子含水酒精洗滌液的用法。
按照本發明，單相酚洗滌用來提供基本不含蛋白或血紅蛋白的貯存在任何固體系統上的GM樣品。此外，如下所描述的，當一種固體貯存系統與一種用于隨后分析的組分(諸如一種寡核苷酸引物)混合時，單相酚洗滌是特別有好處的。因此，單相酚洗滌對從貯存在一干固體介質上GM樣品中除去蛋白質或血紅蛋白是有用的，不管貯存介質是否混合了本發明保護GM的組合物，也不管貯存介質是否包含隨后分析所必需的組分。B.包含用于遺傳物質隨分析分的組分的干固體介質在本發明的另一實施方案中，本發明的干固體介質可包含一種用于GM貯存樣品隨后分析的組分。此處所用的“隨后分析”是指能在貯存于干固體介質GM樣品上進行的任何分析。這包括化學的、生物化學的或生物學的分析。能在貯存于干固體介質GM樣品上進行隨后分析的實例，包括PCR、LCR、逆轉錄酶起始的PCR、DNA或RNA雜交技術(包括RFLP和利用基因探針或DNA或RNA探針的其它技術)、基因組序列分析、酶分析、親和標記、利用標記或抗本的檢測方法以及本領域已知的其它方法。
于此所用的一種用于貯存的GM樣品的“隨后分析的組分”，包括一種分子、化合物、試劑或其它組分。該組分在分析一種GM樣品時起作用，或在保存一種用于分析的GM樣品時起作用，或者在分析與GM一起貯存在干固體介質上的某些其它組分時起作用。
在某些情況下，隨后分析將包括一種分析方法，它被用來證實一種特殊的遺傳序列的不存在或存在。待分析的遺傳序列稱為“靶序列”。靶序列或GM樣品的其它區域可用作PCR擴增的模板。
用于隨后分析的一種或多種組分可包含在干固體介質上。包含在干固體介質上的組分取決于在GM樣品上進行分析的類型。包含一種用于隨后分析組分的優點，在利用自動化系統同時分析大量GM樣品的情況下很快地顯現出來。可包含在干固體介質上用于隨后分析的組分包括，例如一種離子、一種酶和一種核苷酸序列。
此處所用的“核苷酸序列”包括一些化合物，諸如一種引物(例如一種PCR引物、一種逆轉錄酶起始的PCR的引物)、成套的用于LCR-的寡核苷酸底物、DNA或RNA探針、用于遺傳序列分析的寡核苷酸以及一種靶序列穩定劑。
于此所用的一種“引物”是指一對寡核苷酸，其中每一個都能與GM樣品中互補的核酸序列退火并定向，以便使每一引物引發一條DNA鏈的合成(或者可想象地，一條RNA的鏈)，合成的DNA鏈含有一段與另一寡核苷酸互補的序列。對于某些應用，可能需要預先設定寡核苷酸的序列及其互補序列。在其它的應用中，該序列可以是未知的。許多簡并引物或帶有預測能與互補序列相結合的序列的引物都可使用。引物對可用來擴增一對互補序列以及在二種已知或未知大小的互補序列之間的序列。此外，引物可用來擴增模板，該模板最初是雙鏈DNA或RNA，也可以是單鏈DNA或RNA。對于一種單鏈模板來說，人們理解的是與寡核苷酸之一互補的序列，當它退火雜交到其互補序列上時，通過第一引物的延伸而合成。
用于PCR或逆轉錄酶起始的PCR的引物，可以象往常一樣作為一種引物對而存在，或者可以僅有一種引物，正如在作基因組的序列分析或是在用于逆轉錄酶起始PCR的某些方案中可能的情況那樣。
在本發明的另一實施方案中，用于隨后分析的組分可以是稱為“靶序列穩定劑”的核苷酸序列。按照該實施方案，“靶序列穩定劑”是一種與待測DNA或RNA整個區域互補的核苷酸序列。靶序列穩定劑可用來增進一種不穩定的單鏈RNA或DNA的貯藏，該RNA或DNA作為GM樣品貯存在干固體介質上。正如本領域已知的，許多單鏈RNA是不穩定的，而且易受到低水平的無所不在的RNA酶的降解。可是本發明人相信通過在干固體介質上包含一種靶序列穩定劑，該靶序列穩定劑將與單鏈RNA(或DNA)樣品結合，形成的“雜種”較不易受到降解。例如，本領域已知雙鏈RNA/DNA雜種對普通RNA酶是高抗性的。與靶序列穩定劑退火雜交的RNA或DNA，接著能進一步用本領域已知的方法進行分析，例如，LCR或LCR與逆轉錄酶起始的PCR相結合使用。因此，按照本發明，用于隨后分析的組分包括一種組分，它通過保護貯存的GM樣品不受降解而起作用，該組分例如是一種靶序列穩定劑。
包含一種用于隨后分析的組分(諸如一種核苷酸序列)，為例如通過自動化PCR系統簡化GM的隨后分析提供很大的好處。此外，包含一種合適的核苷酸序列能提供額外的保護，使GM(諸如不穩定的RNA)免遭降解。
能包含在本發明干固體介質上并可用于隨后分析的其它組分是，例如離子、遺傳探針或寡核苷酸或具有不同類型標記的多核苷酸序列以及適當穩定的酶(諸如熱穩定的酶)。標記可包括一種熒光化學基團、放射性同位素、化學結合劑(例如生物素)、抗原或酶類。
為了除去與貯存在干固體介質上GM樣品相聯的蛋白質或血紅蛋白而使用的某些洗滌系統，可能造成用于隨后分析而包含于干固體介質中的組分的某種損失。本發明人已發現，用本發明的單相酚洗滌液去除與干固體介質上包含一核苷酸序列的GM樣品相聯的蛋白質或血紅蛋白，通常可使包含的核苷酸序列減少損失或無實質性的損失。“無實質性的損失”是指在完成洗滌時，沒有造成組分的足夠損失以致阻礙隨后的分析。在一種引物組分的情況下，“無實質性的損失”是指洗滌沒有造成引物的足夠損失以致阻止PCR、LCR、逆轉錄酶起始的PCR、探針探測等。因此，由于核苷酸序列和GM樣品二者在洗滌期間，仍然保留干固體介質上，因而原位處理是可能的。熟悉本行的人將很快地認識到這在為使用自動系統分析GM方面提供的好處。
在一種貯存的GM樣品的處理期間，在某些洗滌系統中(例如含水的洗滌系統)，通過使用一種保留劑可以有利地克服用于隨后分析的一種組分的損失。
于此所用的“保留劑”是一種化合物，一種用于隨后分析的組分可與它相加、混合、懸浮或者在其它情況下與它相聯，以減少處理期間干固體介質上組分的損失。一種優選的保留劑，在干固體介質受到一些條件影響時，可提高干固體介質上組分的保留，否則這些條件會造成干固體介質上的組分的較大損失。例如，一種用于隨后分析的組分當使用非水洗滌系統時，它在介質中的濃度會減少，可將它與一種保留劑結合，該保留劑在非水提取期間增進該組分在干固體介質上的保留。一種用于隨后分析的組分，它在介質上的濃度通過使用一種含水洗滌系統會減少，可將它與一種保留劑混合，該保留劑在含水提取期間增進該組分在干固體介質上的保留。
