一種稻曲病菌菌種長期保存的方法
【專利摘要】本發明公開了一種稻曲病菌菌種長期保存的方法。該方法的技術要點是利用稻曲病菌薄壁分生孢子在水中生存期長的生活特性，用純凈的薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態。該方法的技術步驟如下：1）培養制備含薄壁分生孢子的培養產物；2）薄壁分生孢子的純凈處理；3）適合貯存的孢子液的調配；4）孢子液裝管存貯；5）菌種復活培養。本發明的優點是：菌種保存時長超過4年；無需每年轉管培養的護理工作；減小菌種變異機率；盛裝菌種的管具體積小，存放菌種需要空間少，便于管理。
【專利說明】一種稻曲病菌菌種長期保存的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及農業技術和生物技術。具體是一種稻曲病菌菌種長期保存的方法。
【背景技術】
[0002]稻曲病是我國水稻生產的一個重大病害。該病害的科學有效防治有賴于該病害的基礎研究，而該病害病原菌菌種的有效保存則是許多基礎研究的基礎工作。特別是稻曲病菌的分離技術難度較大，高效長期保存菌種的方法將為研究工作提供很大的便利。至今，稻曲病菌菌種的保存往往采用試管斜面培養基生長的菌絲體形態存放，這樣的保存方法雖然簡單有效，但也存在一些弊病，主要是保存時間較短，要達到長期保存菌種的目的，每年需要I?2次的轉管培養護理工作，而反復的轉管培養很容易導致該病菌菌種產生變異；而且在病菌菌株數量較多時，護理工作量大，耗時費力。另外，以這種方式保存的菌絲體，移植恢復生長所需時間較長，一般要耗時7?10天。
[0003]在實驗室內，很容易培養獲得稻曲病菌的薄壁分生孢子。已經知道，該薄壁分生孢子在瓊脂類培養基平板上很容易萌發生長，而發明人發現，該孢子在水中一般不萌發，但這不萌發的孢子并沒有失去萌發活力，當將這些在水中存放的孢子轉到瓊脂平板上后，孢子能恢復萌發，生長發育成正常新一代菌體；該孢子可以在水中保持多年仍具有萌發活力。稻曲病菌薄壁分生孢子的這種生活特性，在菌種保存中有應用價值，但至今還沒有利用薄壁分生孢子保存稻曲病菌菌種的實踐應用和配套方法。
[0004]本
【發明內容】
[0005]本發明的目的提供一種稻曲病菌菌種長期保存的方法。
[0006]本發明解決上述技術問題的技術方案如下:
[0007]—種稻曲病菌菌種長期保存的方法采用較純凈的稻曲病菌薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態，以下簡稱稻曲病菌薄壁分生孢子為薄壁分生孢子，長期保存方法的步驟如下:
[0008]1.培養含薄壁分生孢子的培養產物:
[0009]采用二期培養方法或三期培養方法，用稻曲病菌菌絲體在液體培養基中通過振蕩培養方式，培養薄壁分生孢子，具體用如下方法:
[0010]用半量的PSA培養基，該培養基成分為:馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g和水1000ml，培養該病菌獲得稻曲病菌菌落；挑取小塊稻曲病菌菌落移入半量的PS培養液，該培養液成分為:馬鈴薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振蕩培養器內，在轉速為150轉/分和溫度為28°C條件下振蕩培養，7天左右培養液內產生大量的薄壁分生孢子；
[0011]2.薄壁分生孢子的純凈處理:
[0012]將上述步驟I)獲得的薄壁分生孢子進行純凈化處理，處理方法如下:
[0013]A.去除菌絲體:用2層滅菌紗布將振蕩培養獲得的培養產物過濾，菌絲體將濾集在紗布上，收集過濾液，能獲得沒有菌絲體的薄壁分生孢子液；
[0014]B.去除培養基組分和代謝產物:將去除菌絲體的薄壁分生孢子液進行離心沉淀處理，在6000轉/分的轉速離心15分鐘，能將薄壁分生孢子沉淀出來。離心完成后傾棄上清液，留下沉淀薄壁分生孢子；
[0015]C.進一步凈化:取無菌水將沉淀薄壁分生孢子重新懸浮分散，攪動洗滌，然后再離心沉淀一次，傾棄上清液后，可獲得純凈的薄壁分生孢子；
