本發明涉及(ji)魚類繁殖，具體涉及(ji)一種提(ti)高(gao)錦(jin)鯉孵化效率的保(bao)存(cun)方法(fa)。

背景技術：

1、錦鯉(li)(li)（ cyprinus?carpio）是一(yi)種(zhong)高檔觀(guan)賞魚，有“水(shui)中活(huo)寶石”的美稱。錦鯉(li)(li)色彩(cai)鮮艷、變化多(duo)端，游(you)姿(zi)飄(piao)逸，觀(guan)賞價值(zhi)高，被稱作(zuo)“會游(you)泳的藝術品”。在中國，錦鯉(li)(li)被視為(wei)和平(ping)、友誼的象征，它(ta)不僅給人(ren)(ren)以美的享受(shou)(shou)，還寓意吉祥歡樂、繁榮幸(xing)福(fu)，中國自古(gu)也(ye)有“鯉(li)(li)魚跳龍門”之說(shuo)，寓意人(ren)(ren)飛黃騰達，所以深受(shou)(shou)人(ren)(ren)們喜愛，所以被很多(duo)人(ren)(ren)飼養于庭院里(li)或者(zhe)水(shui)族(zu)箱中，是十分受(shou)(shou)歡迎的魚類(lei)(lei)寵(chong)物。錦鯉(li)(li)作(zuo)為(wei)一(yi)種(zhong)魚類(lei)(lei)資源，具有多(duo)種(zhong)品種(zhong)和亞種(zhong)。

2、冷凍保(bao)存(cun)(cun)錦鯉精液可以保(bao)存(cun)(cun)不(bu)同品種(zhong)的(de)遺傳信(xin)息，防止品種(zhong)的(de)丟失和(he)基因多樣性的(de)減(jian)少，這(zhe)有助于(yu)維護錦鯉種(zhong)群的(de)健康和(he)外(wai)表。由于(yu)物種(zhong)的(de)差異，現有技術(shu)中(zhong)(zhong)不(bu)同的(de)冷凍液中(zhong)(zhong)稀釋劑、保(bao)護劑，對(dui)于(yu)不(bu)同的(de)魚的(de)效果存(cun)(cun)在(zai)天差地別，例如《“圓(yuan)口(kou)銅魚精子(zi)冷凍保(bao)存(cun)(cun)技術(shu)研究”，劉光(guang)霞，上海(hai)海(hai)洋大學(xue)碩士學(xue)位論文》中(zhong)(zhong)采用了3種(zhong)保(bao)護劑dmf、dmso和(he)meth對(dui)圓(yuan)口(kou)銅魚進行冷凍保(bao)存(cun)(cun)，結果是?dmso?組的(de)精子(zi)活率顯著低于(yu)?meth、dmf?組。但是在(zai)《“斑(ban)鱖(gui)精液超低溫冷凍保(bao)存(cun)(cun)及(ji)其(qi)效果分析”，周磊等，中(zhong)(zhong)國水產科學(xue)?2014?年?3?月》中(zhong)(zhong)dmso對(dui)斑(ban)鱖(gui)精子(zi)凍后存(cun)(cun)活率明顯優于(yu)dmf。

3、目前有(you)(you)方(fang)(fang)案針對鯉(li)科精子(zi)凍(dong)存(cun)(cun)(cun)，但沒有(you)(you)專(zhuan)門針對錦鯉(li)精子(zi)的(de)冷(leng)凍(dong)保(bao)存(cun)(cun)(cun)方(fang)(fang)案，使用針對其他鯉(li)科魚(yu)類的(de)方(fang)(fang)案凍(dong)存(cun)(cun)(cun)錦鯉(li)精子(zi)效(xiao)果(guo)并不理想，使用魚(yu)類精子(zi)超低溫冷(leng)凍(dong)保(bao)存(cun)(cun)(cun)簡易方(fang)(fang)法(fa)（專(zhuan)利號cn101088511a）凍(dong)存(cun)(cun)(cun)錦鯉(li)精子(zi)14天后，精子(zi)存(cun)(cun)(cun)活率只有(you)(you)12.41%，因此為(wei)了實現錦鯉(li)精子(zi)的(de)冷(leng)凍(dong)保(bao)存(cun)(cun)(cun)，有(you)(you)必(bi)要開(kai)發新的(de)冷(leng)凍(dong)保(bao)存(cun)(cun)(cun)液和冷(leng)凍(dong)保(bao)存(cun)(cun)(cun)方(fang)(fang)案。