在一種實施方案中，當使用含水洗滌系統處理貯存在干固體介質上GM樣品時，本發明提供一種保留劑，它可與用于隨后分析的組分聯合使用。當使用含水洗滌系統抽提與貯存在干固體介質上GM相聯的蛋白質或血紅蛋白時，一種優選的保留劑通常將減少例如一種核苷酸序列的損失。
與一種含水洗滌系統一起使用的保留劑的實例是一種蠟。另一方法是，保留劑可以是懸浮于蠟中的親水性載體。
此處所用的一種“蠟”是一種有機混合物或高分子量的化合物，它在室溫下是固體，但在高溫時則液化。蠟包括烴類、脂肪酸、醇類、酯類、聚合物、長鏈酰胺、同系硅基化合物以及熱標記樹脂。
在一種優選的實施方案中，一種用于隨后分析的組分(諸如一種核苷酸序列或一種離子)與親水性固體載體混合，并且懸浮在蠟中。親水性固體載體包括例如淀粉、膠態纖維素、棉線和類似的化合物。組分和載體的混合物可隨后懸浮在一種蠟中，該蠟的熔點為隨后分析的溫度或低于該溫度。例如，如果GM樣品要用PCR方法進行分析，應該選擇熔點為45℃-110℃、最好是65℃-90℃的蠟。按照本發明，一種優選的蠟是石蠟。
讓蠟懸浮液固化，并把固體懸浮體以小鈕扣狀物沉積或滴在干固體介質上。如果一種引物是與蠟懸浮體相混合的組分，最好是每滴都含有足夠的引物以用于單個的PCR擴增。因此，正如將在下面描述的，用于多種GM樣品的許多蠟滴可放在一張干固體介質卡上。
雖然本發明人不希望局限于一種單一的理論，但相信在含水系統洗滌期間，蠟會減少保留組分的損失。例如，當利用PCR方法分析GM樣品時，在PCR第一循環期間，溫度上升引起蠟熔化，因而釋放出組分(諸如一種引物)，使反應開始進行。
在用于含水洗滌系統的保留劑的另一實施方案中，將一種用于隨后分析的組分加到棉線載體上，并且涂上或浸漬蠟。例如，可以將棉線拉過一種用于隨后分析的水溶性組分的槽，然后可以將線拉過一個干燥室，接著拉過一個含有熱蠟的槽。涂蠟線卷能貯存并且隨后被切成微小的片段，并熱壓印到干固體介質上，以提供棉線上懸浮于蠟的用于隨后分析的組分。
在另一實施方案中，一種用于隨后分析的組分可以與無親水性載體的蠟相混合，并用靜電印刷術方法應用到干固體介質上。按照此實施方案，用于隨后分析的組分能沉積到干固體介質上的非水溶性保留劑中，該非水溶性保留劑在有水存在下應用熱時會變成水溶性的。因此，用于隨后分析的組分能混合到蠟中，而且該組分能作為一種微包涵體而受到保護，直至蠟在水中熔化為止。最好是含有一種用于隨后分析組分的蠟沉積在干固體介質的預定位置上。此實施方案的一個實施例與靜電印刷術處理相似，將熱的含有一種用于隨后分析組分的極干蠟粉末加到干固體介質的表面上。
在本發明的另一實施方案中，利用親水性液體載體可以將一種保留劑溶于蠟中。例如，一種核苷酸序列通過與一種去污劑復合(Complexing)可以首先溶于蠟中。優選的去污劑是陽離子去污劑，諸如溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)。然后將去污劑增溶的組分與蠟混合，如上面描述的那樣應用到干固體介質上去。
因此，在某些用來處理GM樣品的條件下，保留劑的使用能增進用于隨后分析組分的保留，因而改進了的分析結果。
在本發明干固體介質上包含一種用于隨后分析組分的優點，在利用自動化流體傳送系統進行多個樣品的PCR擴增的情況下是顯而易見的。例如，通過包含一種擴增特異DNA或RNA基因序列所必需的引物，可以用一種單一的PCR反應混合物去分析含有不同引物的多個樣品。所有小瓶所需的僅是一種PCR酶和核苷酸的混合物。此外，即使與各種GM樣品包裹在一起的不同引物需要變更反應條件(諸如鎂離子和/或pH)時，這些變動僅用兩個附加的泵或移液管系統就能提供，以分送廉價的鹽類和緩沖液。這將適用于大多數意外情況。
在對一個貯存于介質上GM樣品處理之前，一種用于隨后分析的組分最好包含在干固體介質上。用于包裹組分的種種變更是可允許的。例如，在把組合物加到固體基質之前，可把該組分加到干固體介質的組合物中。或者可將該組分與組合物同時加到固體基質中。另一個辦法是，本發明的組合物可加到固體基質中，隨后再加各組分。可預見的是，一種GM樣品可加到干固體介質中，在收集GM樣品之后，但在處理GM樣品之前，將用于隨后分析的組分加到干固體介質中。還可預見的是，在除去蛋白質和/或血紅蛋白之后，但在隨后分析之前，可以將一種組分加到干固體介質中。
因此，本發明通過將一種包含用于隨后分析組分的干固體介質與容許共處理該組分和貯存GM的方法結合，使以前行不通的新穎的戰略變為可行。C.多種核苷酸序列包含在一個干固體介質上本發明的干固體介質還可以被認為或稱為一張卡。一張卡片能以這樣的一種方式制作，以致在一張卡片的不同位置提供用于隨后分析的不同組分。例如，當用于隨后分析的組分是一種核苷酸序列時，用于引發PCR擴增或穩定不同靶序列的多種不同的核苷酸序列可以包括在一張卡上。
于此所用的“多種”是指大于一種。一個待分析GM樣品可貯存在一張卡上，后者是大約1毫米到5毫米的方形物。因此，約為5毫米×10毫米的卡片可分為例如200個單獨的樣品。每一5毫米的正方形可包含一種不同的核苷酸序列。因此，一張5厘米×10厘米的卡能用來進行200種不同靶序列的隨后分析。
一張干固體介質卡提供來自一個收集樣品的多個GM區域分析。這種卡可以預先制作、預先標記并貯存用于將來使用。在一個優選的實施方案中，一種包含在卡上用于隨后分析的核苷酸序列可以是一種引物。按照該實施方案，用于特殊用途的所有或許多引物能包含在一張卡上。例如，一種應用可以是在一個GM樣品上篩選多種靶序列，它們一起表示出一種特殊遺傳疾病的特性。另一個方法是，一張卡能含有許多引物，以篩選多種病毒病的基因組。因此，可制作、標記或包裝這些包含用于隨后分析的組分的卡，作為特殊種類的使用，例如處罰目的(例如個人鑒定)、保險公司篩選以及遺傳疾病的醫學診斷。
此外，包含例如一種核苷酸序列，提供用于不同領域的干固體介質，并且可以在一個集中的非專門化的自動化分析中心一起方便地處理。這將容許自動化系統使用一種基礎酶混合物，以及可能還有緩沖液，以同時擴增所有的靶序列，對于這些靶序列來說，引物是存在于一種類型的卡上的。正如以前指明的，離子和pH潛在變化能通過不同途徑進行處理，例如用單獨的傳送泵。另一方法是，保留劑的使用能提供在各種各樣的條件下用于隨后分析的各種離子或其它組分的傳送。