[0016]3.適合貯存的薄壁分生孢子液的調配:
[0017]薄壁分生孢子濃度的調配方法如下:
[0018]用適量無菌水將上述步驟2)獲得純凈的薄壁分生孢子沉淀再懸浮分散成孢子液，用移液器將這薄壁分生孢子液由離心管轉移到較大的無菌容器小三角瓶或小燒杯內，使用血球計數板進行孢子數量檢測，用無菌水將薄壁分生孢子液調配至濃度為IO6個孢子/ml左右；
[0019]4.薄壁分生孢子液裝管存貯:用移液器將調配好的薄壁分生孢子液分裝到管具5ml冷凍管內，回蓋密封后,置于23?25°C下存放；
[0020]5.稻曲病菌菌種復活培養:需要使用菌種時，取出貯存薄壁分生孢子液的管具，充分振蕩使薄壁分生孢子懸浮并分散均勻，用微量移液器取10?20 μ I薄壁分生孢子液轉移到半量的PSA培養基上，在溫度為28°C條件下培養，5天后可長出新的稻曲病菌菌落。
[0021]本發明的優點是:
[0022]1.保存時間長，菌種存活期超過4年。
[0023]2.無需每年轉管培養的護理工作。
[0024]3.減小菌種變異機率。`
[0025]4.盛裝菌種的管具體積小，貯存菌種需要空間少，便于管理。
【具體實施方式】:
[0026]下面結合實施例對本發明作進一步描述。
[0027]實施例1
[0028]采用本發明一種稻曲病菌菌種長期保存的方法，以薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態，保存稻曲病菌菌株Uv-34，按如下步驟實施操作:
[0029]I)培養含薄壁分生孢子的培養產物:
[0030]采用二期培養方法，通過振蕩培養獲得含有大量的薄壁分生孢子的培養產物，具體如下；用半量的PSA培養基，該培養基成分為:馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g和水1000ml，培養該病菌獲得稻曲病菌菌落；挑取小塊稻曲病菌菌落移入半量的PS培養液，該培養液成分為:馬鈴薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振蕩培養器內，在轉速為150轉/分和溫度為28°C條件下振蕩培養，一般7天左右培養液內產生大量的薄壁分生孢子。
[0031]2)薄壁分生孢子的純凈處理:
[0032]進行菌種保存用的薄壁分生孢子必須要處于純凈狀態，需要將上述步驟I)獲得的薄壁分生孢子進行純凈化處理，處理方法如下:
[0033]A.去除菌絲體:用2層滅菌紗布將振蕩培養獲得的培養產物過濾，菌絲體將濾集在紗布上，收集過濾液，能獲得沒有菌絲體的薄壁分生孢子液。
[0034]B.去除培養基組分和代謝產物:將去除菌絲體的薄壁分生孢子液進行離心沉淀處理，在6000轉/分的轉速離心15分鐘。離心完成后傾棄上清液，留下沉淀薄壁分生孢子，即能達到去除培養基組分和菌體生長的代謝產物的目的。
[0035]C.進一步凈化:取無菌水將沉淀薄壁分生孢子重新懸浮分散，攪動洗滌，然后再離心沉淀一次，傾棄上清液后，可獲得純凈的薄壁分生孢子。
[0036]3)適合貯存的薄壁分生孢子液的調配:
[0037]貯存狀態的薄壁分生孢子，以濃度約為IO6個孢子/ml的狀態最適宜。薄壁分生孢子濃度的調配方法如下:
[0038]用適量無菌水將上述步驟2)獲得純凈的薄壁分生孢子沉淀再懸浮分散成孢子液，用移液器將這薄壁分生孢子液由離心管轉移到較大的無菌容器，如小三角瓶或小燒杯內，使用血球計數板進行孢子數量檢測，用無菌水將薄壁分生孢子液調配至濃度為IO6個孢子/ml ο
[0039]4)薄壁分生孢子液裝管存貯:
[0040]將上步驟調配好的孢子液分裝到5ml冷凍管內，回蓋密封后，于2008年8月20日開始，置于23?25°C條件下貯存；
[0041]5)稻曲病菌菌種復活培養:于2013年6月25日取出貯存了 4年零10個月后的薄壁分生孢子液，充分振蕩使薄壁分生孢子懸浮并分散均勻，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液轉移到半量的PSA培養基上，在溫度為28°C條件下培養，5天后培養基上長出正常的稻曲病菌小菌落。