技術實現思路

1、本(ben)發明(ming)目的(de)在于針對凍(dong)存(cun)(cun)后(hou)的(de)錦鯉精子存(cun)(cun)活率、受精及孵(fu)化效率低的(de)問題，提供一種(zhong)適用于錦鯉精子的(de)冷凍(dong)保存(cun)(cun)液。

2、本發明另一目的在于提(ti)(ti)供一種(zhong)提(ti)(ti)高錦鯉精(jing)子(zi)孵化率的方法。采用上述(shu)冷凍保存液結合冷凍保存步驟，有效提(ti)(ti)高了錦鯉精(jing)子(zi)冷凍保存后(hou)的精(jing)子(zi)存活(huo)率，以及復蘇后(hou)的精(jing)子(zi)的受精(jing)率和(he)孵化率。

3、本(ben)發明目的通過如下技(ji)術方案實現(xian)：

4、一(yi)種適(shi)用于(yu)錦鯉精子的(de)冷凍保(bao)存液(ye)，其(qi)特(te)征(zheng)在(zai)于(yu)：所述冷凍保(bao)存液(ye)是以稀(xi)釋液(ye)、滲(shen)透(tou)(tou)性(xing)保(bao)護劑(ji)和(he)非(fei)滲(shen)透(tou)(tou)性(xing)添加(jia)劑(ji)組成，其(qi)中稀(xi)釋液(ye)為(wei)(wei)d17，非(fei)滲(shen)透(tou)(tou)保(bao)護劑(ji)為(wei)(wei)二甲亞砜（dmso），所述非(fei)滲(shen)透(tou)(tou)添加(jia)劑(ji)為(wei)(wei)蔗糖和(he)海藻糖組成。

5、進一(yi)步，所述冷(leng)凍保存液(ye)中dmso為(wei)8~12%，非滲透添(tian)加(jia)劑中蔗(zhe)糖為(wei)3~4%，海藻糖為(wei)0.8~1.2%，其余為(wei)稀釋液(ye)d17。

6、進一(yi)步，所述稀(xi)釋(shi)液d17具(ju)體是由nacl、kcl和葡萄(tao)糖和超(chao)純(chun)水組成，1l稀(xi)釋(shi)液中含有9gnacl、5gkcl和15g葡萄(tao)糖，其余(yu)為(wei)超(chao)純(chun)水。

7、進一步，冷凍(dong)保存(cun)液中各組分濃度為(wei)8.1g/l?nacl、0.45g/l?kcl和13.5g/l葡萄糖，80~120ml/l?dmso、3~4g/l蔗糖、0.8~1.2g/l海藻糖。

8、一種(zhong)提高錦(jin)(jin)鯉(li)精子(zi)冷(leng)凍(dong)保(bao)存后的(de)孵化率的(de)方法，包(bao)括錦(jin)(jin)鯉(li)精子(zi)的(de)冷(leng)凍(dong)保(bao)存，其(qi)特征在于：所述冷(leng)凍(dong)保(bao)存包(bao)括配(pei)制冷(leng)凍(dong)保(bao)存液、精子(zi)采集、稀釋分裝和降(jiang)溫冷(leng)凍(dong)步(bu)驟，其(qi)中(zhong)配(pei)制冷(leng)凍(dong)保(bao)存液是(shi)按(an)照1l冷(leng)凍(dong)保(bao)存液中(zhong)含有8.1gnacl、0.45g?kcl、13.5g葡(pu)萄糖，80~120mldmso、3~4g蔗糖和0.8~1.2g海(hai)藻糖，其(qi)余為超純水組成。

9、進一(yi)步(bu)，所(suo)述稀(xi)釋分(fen)裝(zhuang)是(shi)使(shi)用(yong)移(yi)液槍將精液吸取與冷凍(dong)保(bao)(bao)存液混合稀(xi)釋，分(fen)裝(zhuang)加(jia)入冷凍(dong)保(bao)(bao)存管中(zhong)，具體是(shi)精液與冷凍(dong)保(bao)(bao)存也按照體積比為(wei)1：8~10進行混合稀(xi)釋，按照45~55μl為(wei)單位進行分(fen)裝(zhuang)。

10、進一步(bu)，所(suo)述降(jiang)溫冷凍是(shi)將分(fen)裝了稀釋精液(ye)的冷凍保存(cun)管在4℃下平衡5min，然(ran)后在液(ye)氮上方約(yue)10cm處平衡15min左右，最(zui)后置于液(ye)氮中保存(cun)。