設計下面的實施例以指導那些本領域技術人員如何實踐本發明。它們無論如何不是打算限定或限制本發明的范圍。D.干固體介質試驗盒本發明還提供一種試劑盒用于應用、貯存或處理GM樣品。試劑盒可包括一種干固體介質和一個適合于在應用、貯存或處理GM樣品期間包含一種干固體介質的容器。按照本發明的這一方面，該試劑盒可以包括一個或多個容器。適用于試劑盒的多于一個容器的一個例子包括在下面描述的96孔板。試劑盒也包含一種或多種于此公開的任何干固體介質。這包括一種固體介質，它帶有或不帶一種用于隨后分析的組分，并帶有或不帶一種保留劑。包含于一容器中的一個干固體介質能自由地由容器中取出，或固在容器內。
試劑盒的容器可以是適用于下述期間使用的任何容器將一個GM樣品應用于干固體介質期間或在一個GM樣品的應用和隨后處理的一個或多個階段期間。因此，一個試劑盒能用來將一個GM樣品加到一干固體介質上，將干固體介質從試驗盒容器中取出，以在不同的容器中進行處理。另一方法是，一GM樣品能在試劑盒容器中使用、貯存和處理。
本發明試劑盒的一個特別有用的方面，是它能將一個GM的液態樣品從原先的收集容器(諸如血液試管)轉移到該試劑盒的干固體介質上而不需人們接觸。因此，例如利用一種自動控制系統(諸如PLATO3300II(Rosys，Rapperswil，瑞士))，能將一個全血樣品從一個原先的收集容器取出，并轉移到干固體介質上而不需人與血液接觸，直至它在固體介質上干燥為止。如果自動控制系統具有追蹤能力，那么可以將多個GM樣品從原先的收集容器同時轉移到試劑盒容器的干固體介質上，并進行跟蹤。例如，使用一種在收集容器上添加條形碼的跟蹤系統，并且在自動控制系統中存在條形碼閱讀器，則來自一個特定收集容器的樣品的位置能通過將該GM樣品加到干固體介質上而跟蹤。此外，如果自動控制系統包括一個處理系統，則可以將一個GM樣品從一個原先的收集容器取出，加到干固體介質中，并且通過處理進行跟蹤，不需要人接觸。
本發明試劑盒的優點包括增加了樣品處理者在將樣品放置在干固體介質上期間的安全性，減少了將樣品加到干固體介質上的人工勞動成本，并且降低了在處理期間樣品受污染的機會。
用于本發明試劑盒的容器能由任何已知的材料制成。試劑盒容器的材料可根據貯存在干固體介質上有待進行分析的GM樣品類型而選用。能制備試劑盒容器的代表性的材料包括聚苯乙烯、聚丙烯以及本領域所用的其它材料。一個試劑盒可包含單個帶有干固體介質的容器。另一方法是，一個試劑盒可以含有的容器同自動控制系統或其它轉移系統能操作的一樣多。在一個典型實施方案中，本發明的試劑盒可以是一塊板，諸如一種Corning的96孔檢測板(Corning Glass Works)或Falcon96孔檢測板(Becton Dickenson and Company)，在該檢測板的每一孔中都含有一種干固體介質。一個多容器試劑盒(諸如多孔板)，可以在每一容器內包含有一種不同的干固體介質。因此，例如一個試劑盒能配備一種單一類型的干固體介質，以篩選多個血液樣品中的一個基因，該基因的引物可包含在干固體介質中。在另一實施例中，一個試劑盒可以篩選一個血樣中的多種基因。因而在該實施例中，每一容器可含有一種干固體介質，而每一種干固體介質包含一種不同的引物。
一個利用一種帶有96孔容器試劑盒的例子如下，該容器可以用于Rosys 3300II，以加入和洗滌全血中的GM樣品按照該實施例，96孔板上的每一孔可包含直徑為2到5毫米、最好約為3毫米的園盤狀物。在96孔的每一孔中預先沖壓干固體介質盤狀物。
將5微升全血樣品從用EDTA、檸檬酸鹽或肝素預處理的一個血液收集管中轉移到一個孔中的干固體介質盤狀物上，每次轉移都使用一個新的加樣器吸頭。如果試管都用條形碼標記，并且如果自動控制系統包括一個條形碼閱讀器，那么每一個放到干固體介質上的樣品就能被跟蹤。將該板在45℃至55℃，最好是50℃保溫大約10到20分鐘，最好是15分鐘，使血液樣品干燥。將大約200微升Gentra One-StepTM(gentra System Inc.，Plymouth，MN)加到每一孔中，并且該板保溫大約10到20分鐘，最好是15分鐘，溫度在大約25℃到30℃，最好是27℃。該步驟重復兩次。在第二次重復后，這些孔都用大約200微升100％異丙醇洗滌兩次。然后這些孔在大約55℃到65℃、最好是60℃保溫大約10到20分鐘，最好是15分鐘。
如果每個樣品將進行不同的隨后分析，那么可以取出在96孔的每孔中含有一個洗滌過的GM樣品的干固體介質。另一方法是，如果所有的樣品都要經過同樣的隨后分析，它們可以在96孔容器中進一步處理。
實施例實施例1.貯存于干固體介質上血液DNA的原位PCR擴增貯存于本發明干固體介質上的一個血液DNA樣品，通過用聚合酶鏈反應(PCR)技術進行原位擴增。該實施例中使用的干固體介質是基于纖維素的紙，其上已吸著一組合物，該組合物包括每平方厘米紙中有2微摩爾尿酸、8微摩爾tris(游離堿)、0.5摩爾EDTA和1毫克SDS。在進行PCR擴增前，洗滌貯存的血液并加入合適的離子。1.1單相酚洗滌A.材料溶液A單相酚洗滌液。一種合適的混合物是含有120毫克8-羥基喹啉的50克酚，用10毫升1.0M tris-醋酸鹽pH8.0和1.0毫升2-巰基乙醇飽和。通過在室溫下搖動使其達飽和后，徹底除去并丟棄水相。
溶液B含水酒精洗滌溶液。75％v/v異丙醇，25％v/v 0.1M醋酸鉀pH為7.8。
溶液C離子含水洗滌溶液。75％v/v異丙醇，25％v/v，0.01M醋酸鎂。
B.方法所有的步驟最好是在由合適的抗酚材料(例如聚乙烯)制成的單個試管中進行。
1.蛋白質的去除浸漬過血的5毫米×5毫米方形干固體介質在45℃用1毫升溶液A處理約1.5小時(由于引物不存在，該溫度和時間并不是關鍵性的)。然后抽吸并丟棄溶液A，并迅速將紙質方形物用0.25毫升溶液A洗滌三次，每次洗滌僅幾秒鐘，立即抽吸并丟棄洗滌液。
