專利名稱：地龍-碎栓酶制備方法
技術領域：
本發明涉及地龍-碎栓酶的制備方法。
地龍-碎栓酶是一種從蚯蚓組織中分離純化的蛋白酶，它具有較高的纖維蛋白(元)降解作用和溶栓等藥理作用，是當今最新的治療栓塞癥的藥物。在目前治療栓塞癥臨床常用的藥物主要有SK(鏈激酶)、UK(尿激酶)、TPA(組織纖溶激酶)和蛇毒抗栓酶等，但以上藥物都存在藥源少，制備工藝復雜、價格昂貴、性質不穩定等缺點。目前雖然有生產地龍-碎栓酶的技術(發明人牛勃等)，但現有的生產技術提取的地龍-碎栓酶，存在毒性不穩定，提取蛋白酶種類少(僅一種)，且工藝復雜、成本高等不足，限制了生產規模的發展和臨床應用。
本發明的目的在于提供一種藥源廣泛、制備工藝簡單、化學性質穩定、可獲得七種蛋白酶，且經濟的制備地龍-碎栓酶的方法。
本發明的目的是這樣實現的以新鮮蚯蚓為原料，經前處理除毒、細胞破碎、硫酸銨分段鹽析、CM和DEAE纖維素柱析以及sephacryl-S200或TSK分子篩過濾方法生產出層析純或電泳純地龍-碎栓酶。
下面結合附圖
對本發明作詳細介紹附圖是本發明方法的工藝流程圖。
本發明共7個主要步驟，即除毒;細胞破碎;硫酸銨分段鹽析;脫鹽;CM層析;DEAE層析;sephacryl-S200或TSK分子篩過濾得到七種層析純或電泳純地龍-碎栓酶成分。
現分述如下a 除毒在蚯蚓體內含有大量對人體有害及對隨后工藝有干擾的毒素，因此，首先要將毒素除掉。具體方法是將適量新鮮蚯蚓洗凈，用清水浸泡兩日，使之吐盡腸胃道中的污物。再將蚯蚓放入0.1M Nacl、0.1MKcl或0.1M(NH4)2SO4中，用20v電脈沖刺激使之排毒，及時更換鹽溶液3至4次，直至無肉眼可見黃色毒液分泌為止。
b 細胞破碎將上述步驟所獲得的無毒蚯蚓用組織搗碎機或超聲細胞破碎器進行勻漿，再用高速冷凍離心機離心(4℃，15，000rpm，15分鐘)，經過濾，除去沉淀，收集上清液。
c 硫酸銨鹽析將上述步驟上清液用硫酸銨分段法鹽析。樣品為0.05MPBS溶劑的溶液，含0.01%SDS、PH7.4，鹽析溫度4℃，鹽析時間18小時;棄25%飽和度時的沉淀和65%飽和度時的上清部分，收集65%飽和度時沉淀蛋白，即有纖溶酶活性部分，離心速度為15，000rpm。
d 脫鹽將上述步驟所得有活性鹽析部分用超濾法或透析法常規除鹽，超濾或透析緩沖液為0.05M的PBS。獲得粗提取液。
e CM陽離子交換層析將上述步驟所得粗提取液用0.045M的醋酸鹽緩沖液平衡或稀釋，使樣品PH調至PH4.5。用0.045M醋酸緩沖液平衡CM柱。加樣后在0-0.3MNacl范圍內進行連續梯度洗脫，棄無活性洗脫峰，收集活性峰。
f DEAE陽離子交換層析將上述步驟所得活性部分，分別用PH7.4的PBS(0.05M)緩沖液平衡，調樣品PH為7.4，上樣后進行連續梯度洗脫。洗脫條件為0.05PBS;PH7.4;0-1MNacl;0.5MOL/分洗脫速度。收集0.10-0.18M/LNacl范圍的活性峰洗脫液。
g sephacryl-S200或TSK分子篩過濾將上述步驟所獲得有纖溶酶活性樣品進行sephacryl-S200或TSK分子篩過濾，(洗脫液為PH7.4PBS，流速為0.81，mol/分)即可得到7種層析純或電泳純DL-碎栓酶為15，000、26，900±300、27，000、27，900±300、32，000±300、33，000、70，000道爾頓的蛋白酶。
用本發明的方法，從蚯蚓體組織中提取DL-碎栓酶，生產工藝簡單，產量高成本低，化學性質穩定，提取蛋白酶多(7種)，純度高。
權利要求
一種地龍-碎栓酶的制備方法，其特征在于利用蚯蚓為原料，經前處理除毒，硫酸銨鹽析，CM陽離子層析和DEAE陰離子層析和sephacry1-S200或TSK分子篩過濾方法生產出七種層析純或電泳純地龍--碎栓酶。其過程為a.將洗凈蚯蚓放入0.31MNacl、0.31Mkcl或0.01M(NH4)2SO4溶液中用20V電脈沖剌激使之排毒，及時更換溶液3至4次，直至無肉眼可見黃色分泌物排出為止。b.將a所得除毒蚯蚓經細胞破碎后離心取上清部分；用硫酸銨分段鹽析，樣品為0.05MPBS溶劑的溶液含0.01%SDS、PH7.4，鹽析溫度4℃，鹽析時間18小時；棄25%飽和度時的沉淀部分和65%飽和度時的上清部分，收集65%飽和度時的沉淀蛋白，脫鹽后獲得粗提取液。c.將b所獲得粗提取液用0.045M的醋酸鹽緩沖液平衡式稀釋；調樣品PH為4.5，用0.045M醋酸緩沖液平衡CM柱，加樣后在0--0.3MNacl范圍內連續梯度洗脫，收集活性脫峰。d.將c所獲得活性洗脫峰，分別用PH7.4的PBS(0.05M)緩沖液平衡，調樣品PH為7.4，上樣后進行連續洗脫、洗脫條件為0.05MPBS，PH7.4，0--1MNacl，0.5mol/分脫洗速度。收集0.10-0.18M/1Nacl范圍的活性峰洗脫液。e.將d所得0.035M--0.08M范圍內的活性峰洗脫液進行sephacry1--S200或TSK分子篩過濾，洗脫液為PH7.4PBS，流速為0.8Lmol/分。即可得到7種層析純或電泳純地龍--碎栓酶，分子量為1，5000、26900±300、27，000、27900±300、32000±300、33000、70，000道爾頓的蛋白酶。
全文摘要
本發明方法涉及一種從蚯蚓體內制備地龍-碎栓酶的方法。本發明利用新鮮蚯蚓為原料，經鹽電刺激除毒、硫酸銨鹽析、CM陽離子交換層析、DEAE陽離子交換層析、sephacryl—S200或TSK分子篩過濾，得到7種高純度地龍-碎栓酶。本發明生產方法簡單，成本低，產量高，產品化學性質穩定，純度高。
文檔編號C12N9/64GK1080956SQ9310468
公開日1994年1月19日 申請日期1993年4月24日 優先權日1993年4月24日
發明者牛勃, 程牛亮, 鄭國平, 單鴻仁 申請人:北京市首都生物技術研究所