11、一種(zhong)提高錦鯉(li)精子冷凍保存后的孵化(hua)率的方法，包(bao)括錦鯉(li)精子的冷凍保存，其特征在(zai)于，包(bao)括如下步驟：

12、（1）配制(zhi)冷凍(dong)保(bao)(bao)存(cun)液：以配方為8.1g/lnacl，0.45g/lkcl，13.5g/l葡(pu)萄糖(tang)(tang)，3g/l蔗(zhe)糖(tang)(tang)，1g/l海藻糖(tang)(tang)，100ml/ldmso，稱(cheng)取nacl、kcl、葡(pu)萄糖(tang)(tang)、蔗(zhe)糖(tang)(tang)、海藻糖(tang)(tang)和dmso加入超純水(shui)，震蕩(dang)混合均勻后(hou)，與37℃水(shui)浴30min，得冷凍(dong)保(bao)(bao)存(cun)液，置于4℃下(xia)保(bao)(bao)存(cun)備用；

13、（2）精(jing)子采集：在容器中(zhong)倒入1l曝氣水，中(zhong)加入5mlms-222魚(yu)(yu)用(yong)安(an)定劑，將一條錦鯉進行麻醉處理，?將魚(yu)(yu)體表面以及(ji)泄殖孔附近水分擦干，用(yong)濕布包裹魚(yu)(yu)頭(tou)部，將魚(yu)(yu)尾與魚(yu)(yu)頭(tou)握(wo)住，將泄殖孔方向朝下，將200?μl移(yi)(yi)液(ye)槍(qiang)槍(qiang)頭(tou)懸于(yu)泄殖孔上，用(yong)手(shou)沿著魚(yu)(yu)腹部到泄殖孔方向按壓，使精(jing)液(ye)流出，使用(yong)移(yi)(yi)液(ye)槍(qiang)吸取精(jing)液(ye)，移(yi)(yi)至1.5ml無菌管(guan)中(zhong)；

14、（3）稀(xi)釋(shi)分(fen)裝：使用移液(ye)槍將精液(ye)吸取與冷凍(dong)保存液(ye)混合稀(xi)釋(shi)，分(fen)裝加入冷凍(dong)保存管中(zhong)，具(ju)體是精液(ye)與冷凍(dong)保存也按(an)照體積比為1：8~10進行混合稀(xi)釋(shi)，按(an)照45~55μl為單位進行分(fen)裝；

15、（4）降溫冷凍：將步驟(zou)（3）中的冷凍保存(cun)管在(zai)(zai)4℃下平衡5min，然后(hou)在(zai)(zai)液(ye)氮上方10cm處平衡15min，最后(hou)置于液(ye)氮中保存(cun)。

16、本發明具(ju)有(you)如(ru)下技術效果：

17、本發明中通過配制出與(yu)錦(jin)(jin)鯉(li)(li)(li)(li)精(jing)(jing)(jing)子適配度極高(gao)的(de)(de)保(bao)存液，再結合合適的(de)(de)具體步驟，提(ti)高(gao)了(le)(le)錦(jin)(jin)鯉(li)(li)(li)(li)精(jing)(jing)(jing)子冷凍(dong)保(bao)存后的(de)(de)存活(huo)率(lv)(lv)(lv)，達(da)到48.62±5.62%，同時還能(neng)保(bao)證冷凍(dong)復蘇后的(de)(de)錦(jin)(jin)鯉(li)(li)(li)(li)精(jing)(jing)(jing)子具有較高(gao)受精(jing)(jing)(jing)率(lv)(lv)(lv)，冷凍(dong)14天(tian)和210天(tian)后的(de)(de)精(jing)(jing)(jing)子受精(jing)(jing)(jing)率(lv)(lv)(lv)達(da)到63.03%和55.09%，受精(jing)(jing)(jing)后的(de)(de)孵化(hua)率(lv)(lv)(lv)分別高(gao)達(da)55.15%和45.34%，保(bao)持在(zai)與(yu)鮮精(jing)(jing)(jing)（孵化(hua)率(lv)(lv)(lv)為62.34%）極為接近的(de)(de)孵化(hua)水平。該方(fang)法有效(xiao)提(ti)高(gao)了(le)(le)錦(jin)(jin)鯉(li)(li)(li)(li)精(jing)(jing)(jing)子的(de)(de)存活(huo)率(lv)(lv)(lv)，受精(jing)(jing)(jing)率(lv)(lv)(lv)和孵化(hua)率(lv)(lv)(lv)，有效(xiao)保(bao)證了(le)(le)不同品種(zhong)(zhong)的(de)(de)錦(jin)(jin)鯉(li)(li)(li)(li)育(yu)苗和魚種(zhong)(zhong)的(de)(de)高(gao)效(xiao)繁(fan)殖(zhi)，達(da)到了(le)(le)錦(jin)(jin)鯉(li)(li)(li)(li)品種(zhong)(zhong)的(de)(de)延續。