2.酚的去除和合適離子的添加來自上面步驟(a)的干固體介質迅速地用1毫升溶液B洗滌三次。洗滌是在室溫下進行，而且是簡單地加入溶液B，接著抽吸并丟棄溶液B。然后用溶液C在室溫下將紙洗滌20分鐘(這是為了使紙上的GM被鎂離子所飽和，并除去最后的酚)。抽吸并丟棄溶液C，干固體介質用純異丙醇洗滌一次，進行溶劑干燥，然后再進行真空干燥。
洗滌過的干固體介質相當白，沒有任何明顯的紅棕色的血液殘跡。然后，將它用于一種PCR反應混合物中。1.2干固體介質上DNA的擴增上面描述的洗滌過的干固體介質上的樣品，已表明是一種適用于DNA聚合酶鏈反應(PCR)擴增的合適底物。
A.材料1.樣品提取的DNA利用標準操作步驟從一位男性志愿者取1毫升血。
干固體介質來自同一志愿者的血液樣品，象上面描述的那樣直接加到干固體介質中，隨后用單相酚洗滌。將干固體介質切成大約1毫米×1毫米的碎片以用于PCR反應。
2.用于擴增的靶1號靶第1條染色體上n-Ras原癌基因的外顯子2區域。所用的引物是R15’TGA CTG AGT ACA AAC TGG TGG TG 3’(SEQ ID NO1)R25’CTC TAT GGT GGG ATC ATA TTC A 3’(SEQ ID NO2)。
用這些引物所得的擴增的DNA片段，其大小為110bp。2號靶一種男性特異性Y染色體的重復序列。引物是0075’TGG GCT GGA ATG GAA AGG AAT GCA AAC 3’(SEQ IDNO3)以及0085’TCC ATT CGA TTC CAT TTT TTT CGA GAA 3’(SEQ ID NO4)。用這些引物所得的擴增DNA片段，其大小為124bp。3號靶一種男性特異性Y染色體的重復序列。所用的引物是0045’GAA TGT ATT AGA ATG TAA TGA ACT TTA 3’(SEQ IDNO5)以及0065’TTC CAT TCC ATT CCA TTC CTT TCC TTT 3’(SEQ ID NO6)。
用這些引物所得的擴增的DNA片段，其大小為250bp。B.方法1.PCR操作步驟將提供的DNA(1微克)或洗滌過的含有血液DNA樣品的干固體介質(其大小約為1毫米×1毫米的片段)放進0.5毫升Eppendorf管中，構成25微升PCR反應混合物，其組成為67mM Tris HCl(在25℃下pH8.8)16.6mM(NH4)2SO42.0mM MgCl20.01％(w/v)明膠0.1mM脫氧核苷酸(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)0.25微克每種引物(用于各自的靶)0.25單位Taq DNA聚合酶2.擴增條件混合物上鋪25微升輕礦物油，通過在Perkin Elmer-Cetus“熱循環儀”上進行30個循環的擴增，以擴增DNA。首次循環由下述操作構成DNA變性 在94℃6分鐘引物-DNA退火 在55℃1分鐘Taq DNA聚合酶促延伸 在75℃1分鐘接著如上進行29個循環，只是DNA變性是在94℃進行1分鐘，并且在將反應混合物冷卻至4℃以前，最后一次循環的延伸時間是在72℃經10分鐘。1.3結果擴增之后，將10微升等份的PCR混合物在15％(w/v)聚丙烯胺凝膠上進行電泳分析。通過紫外線照射經溴化乙錠染過的凝膠，目測擴增的靶DNA。
提取的血液DNA以及貯存在干固體介質上的血液DNA的PCR擴增產物的分析如下顯示于圖11-3泳道1號靶，第1泳道1微克DNA，第2泳道1平方毫米濾紙片，第3泳道對照(無DNA)；4-5泳道2號靶，第4泳道1微克DNA，第5泳道1平方毫米濾紙片，第6泳道對照(無DNA)；7-9泳道3號靶，第7泳道1微克DNA，第8泳道1平方毫米濾紙片，第9泳道對照(無DNA)；S泳道DNA大小標記物(pUC 19/Hpa II消化物)。
顯示于圖1的結果清楚地表明貯存在本發明干固體介質上的DNA未發任何程度的改變，而且它能在原位使用，正如在此所描述的那樣。實施例2貯存在包含引物的干固體介質上DNA的PCR反應在收集血液DNA樣品前將引物加到干固體介質上，在含該引物的干固體介質上進行PCR分析。2.1遺傳物質A.材料1.DNA模板為了制備含DNA的遺傳材料樣品，將3微升人血加到一個3平方毫米的干固體介質樣品上，讓血液干燥。除非另外指出，這個3平方毫米的方形物接著用于每一PCR反應中。3微升血液相當于大約250納克白細胞DNA。另外，利用PCR法在自由溶液中擴增了一種純化的人DNA的對照樣品。
2.引物得自人II類HLA基團、DQ-α的兩種合成寡核苷酸引物用于實驗中，它們的序列是5’GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG 3’(SEQ ID NO7)5’CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTC 3’(SEQ ID NO8)使用這兩種引物預期得到的PCR產物大小為262bp。每種引物以50ng/μl的濃度作為儲備溶液貯存。當在處理前加到干固體介質上時，將150ng的兩種引物加到3平方毫米的干固體介質上。該引物總是以相同濃度一起使用。
2.2單相酚洗滌溶液A單相酚溶液。含有120毫克8-羥基喹啉的50克酚用10毫升1.0MTris-醋酸鹽pH8.0和1.0毫升2-巰基乙醇飽和。在0-4℃飽和后，徹底取出并丟棄。
溶液B含水酒精洗滌溶液。75％v/v異丙醇，25％v/v 0.1M醋酸鉀，pH7.8。
溶液C離子含水洗滌溶液。75％v/v異丙醇，25％v/v 0.01M醋酸鎂。
B.方法1.洗滌干固體介質貯存在包含一種引物的干固體介質上的GM樣品進行下述處理首先用200微升溶液A或者在37℃或者在50℃下洗滌該介質二小時，接著用溶液A迅速沖洗水相二次。該介質緊接著在室溫下用溶液B沖洗三次，每次用200微升，每次5分鐘。然后在室溫用200微升溶液C洗滌介質20分鐘，并隨后進行真空干燥(洗滌時間都是過量的，實際上可使用較短的時間。通過觀察(1)血紅蛋白和(2)羥基喹啉顏色的消失可監測洗滌的有效性)。