[0042]實施例2.[0043]采用本發明一種稻曲病菌菌種長期保存的方法，以薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態，保存稻曲病菌菌株Uv-105，按實施例1的步驟I)至步驟4)操作實施；于2008年12月9日開始，置于23?25°C條件下存放；保存4年零6個月后，按實施例1的步驟5)操作實施，于2013年6月25日取出貯存了 4年零10個月后的薄壁分生孢子液，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液轉移到半量的PSA培養基上，在溫度為28°C條件下培養，5天后培養基上長出正常的稻曲病菌小菌落。
[0044]實施例3
[0045]采用本發明一種稻曲病菌菌種長期保存的方法，以薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態，保存稻曲病菌菌株Uv-110，按實施例1的步驟I)至步驟4)操作實施；于2008年12月9日開始，置于23?25°C條件下存放；保存4年零6個月后，按實施例1的步驟5)操作實施，于2013年6月25日取出貯存了 4年零10個月后的薄壁分生孢子液，用微量移液器取20 μ I薄壁分生孢子液轉移到半量的PSA培養基上，在溫度為28°C條件下培養，5天后培養基上長出正常的稻曲病菌小菌落。
【權利要求】
1.一種稻曲病菌菌種長期保存的方法，其特征在于，采用較純凈的稻曲病菌薄壁分生孢子作為菌種的存貯形態，以下簡稱稻曲病菌薄壁分生孢子為薄壁分生孢子，長期保存方法的步驟如下: 1)培養含薄壁分生孢子的培養產物: 采用二期培養方法或三期培養方法，用稻曲病菌菌絲體在液體培養基中通過振蕩培養方式，培養薄壁分生孢子，具體用如下方法: 用半量的PSA培養基，該培養基成分為:馬鈴薯100g、蔗糖10g、瓊脂20g和水1000ml，培養該病菌獲得稻曲病菌菌落；挑取小塊稻曲病菌菌落移入半量的PS培養液，該培養液成分為:馬鈴薯IOOg ;蔗糖IOg ;水1000ml，置于振蕩培養器內，在轉速為150轉/分和溫度為28°C條件下振蕩培養，7天左右培養液內產生大量的薄壁分生孢子； 2)薄壁分生孢子的純凈處理: 將上述步驟I)獲得的薄壁分生孢子進行純凈化處理，處理方法如下: A.去除菌絲體:用2層滅菌紗布將振蕩培養獲得的培養產物過濾，菌絲體將濾集在紗布上，收集過濾液，能獲得沒有菌絲體的薄壁分生孢子液； B.去除培養基組分和代謝產物:將去除菌絲體的薄壁分生孢子液進行離心沉淀處理，在6000轉/分的轉速離心15分鐘，能將薄壁分生孢子沉淀出來。離心完成后傾棄上清液，留下沉淀薄壁分生孢子； C.進一步凈化:取無菌水將沉淀薄壁分生孢子重新懸浮分散，攪動洗滌，然后再離心沉淀一次，傾棄上清液后，獲得`純凈的薄壁分生孢子； 3)適合貯存的薄壁分生孢子液的調配: 薄壁分生孢子濃度的調配方法如下: 用適量無菌水將上述步驟2)獲得純凈的薄壁分生孢子沉淀再懸浮分散成孢子液，用移液器將這薄壁分生孢子液由離心管轉移到較大的無菌容器小三角瓶或小燒杯內，使用血球計數板進行孢子數量檢測，用無菌水將薄壁分生孢子液調配至濃度為IO6個孢子/ml左右； 4)薄壁分生孢子液裝管存貯:用移液器將調配好的薄壁分生孢子液分裝到管具5ml冷凍管內，回蓋密封后，置于23?25°C下存放； 5)稻曲病菌菌種復活培養:需要使用菌種時，取出貯存薄壁分生孢子液的管具，充分振蕩使薄壁分生孢子懸浮并分散均勻，用微量移液器取10?20 μ I薄壁分生孢子液轉移到半量的PSA培養基上，在溫度為28°C條件下培養，5天后長出新的稻曲病菌菌落。
【文檔編號】C12N1/04GK103436448SQ201310363335
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】張君成, 覃茜 申請人:廣西大學