1.一種適用于錦鯉精(jing)子的冷凍保(bao)存液(ye)，其特征在于：所(suo)(suo)述冷凍保(bao)存液(ye)是以稀(xi)釋(shi)液(ye)、滲(shen)透(tou)性保(bao)護劑(ji)(ji)和非(fei)滲(shen)透(tou)性添加劑(ji)(ji)組成，其中(zhong)稀(xi)釋(shi)液(ye)為d17，非(fei)滲(shen)透(tou)保(bao)護劑(ji)(ji)為二甲亞砜（dmso），所(suo)(suo)述非(fei)滲(shen)透(tou)添加劑(ji)(ji)為蔗(zhe)糖(tang)和海藻糖(tang)組成。

2.如權(quan)利要求(qiu)1所述(shu)的一種適用于(yu)錦鯉精子(zi)的冷凍保存液(ye)(ye)，其(qi)特征在于(yu)：所述(shu)冷凍保存液(ye)(ye)中(zhong)dmso質(zhi)量(liang)占比為(wei)(wei)8~12%，非滲透添(tian)加劑(ji)中(zhong)蔗(zhe)糖(tang)(tang)質(zhi)量(liang)占比為(wei)(wei)3~4%，海藻糖(tang)(tang)質(zhi)量(liang)占比為(wei)(wei)0.8~1.5%，其(qi)余為(wei)(wei)稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)d17，所述(shu)稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)d17具體是由nacl、kcl和葡萄糖(tang)(tang)和超純水組成，1l稀(xi)釋(shi)液(ye)(ye)中(zhong)含有(you)9gnacl、5gkcl和15g葡萄糖(tang)(tang)，其(qi)余為(wei)(wei)超純水。

3.一種適用于錦(jin)鯉精(jing)子冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)存(cun)方法，包(bao)括(kuo)錦(jin)鯉精(jing)子的冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)存(cun)，其(qi)特征在于：所述冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)存(cun)包(bao)括(kuo)配制冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)存(cun)液(ye)、精(jing)子采集(ji)、稀釋分裝和降溫(wen)冷(leng)凍(dong)(dong)步驟，其(qi)中(zhong)配制冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)存(cun)液(ye)是(shi)按照1l冷(leng)凍(dong)(dong)保(bao)存(cun)液(ye)中(zhong)含有8.1gnacl、0.45g?kcl、13.5g葡萄糖，80~120ml?dmso、3~4g蔗糖和0.8~1.2g海藻糖，其(qi)余(yu)為超(chao)純水(shui)組成(cheng)。

4.如(ru)權利要求3所述的一種適(shi)用于(yu)錦鯉精(jing)子(zi)冷(leng)凍(dong)(dong)保存(cun)方法，其特征在于(yu)：所述稀(xi)(xi)釋(shi)分裝是(shi)使用移液(ye)槍將精(jing)液(ye)吸(xi)取與(yu)冷(leng)凍(dong)(dong)保存(cun)液(ye)混(hun)合稀(xi)(xi)釋(shi)，分裝加入冷(leng)凍(dong)(dong)保存(cun)管中，具(ju)體是(shi)精(jing)液(ye)與(yu)冷(leng)凍(dong)(dong)保存(cun)也按照(zhao)體積(ji)比為(wei)1：8~10進(jin)行混(hun)合稀(xi)(xi)釋(shi)，按照(zhao)45~55?μl為(wei)單位進(jin)行分裝。

5.如權利要求3或4所述的一種適(shi)用于(yu)錦(jin)鯉精(jing)子冷凍(dong)保存方法，其特(te)征在(zai)于(yu)：所述降溫(wen)冷凍(dong)是將分裝了稀釋精(jing)液的冷凍(dong)保存管在(zai)4℃下平衡5min，然后在(zai)液氮上方約(yue)10cm處平衡15min左右，最后置于(yu)液氮中保存。

6.一種適(shi)用(yong)于錦鯉(li)精子冷凍(dong)保存方法，其特征在(zai)于，包括如下(xia)步驟：