2.3 PCR操作步驟A.材料1. 50微升實例PCR混合物在加熱循環之前，將下述混合物放置在含有血液樣品的洗滌過的干固體介質上67mM tris-HCl(在25℃下pH8.8)16.6mM(NH4)2SO40.2毫克/毫升明膠0.45％Triton X-1002.0mM MgCl20.2mM每種dATP，dTTP，dCTP，dGTP2.5單位Taq聚合酶模板血液DNA在干固體介質上，或為作為自由溶液的提純的人DNA(當是自由溶液時，在其中加50毫微克模板)。
如表1中所示，引物被干固體介質所包含和/或引物在自由溶液中(如果是自由溶液時，每一引物加100毫微克)。
B.方法1.擴增條件在94℃ 4分鐘(開始條件)在94℃ 1分鐘在50℃ 40秒(32次循環)在72℃ 1分鐘4℃ (浸漬-結束條件)預期的產物是人II類HLA基因、DQ-α的242bp片段。
2.電泳條件電泳是在1％瓊脂糖中進行，內含0.045M tris、0.046M硼酸、1mM EDTA，pH8.0，在8.5伏/厘米電泳1.5小時。
C.結果取3毫米×3毫米加引物的干固體介質。將來自一位供血者的3微升新收集的人血加到所有的干固體介質樣品上，并讓其干燥，然后在室溫貯存7天。
然后用單相酚洗滌液洗滌干固體介質的方形物，接著將所有的介質方形物滴入PCR混合物中，混合物中或是已有引物或者未加引物。因而有多種試驗其中在將血加到介質上的前后將引物加到介質中和加到最后的PCR混合物中(見表1)。
在循環后，將8微升每一反應混合物樣品與Promega PCR標記混合物(Promega Corp.Madison，威士康辛)一起電泳(DNA帶在1000bp、750bp、500bp、300bp、150bp、50bp)。凝膠用溴化乙錠染色，并拍照產物DNA帶(見圖2)。
用單相酚洗滌液在37℃對4種樣品進行處理，并將4種樣品用單相酚洗滌液在50℃進行處理。用于兩套樣品的隨后算得步驟和PCR反應條件都是相同的。圖2表明，在37℃進行提取產生了預期大小的DNA帶，并且它們的強度不同(1-4泳道)，而在50℃進行提取時產生了預期大小的強帶(5-8泳道)。為了表明由于干體介質回收DNA的PCR產物是有特異性的，并且與預期的PCR產物相符，用標準方法對提純的人DNA進行PCR反應(圖2，第12泳道)，或者不加DNA進行PCR反應(圖2，第13泳道)。若反應中未加外源DNA就看不到產物(圖2，第13泳道)，并且用提純DNA所得產物與由處理過的介質樣品所得PCR產物的遷移率是一樣的(圖2，比較第11泳道和第12泳道)。
然后將另外兩套樣品在37℃提取。對一種反應，引物是在加血后才加到干固體介質中。對第二種反應，引物同樣是加血后才加到干固體介質中，并將額外的引物恰好在PCR反應開始前加入。這一實驗的結果分別顯示于圖2的第9泳道和第10泳道。第9泳道展現出當引物在取血后加到干固體介質中時，干固體介質上的DNA產生了預期大小的PCR產物。當引物恰好在進行PCR反應前加入時，則獲得了更強的預期大小的PCR產物(比較第9泳道和第10泳道)。這些實驗的結果總結于表1中。
表1.貯存在干固體介質上DNA的PCR反應的實驗條件
表注A＝在收集血液樣品前，將引物包在干固體介質上。B＝在將血液收集在介質上后，將引物包在干固體介質上。C＝在將血液收集在干固體介質上后，將引物包在干固體介質上，并恰好在PCR反應前加入額外的引物。D＝引物恰好在PCR反應前加入。N.A＝不能應用。++++＝強亮帶+++＝中等強亮帶++＝中等帶+＝弱帶概括地說，含有引物的干固體介質的使用顯然是可行的，它打開了一扇技術之窗，該技術使大規模的PCR分析更加實用，并且經得起較不熟練工人的檢驗，它還開辟了利用不穩定模板的潛在的、新的應用途徑。實施例3.限制性內切酶EcoRI對貯存血液的原位消化為了確定貯存在一個基于纖維素的干固體介質上的血液DNA樣品是否被限制性內切酶原位消化，并且因而適用于諸如RFLP的分析步驟，將血液樣品收集在基于纖維素的干固體介質上，用單相酚洗滌液洗滌，并用限制性內切酶EcoRI消化。在此實驗中，血液樣品在處理前貯存在干固體介質上長達18個月。3.1單相酚洗滌A.材料與方法單相酚洗滌液和其它洗滌溶液在實施例1和實施例2中進行了描述。將1.5毫升溶液A加到一種含有大約0.1毫升干的人血的干燥的干固體介質片上，該介質的大小為10毫米×10毫米，用標準的實驗室混合器混合該溶液，并且在37℃保溫30分鐘。然后通過抽吸除去溶液A，再加新鮮的溶液A。用溶液A重復處理直到血紅素顏色從干固體介質全部消失。
下一步，用溶液B洗滌樣品五次，每次兩分鐘，然后用溶液C洗滌兩次，每次也是大約兩分鐘。在每次洗滌之間，使介質樣品經過離心萃取。為此，將介質置一小微量離心管中短暫地離心，在該離心管上已刺穿了一小孔，并且套入一個較大的微量離心管中。然后介質在真空下干燥，另一方法是通過離心萃取。在加了血液和隨后干燥后，最初呈黑色的樣品在經過處理步驟后變白了。
3.2用限制性內切酶消化貯存在干固體介質上的樣品A.材料在Boehringer Manheim公司提供的緩沖液中使用限制性內切酶EcoRI。
B.方法將洗滌過的干固體介質用50微升含有過量限制性內切酶的限制性內切酶緩沖液潤濕。為了用限制性內切酶EcoRI消化，加入60單位的酶。為了保證完全潤濕，將介質在緩沖液中弄濕，用離心法除去液體，用緩沖液和酶的混合物再潤濕。在37℃消化2.5小時。
首先通過離心萃取介質，并收集萃取流體，把用限制性內切酶消化過的DNA從介質中取出，然后通過用25微升7.5M醋酸銨洗滌固體介質，接著用25微升2.5M醋酸銨洗滌。進一步取出DNA。在每一洗滌步驟中，介質經過離心萃取，以便最大限度地回收流體。將來自各洗滌步驟的流體合并至終體積約為100微升。通過加入250微升乙醇，從收集的液體中沉淀出DNA，并在風干最后的沉淀物。將沉淀物再懸浮于20微升水中，并把10微升再懸浮的沉淀物用于凝膠電泳中。
3.3凝膠電泳A.凝膠電泳條件將消化產物在Tris-醋酸鹽(其成分是0.01M Tris，0.005M醋酸鈉，0.5M EDTA，用醋酸調至pH7.8)中制備的1.5％瓊脂糖凝膠中，于50伏、8毫安電泳2小時，此后凝膠用溴化乙錠染色并照相(見圖3)。
3.4結果為了確定貯存在本發明介質上的血液樣品經較長時間后是否能被限制性內切酶消化，處理了基于纖維素的干固體介質上的樣品(血液是在19個月以前、11個月以前或兩周前加到介質上的)，然后用EcoRI消化樣品。圖3包括一張用溴化乙錠染色的模式照片，展示了一種用EcoRI消化人DNA特有的模糊圖案。因而可見，在介質上起碼貯存19個月的DNA可被限制性內切酶消化的。實施例4通過干固體介質使I型單純皰疹病毒和其他微生物失活在這些實驗中，檢測按照本發明制備的干固體介質使I型單純皰疹病毒(HSV)失活的能力。之所以選用I型單純皰疹病毒，是因為它對滅活相對地有抗性，并且是可通過血液和其他體液傳染的。
4.1單純皰疹病毒的分離A.材料與方法將由眼部損傷獲得的I型單純皰疹病毒的新近臨床分離物，在HEP 2上皮細胞和MRC-5成纖維細胞的組織培養瓶中生長至高效價(＞18空斑形成單位/毫升)，將其由瓶中收獲出來，并用超聲波處理以釋放出細胞內的病毒。通過將超聲波處理物的澄清上清液經高速高心而濃縮病毒顆粒，并重新懸浮于含有0.2M蔗糖(溶于0.02M磷酸鹽緩沖液(pH7.6)內)、10％胎牛血清和抗生素的病毒運輸培養基(VTM)中。4.2將病毒加到干固體介質上以及隨后的回收關于實驗I，將病毒的粗制品按1∶10或者在VTM中稀釋，或者在新鮮的加了肝素的血液中稀釋。將10微升稀釋液樣品成雙地在未經處理的基于纖維素的10毫米×10毫米紙片上進行試驗，并同樣在按照本發明制備的干固體介質10毫米×10毫米方片上進行試驗。在施加病毒后，方形物用精細的鑷子支承在空氣中，并在適當的時間間隔后，在1毫升含有2％胎牛血清的MRC-5維持培養基(MM)(Eagles MEM基礎培養基加上Earle氏鹽類)中通過強烈攪動，使病毒從方形物中洗脫下來。
在實驗II中，從貯存在-70℃處取出病毒儲液，按1∶4在加了檸檬酸鹽的血液中稀釋。4.2測定病毒的感染性A.材料與方法利用一種熒光病灶測定法檢驗洗脫液的感染性。將樣品按1∶100在MM中稀釋，然后聚0.2毫升稀釋液加到一48孔淺盤的一個有MRC-5成纖維細胞的孔中。在37℃保溫45分鐘后，樣品用0.5毫升MM液更換，并將淺盤置37℃在5％CO2存在下保溫過夜。然后將細胞固定，用與熒光素結合的單純皰疹病毒的抗本進行染色，并用倒置熒光顯微鏡數出熒光病灶的數目。4.3結果與討論I型單純皰疹病毒顆粒或者加到未處理過的基于纖維素的紙上，或加到按照本發明處理的基于纖維素的紙而產生出的干固體介質上。然后在經過不同的時間長度后將病毒洗脫下來。在一個實驗中，病毒貯存在VTM中，而在第二個實驗中，病毒重懸浮于血液中。實驗結果顯示于表2中。在兩個實驗中，當病毒加到干固體介質上，甚至當病毒顆粒被立即洗脫下來時，病毒的感染性被降低到檢測不到的水平，在這些條件下，抑制作用大于99.5％。對比之下，由未處理過的基于纖維素的紙(CBP)洗脫下來的血中病毒，如果被抑制的話，則僅被輕微地抑制。當實驗是用從冰凍的病毒貯液復蘇的病毒進行時，觀察到對HSV感染性有相似的抑制作用。
本發明也證明了干固體介質對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及環境中不定的微生物的生長有抑制作用。
表2.在加到未處理的基于纖維素的紙(CBP)上或加到干固體介質上之后單純皰疹病毒的感染性
實施例5為用于標準分析系統而處理本發明干固體介質的方法有或沒有用于隨后分析組分的本發明干固體介質，也可以用于診斷目的的分析物的標準檢定中，例如用于苯丙酮酸尿癥(PKU)的Guthrie試驗中以及酶測定中，諸如用于半乳糖血癥的試驗中。這兩種試驗都是對新生嬰兒常規開展。在用這類標準檢定系統分析之前，最好在分析這類分析物以前，通過加一種“轉化劑溶液”以中和含有血液樣品的干固體介質上的SDS和EDTA。
5.1干固體介質轉化劑溶液干固體介質轉化劑溶液是通過結合SDS和EDTA而起作用的。
A.材料與方法干固體介質轉化劑溶液包括下述混合物。
1.將577毫升魚精蛋白硫酸鹽(鮭精蛋白)(Sigma公司編號-4380，批號71F-0037)加到7.69毫升水中并搖動(形成75毫克/毫升)。
在透析前這批溶液在名義上是75毫克/毫升。該濃度接近于魚精蛋白的溶解度，它作為一種膠質混濁團塊緩慢地溶解。
2.透析這是一種清除性的預防措施，以保證該材料基本上是無菌的和完全溶解的。
將膠質混濁團塊放在一透析袋中，透析袋直徑約為1.5厘米，長度為2厘米至10厘米。袋的兩端被緊緊結扎。然后將該袋稱重并投入一個含有大約800毫升50mM醋酸鎂以及氯仿和一攪棒的1升燒瓶中。該材料在燒瓶中對800毫升50mM醋酸鎂和作為消毒劑存在的過量氯仿(約5毫升)透析過夜。魚精蛋白在過夜后幾乎完全溶解，產生清澈的溶液和少數明顯的小塊碎片。
該袋的重量增加
在透析以前袋重＝8.1克在4℃用氯仿飽和的液體透析20小時。
透析后的袋重＝8.67克因而，魚精蛋白的濃度現在名義上是70毫克/毫升。(假定通過袋無損失)。
3.然后將袋在底部穿刺，并收集流體，而且以4000rpm(約2000×g)離心10分鐘以除去碎片。
4. 1毫升裝的這批溶液貯存在-80℃。
5.在分析前，將大約3微升轉化劑溶液加到每一含有血液樣品的3毫米直徑的盤狀干固體介質上。5.2苯丙酮酸尿癥(PKU)的篩選步驟(Guthrie試驗)Guthrie試驗基于在生長抑制劑β-噻吩基丙氨酸存在下，苯丙氨酸對枯草桿菌生長的刺激作用。
將貯存在本發明干固體介質上的血液樣品盤狀物放在含有細菌孢子和抑制劑的瓊脂上。在37℃培養16至18小時后，盤狀物周圍菌生長的直徑是與苯丙氨酸濃度成比例的。嬰兒中高于正常水平的則顯示為苯丙酮酸尿癥。
將干固體介質用于Guthria試驗的優點是干固體介質盤狀物保留了來自樣品的蛋白質和血紅蛋白，而在盤狀物周圍留下一個較清潔的區域，并使解釋結果變得較為容易。實際上貯存在干固體介質上含苯丙氨酸的血液樣品，產生的細菌生長環始終至少象標準紙上相同樣品一樣強。
同樣地，由于足夠的細菌孢子用于Guthria試驗，而且菌長生速率是如此，因而與干固體介質最接近、由干固體介質的試劑抑制或殺死的細菌并未使解釋結果產生問題。因此，當使用干固體介質時，沒有必要在試驗前將轉化劑溶液加到盤狀物上。但是，向盤狀物加轉化劑溶液對除去可觀察到的弱的生長抑制區帶是有好處的。5.3用于半乳糖血癥的篩選半乳糖血癥的篩選需要使用活性酶以分析半乳糖和磷酸半乳糖。主要的酶β-半乳糖脫氫酶使NAD還原為NADH，這可用分光光度計法進行觀察。
這種分析被干固體介質組合物中的組分嚴重地抑制，但是通過將轉化劑溶液加到貯存在干固體介質上的血液樣品，可以基本上消除抑制。
在加轉化劑溶液后，恰好在酶分析之前，觀察到分析進行的方式與對未處理過的、基于纖維素的紙上血液樣品進行分析的方式相同。當然，與使用標準材料相比，干固體介質的優點是提供殺死病原體和保存樣品的好處。
本說明書中所有的專利顯示了與本發明有關領域普通技術人員的水平。所有的專利通過引用結合到本文中，其范圍與每一個專利和公開物通過引用具體和單獨指出的范圍相同。
在不違反所附的權利要求書的精神或范圍的情況下，對本發明能做許多變化和修改，這對本領域一普通技術人員來說是顯而易見的。
序列表(1)一般資料(i)申請者Flinders Technologies Pty. Ltd.
(ii)發明題目用于貯存和分析遺傳物質的干固體介質(iii)序列數8(iv)通信地址(A)收集人Davies Collison Cave(B)街道I Little Collins Street(C)城市墨爾本(Melbourne)(D)州維多利亞(Victoria)(E)國家澳大利亞(F)郵政編碼3000(v)計算機可讀形式(A)媒介類型Diskette(B)計算機國際商用機器公司(IBM)兼容機(C)操作系統DOS(D)軟件快速序列版本1.5(Fast SEQ Version 1.5)(vi)目前的申請資料(A)申請號碼(B)歸檔日期(C)分類(vii)先前申請資料(A)申請號US 08/480135(B)歸檔日期1995年6月7日(vii)先前申請資料(A)申請號US 08/574888(B)歸檔日期1995年12月19日(viii)代理律師/代理人信息(A)姓名Slattery，John M(B)注冊號
(C)參考/代理機構編號(ix)電信信息(A)電話+613 9254 2777(B)電傳+613 9254 2770(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設的否(iv)反義否(v)片段類型(vi)最初來源(xi)序列描述，SEQIDNO1TGACTGAGTA CAAACTGGTG GTG 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設的否(iv)反義否(v)片段類型(vi)最初來源(xi)序列描述SEQ ID NO2CTCTATGGTG GGATCATATT CA 22(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設的否(iv)反義否(v)片段類型(vi)最初來源(xi)序列描述SEQ ID NO3TGGGCTGGAA TGGAAAGGAA TGCAAAC 27(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設的否(iv)反義否(v)片段類型(vi)最初來源(xi)序列描述SEQ ID NO4TCCATTCGAT TCCATITITT TCGAGAA 27(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設的否(iv)反義否(v)片段類型(vi)最初來源(xi)序列描述SEQ ID NO5GAATGTATTA GAATGTAATG AACTTTA 27(2).SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設的否(iv)反義否(v)片段類型(vi)最初來源(xi)序列描述SEQ ID NO6TTCCATTCCA TTCCATTCCT TTCCTTT 27(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設的否
(iv)反義否(v)片段類型(vi)最初來源(xi)序列描述SEQ ID NO7GTGCTGCAGG TGTAAACTTG TACCAG 26(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)假設的否(iv)反義否(v)片段類型(vi)最初來源(xi)序列描述SEQ ID NO8CACGGATCCG GTAGCAGCGG TAGAGTTC 28
權利要求
1.一種貯存至少一個遺傳物質樣品的干固體介質，所述固體介質包括(a)一種已吸著一種包含蛋白質變性劑和螯合劑的組合物的固體基質；以及(b)一種用于所述遺傳物質樣品隨后分析的組分。
2.按照權利要求1的干固體介質，其中所述蛋白質變性劑是一種去污劑。
3.按照權利要求2的干固體介質，其中所述去污劑是一種陰離子去污劑。
4.按照權利要求1的干固體介質，其中所述用于隨后分析的組分包含一種核苷酸序列。
5.按照權利要求1的干固體介質，其中所述用于隨后分析的組分包含一種靶序列穩定劑。
6.按照權利要求1的干固體介質，其中所述用于隨后分析的組分包含PCR引物。
7.按照權利要求1的干固體介質，其中所述組合物還包含一種自由基捕集劑。
8.按照權利要求7的干固體介質，其中所述自由基捕集劑是尿酸或一種尿酸鹽。
9.按照權利要求1的干固體介質，其中所述組合物還包括一種堿。
10.按照權利要求1的干固體介質，其中還包括一種保留劑。
11.按照權利要求10的干固體介質，其中所述保留劑是一種疏水性物質。
12.按照權利要求11的干固體介質，其中所述疏水性物質是一種蠟。
13.按照權利要求10的干固體介質，其中所述的保留劑減少在含水洗滌步驟期間用于隨后分析的所述組分的損失。
14.按照權利要求1的干固體介質，其中所述的用于隨后分析的所述組分，在所述遺傳物質樣品被加到所述的干固體介質中之后，被包入所述的干固體介質。
15.按照權利要求1的干固體介質，其中所述的干固體介質是一張包含多于一種用于隨后分析的組分的卡。
16.一種用于貯存并可選進行遺傳物質樣品的隨后分析的方法，包括(a)將一個遺傳物質樣品加到干固體介質中，所述干固體介質包括一種固體基質，在其上已吸著一種組合物，該組合物包括一種蛋白質變性劑、一種螯合劑和一種用于所述遺傳物質樣品隨后分析的組分；(b)貯存所述的遺傳物質樣品；(c)可選地洗滌所述遺傳物質樣品；并且(d)可選地分析所述遺傳物質樣品。
17.按照權利要求16的方法，其中所述步驟(a)、(b)、(c)或(d)中任一步驟都是在一種自動化系統上進行的。
18.按照權利要求16的方法，其中所述的遺傳物質樣品是RNA。
19.按照權利要求18的方法，其中所述被分析的遺傳物質樣品是RNA，利用逆轉錄酶在聚合酶鏈支應中，將它轉錄成DNA。
20.按照權利要求16的方法，其中所述的遺傳物質樣品是DNA。
21.按照權利要求20的方法，其中所述的遺傳物質樣品是血液或口腔細胞。
22.按照權利要求16的方法，其中步驟(d)的所述遺傳物質樣品用聚合酶鏈反應進行分析。
23.按照權利要求16的方法，其中洗滌步驟(c)所述的遺傳物質樣品是用一種含水洗滌系統進行的。
24.按照權利要求16的方法，其中所述的干固體介質還包括一種保留劑。
25.按照權利要求24的方法，其中所述的保留劑是一種疏水性物質。
26.按照權利要求25的方法，其中所述的疏水性物質是一種蠟。
27.按照權利要求16的方法，所述的蛋白質變性劑是一種去污劑。
28.按照權利要求27的方法，其中所述的去污劑是一種陰離子去污劑。
29.按照權利要求16的方法，其中所述的組合物還包含一種堿。
30.按照權利要求16的方法，其中所述組合物還包括一種自由基捕集劑。
31.按照權利要求30的方法，其中所述的自由基捕集劑是尿酸或一種尿酸鹽。
32.按照權利要求16的方法，其中所述的用于隨后分析的組分包含一種核苷酸序列。
33.按照權利要求16的方法，其中所述的用于隨后分析的組分包含一種靶序列穩定劑。
34.按照權利要求16的方法，其中所述的用于隨后分析的組分包含一種PCR引物。
35.按照權利要求16的方法，其中步驟(c)所述的遺傳物質樣品是用一種單相酚洗滌液洗滌的。
36.按照權利要求16的方法，其中步驟(c)所述的遺傳物質樣品是用一種堿性含水洗滌液洗滌的。
37.按照權利要求16的方法，其中步驟(d)所述的遺傳物質樣品是用RFLP分析的。
38.一種用于貯存并可選地進行遺傳物質樣品的隨后分析的方法，包括(a)將一個遺傳物質樣品加到一種包括一固體基質的干固體介質中；(b)將一種包含一蛋白質變性劑、一種螯合劑和一種用于所述遺傳物質樣品隨后分析的組分配成的組合物加到所述固體基質中；(c)貯存所述的遺傳物質樣品；(d)可選地洗滌所述遺傳物質樣品；以及(e)可選地分析所述的遺傳物質樣品。
39.一種用于貯存并可選地進行遺傳物質樣品的隨后分析的方法，包括(a)將一個遺傳物質樣品加到一種包括一固體基質的干固體介質中，在該固體基質上已吸著一種包括一蛋白質變性劑和一螯合劑的組合物；(b)將一種用于所述遺傳物質樣品隨后分析的組分加到所述干固體介質中；(c)貯存所述的遺傳物質樣品；(d)可選地洗滌所述遺傳物質樣品；以及(e)可選地分析所述的遺傳物質樣品。
40.一種用于貯存并利用一種酶試驗隨后分析一血液樣品的方法，包括(a)將一個血液樣品加到一種干固體介質中，所述的干固體介質包括一種在其上已吸著一種組合物的固體基質，該組合物包括一螯合劑和一具有使蛋白質變性效應的蛋白質變性劑；(b)將所述的血液樣品貯存在所述干固體介質上；(c)中和所述蛋白質變性劑的所述的蛋白質變性作用；以及(d)利用所述的酶試驗分析所述的血液樣品。
41.按照權利要求40的方法，其中在步驟(c)中所述的蛋白質變性劑被一種轉化劑溶液所中和。
42.按照權利要求40的方法，其中所述的蛋白質變性劑是一種去污劑。
43.按照權利要求42的方法，其中所述的去污劑是一種陰離子去污劑。
44.按照權利要求40的方法，其中所述干固體介質包含一種用于隨后分析的組分。
45.按照權利要求40的方法，其中所述的組合物還包含一種自由基捕集劑。
46.按照權利要求45的方法，其中所述的自由基捕集劑是尿酸或一種尿酸鹽。
47.按照權利要求40的方法，其中所述的組合物還包含一種堿。
48.按照權利要求40的方法，其中所述的酶試驗是Guthria試驗。
49.按照權利要求40的方法，其中所述的酶試驗用于半乳糖血癥。
50.一種用于貯存并可選地進行遺傳物質樣品的隨后分析的干固體介質試劑盒，所述試劑盒包括(a)至少一個容器；以及(b)一種干固體介質包含在該容器內，所述的干固體介質包括一種固體基質，在該固體基質上已吸著了一種包括一蛋白質變性劑和一螯合劑的組合物。
51.按照權利要求50的一種試劑盒，其中所述的干固體介質還包含一種用于所述遺傳物質樣品的隨后分析的組分。
52.按照權利要求50的一種試劑盒，其中所述的干固體介質還包含一種保留劑。
53.按照權利要求50的一種試劑盒，其中干固體介質能自由地從所述的或每一個所述的容器中取出。
54.按照權利要求50的一種試劑盒，其中干固體介質固定在所述的或每一個所述的容器內。
55.按照權利要求50的一種試劑盒，其中至少一個所述的容器包括一個多孔分析板。
全文摘要
本發明提供一種干固體介質,用于以適合于隨后分析的形式貯存遺傳物質樣品(包括RNA和DNA)。本發明的干固體介質包括一種干固體基質以及一種組合物,后者包括一蛋白質變性劑和一螯合劑。干固體介質可以還包括一種組分,該組分在利用例如PCR、逆轉錄酶起始的聚合酶鏈反應、LCR、RFLP或遺傳雜交法進行遺傳物質的隨后分析中起作用。用于隨后分析的組分包括例如一種核苷酸序列(諸如引物、DNA或RNA探針)和一種靶序列穩定劑。干固體介質也可包含一種保留劑,以增強用于隨后分析組分的保留。本發明還為利用本發明的干固體介質提供多種方法。干固體介質及其使用方法特別適宜于自動化系統。
文檔編號C12Q1/68GK1192648SQ96196052
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月7日 優先權日1995年6月7日
發明者L·A·伯果尼 申請人:弗林德斯科技有限公司